标准号：SN/T 5098-2019
标准名称：国境口岸人冠状病毒NL63和HKU1实时荧光RT-PCR检测方法
英文名称：Detection method for human coronavirus Nl63 and human coronavirus HKUlby fluorescence RT-PCR at frontier ports
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-03-01
标准大小：3131K
标准介绍：本标准规定了国境口岸入出境人员携带人冠状病毒NL63和HKU1的实时荧光RT-PCR检测方法，包括标本的采集、运输、保存和处理，检测、结果判定和报告。
本标准适用于国境口岸入出境人员携带人冠状病毒NL63和HKU1的实时荧光RT-PCR检测方法
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
中华人民共和国卫生部令第45号可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定
人间传染的病原微生物菌(毒)种保藏机构管理办法

ICS11.020
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5098—2019
国境口岸人冠状病毒NL63和HKU1实时荧光RT-PCR检测方法
Detection method for human coronavirus NL63 and human coronavirusHKU1by fluorescence RT-PCR at frontier ports2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
本标准根据GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口SN/T5098—2019
本标准起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国成都海关、中国检验检疫科学研究院
本标准主要起草人：刘胜牙、朱玉兰、石莹、胡孔新、谢聪贤、徐云庆、张树平、董瑞玲、李东晓、刘君1范围
国境口岸人冠状病毒NL63和HKU1实时荧光RT-PCR检测方法
SN/T5098—2019
本标准规定了国境口岸人出境人员携带人冠状病毒NL63和HKU1的实时荧光RT-PCR检测方法，包括标本的采集、运输、保存和处理，检测、结果判定和报告。本标准适用于国境口岸人出境人员携带人冠状病毒NL63和HKU1的实时荧光RT-PCR检测方法。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则中华人民共和国卫生部令第45号可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定
人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
人冠状病毒NL63humancoronavirusNL63，HCoV-NL63属于冠状病毒科冠状病毒属α类冠状病毒。HCoV-NL63在形态上与其它冠状病毒属的病毒致，颗粒呈球形，直径在120～160nm。HCoV-NL63属于单股正链RNA病毒，其基因组有27，533个核苷酸；基因组5端2/3的区域由开放读码框组成编码复制酶多集蛋白，其3端的1/3区域编码表面纤突蛋白、膜蛋白、小膜蛋白及核衣壳蛋白四个结构蛋白：其各基因排列为5'-1a-1b-S-ORF3-E-M-N-3。3.2
人冠状病毒HKU1humancoronavirusHKU1.HCoV-HKU1属于冠状病毒科冠状病毒属β类冠状病毒。HCoV-NL63在形态上与其它冠状病毒属的病毒致，颗粒呈球形.直径在120～160nm。HCoV-HKU1属于单股正链RNA病毒，其基因组有29，926个核苷酸；2个开放阅读框ORF1a和ORF1b约占RNA全长2/3，组成编码聚合酶的基因，其3端的1/3区域编码血凝素-酯酶蛋白（HE)及表面纤突蛋白、膜蛋白、小膜蛋白和核衣壳蛋白四个结构蛋白：其各基因排列为5-1a-1b-HE-S-E-M-N-3。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
SN/T5098—2019
FAM6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein）HEX六氯-6-甲基荧光素（Hexachlorofluorescein）生物安全要求
生物安全要求包括：
个人防护遵循GB19489：
实验室遵循GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2）实验室的生物安全要求：实验中产生的废弃物品遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理：疑似人感染HCoV-NL63和HCoV-HKU1病毒的材料的包装及转运应符合中华人民共和国卫生部第45号令；
PCR防污染措施按WS/T230的规定执行。6
实验仪器设备
设备包括：
实时荧光定量PCR仪；
超净工作台；
生物安全柜；
高压灭菌锅；
低温高速离心机：最大离心力20000g；漩涡振荡器；
冰箱：4℃、一20℃和-70℃；
移液器：10μL20μL100μL、200μL和1mL；恒温水浴锅。
实验试剂
除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下：标本保存液：在新鲜配制的190mLEaglesMEM中加人56℃热灭活30min的胎牛血清4mL、2mL庆大霉素（5.000μg/mL）、2mL两性霉素B（250μg/mL）和2mL青链霉素（青霉素G10000U/mL、链霉素10000μg/mL）用7.5%碳酸氢钠溶液调至pH7.2。核酸提取试剂：用德国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸\；实时荧光RT-PCR试剂：TAKARA公司OnesteprealtimeRT-PCRkit；无RNA酶的DEPC水；
引物和探针序列见表1。
1)和2)由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
引物/探针名称
HKUI-FP
HKU1-RP
HKU1-Probe
NL63-FP
NL63-RP
NL63-Probe
表1两种冠状病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针序列（5~-3）
CACAGCCGGCGTTCTTTTAA
AATACCATCTCGGTAACAACTGCTT
FAM-ACAGCTGATGGTCAACA-NEG
GGTTTTGATAACCAGTCGAAGTCA
GGGTTGAGAAAGAGGCTTATTAGGT
HEX-CTAGTTCTTCTGGTACTTCC-NEG参考毒株GenBank
序列号
NC_006577
JX524171
SN/T 5098—2019
位置（bp）
28626-28645
28665-28689
28647-28663
26706-26729bZxz.net
26762-26786
26731-26750
扩增片段
预期扩增片
段为64bp
预期扩增片
段为81bp
注：可采用其他等效荧光标记物和淬灭基团或等效的引物和探针，也可采用其他等效的商品化试剂盒，8检测
8.1标本的采集、运输和保存
8.1.1标本的采集
采集疑似人冠状病毒NL63和HKU1感染的患者发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用无菌采样棉签，用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部，采集咽拭子标本，将采集标本的棉签放入装有2～3mL保存液的15mL外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，弃掉手指接触部分。旋紧管盖并密封，以防干燥，外表标注唯一标识。8.1.2标本的保存和运送
标本的运送过程需冷藏（2℃～8℃）。标本的保存和运输的生物安全要求参照卫生部颁布的《人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》和中华人民共和国卫生部第45号令。标本采集后不能立即检测的，应在2℃～8℃贮存，最多不能超过72h，长期贮存的条件是一20℃或以下。8.2标本的处理
将咽拭子标本置于漩涡震荡器混匀，室温静置10min，取140uL上清液进行试验。8.3核酸提取
参照试剂盒说明书操作。
8.4实时荧光PCR反应
准备实时荧光RT-PCR反应液，分别设置HCoV-NL63和HCoV-HKU1病毒实时荧光RT-PCR反应管。每反应管设25uL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：2×OneStepRT-PCRBuffer312.5μL.TaKaRaExTaqHS0.5μL.PrmieScripRTEnzymeMix20.5μL.40μMVFP0.2μL.40μMVRP0.2μL、10μMProbe0.5μL、ROXDyeI0.5μL、RnaseFreedH,O5.1μL、模板RNA5μL。在HCoV-NL63或HCoV-HKU1病毒单重实时荧光RT-PCR反应中，同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照为含HCoV-NL63或HCoV-HKU1病毒目标RNA片段的核苷酸序列，阴性对照为不含HCoV-NL63或HCoV-HKU1病毒核酸的标本保存液。3
SN/T5098—2019
在不同的实时荧光定量PCR仪上，TaqMan探针实时荧光RT-PCR的反应条件略有不同。以ABI7500实时荧光定量PCR仪为例，实时荧光RT-PCR检测扩增程序为：42℃5min，95℃10S；95℃5s，58℃34s（收集荧光信号），45个循环。如使用其它仪器，应根据其它仪器的要求设置具体的反应条件。
8.5结果分析
8.5.1Ct值确定
是以荧光PCR反应的前3个～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，以标本扩增产生的荧光信号达到荧光阅值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值）。8.5.2质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照无扩增曲线；
阳性对照Ct<38并有明显扩增曲线。8.6结果判定
选择FAM荧光通道；并根据以下条件进行结果判定：一无Ct值或Ct>40.且无明显扩增曲线，判断为HCoV-NL63或HCoV-HKU1病毒实时荧光RT-PCR检测阴性：
Ct值≤38.并有明显扩增曲线，判断为HCoV-NL63或HCoV-HKU1病毒实时荧光RT-PCR检测阳性；
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