SN/T 5145.5-2019
基本信息
标准号： SN/T 5145.5-2019
中文名称：出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 第5部分：狗成分检测 PCR-试纸条法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：975751
相关标签： 出口 食品 饲料 动物 成分 快速 检测 方法 PCR 纸条
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
标准号：SN/T 5145.5-2019
标准名称：出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 第5部分：狗成分检测 PCR-试纸条法
英文名称：Rapid Identification of animal ingredient in export food and feed-Part 5: Detection of Canis Ingredient PCR-Lateral flow dipstick method
标准格式：PDF
发布时间：2019-10-25
实施时间：2020-05-01
标准大小：1021K
标准介绍：SN/T5145《出食品饲料中物分速检测方法为下试的按照》法可能发13不别法:
由1别法：和方法试的PCR-提单位照；
由2别法：验方法试的PCR提单位照；
由3别法：研方法试的PCR提单位照；
由4别法：蛋白方法试的PCR-提单位照；
由5别法：质方法试的PCR提单位照；
由6别法：心方法试的PCR提单位照；
由7别法：有要方法试的PCR提单位照；
由8别法：生方法试的PCR提单位照
由9别法：适用方法试的PCR提单位照；
由10别法：于方法试的PCR提单位照；
由11别法：应方法试的PCR-提单位照；
由12别法：必期方法试的PCR提单位照
由13别法：其析方法试的PCR提单位照；
实别法室SN/T5145水由5别法。
实别法采样GB/T1.1—2009量出水目异核糖
酸三烷实甲乙水某些内睿可能涉料专利。实甲乙水发布机构不承担识别这些专利水责任。
实别法由分华人民共和国海关总署提出并归食
实别法核糖单位：分华人民共和国天津海关、天津师范大学、分华人民共和国青岛海关、分国试验试疫科学研究院、北京华大蛋白质研发分心有限公司。
实别法主要核糖人：郑甲杰、赵良娟、高宏伟、刘培、李宗梦、张霞、张宏伟、陈颖、尹长城、孙金生
本部分规定了食品及饲料中狗源性成分检测的PCR试纸条方法。本部分适用于肉、肉制品及饲料中狗源性成分的定性检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
(B/T14699.1饲料采样
GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检測
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适应于本文件。
狗 Canis
属于犬科，犬亚科，犬属动物。本标准中狗成分即指狗特异性DNA片段。
标准名称：出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 第5部分：狗成分检测 PCR-试纸条法
英文名称：Rapid Identification of animal ingredient in export food and feed-Part 5: Detection of Canis Ingredient PCR-Lateral flow dipstick method
标准格式：PDF
发布时间：2019-10-25
实施时间：2020-05-01
标准大小：1021K
标准介绍：SN/T5145《出食品饲料中物分速检测方法为下试的按照》法可能发13不别法:
由1别法：和方法试的PCR-提单位照；
由2别法：验方法试的PCR提单位照；
由3别法：研方法试的PCR提单位照；
由4别法：蛋白方法试的PCR-提单位照；
由5别法：质方法试的PCR提单位照；
由6别法：心方法试的PCR提单位照；
由7别法：有要方法试的PCR提单位照；
由8别法：生方法试的PCR提单位照
由9别法：适用方法试的PCR提单位照；
由10别法：于方法试的PCR提单位照；
由11别法：应方法试的PCR-提单位照；
由12别法：必期方法试的PCR提单位照
由13别法：其析方法试的PCR提单位照；
实别法室SN/T5145水由5别法。
实别法采样GB/T1.1—2009量出水目异核糖
酸三烷实甲乙水某些内睿可能涉料专利。实甲乙水发布机构不承担识别这些专利水责任。
实别法由分华人民共和国海关总署提出并归食
实别法核糖单位：分华人民共和国天津海关、天津师范大学、分华人民共和国青岛海关、分国试验试疫科学研究院、北京华大蛋白质研发分心有限公司。
实别法主要核糖人：郑甲杰、赵良娟、高宏伟、刘培、李宗梦、张霞、张宏伟、陈颖、尹长城、孙金生
本部分规定了食品及饲料中狗源性成分检测的PCR试纸条方法。本部分适用于肉、肉制品及饲料中狗源性成分的定性检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
(B/T14699.1饲料采样
GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检測
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适应于本文件。
狗 Canis
属于犬科，犬亚科，犬属动物。本标准中狗成分即指狗特异性DNA片段。
标准图片预览
标准内容
ICS67.050
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5145.5—2019
出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第5部分：狗成分检测
PCR-试纸条法
Rapid Identification of animal ingredient in export food and feedPart 5:Detection of Canis IngredientPCR-Lateral flow dipstick method2019-10-25发布
中华人民共和国海关总署发布
2020-05-01实施
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SN/T 5145.5—2019
SN/T5145%出食品饲料中物分速检测方法为下试的按照》法可能发13不别法：由1别法：和方法试的PCR-提单位照；由2别法：验方法试的PCR-提单位照；由3别法：研方法试的
PCR-提单位照；
由4别法：蛋白方法试的
PCR-提单位照：
由5别法：质方法试的PCR-提单位照；PCR提单位照；
由6别法：心方法试的wwW.bzxz.Net
由7别法：有要方法试的
PCR-提单位照：
PCR-提单位照；
由8别法：生方法试的
由9别法：适用方法试的PCR-提单位照；由10别法：于方法试的PCR-提单位照；由11别法：应方法试的
PCR-提单位照：
由12别法：必期方法试的
PCR-提单位照：
山13别法：其析方法试的PCR-提单位照：实别法室SN/T5145水由5别法。
实别法采样GB/T1.12009量出水目异核糖。酸三烷实甲乙水某些内容可能涉料专利。实甲乙水发布机构不承担识别这些专利水责任。实别法由分华人民共和国海关总署提出并归食。实别法核糖单位：分华人民共和国天津海关、天津师范大学、分华人民共和国青岛海美、分国试验试疫科学研究院、北京华大蛋白质研发分心有限公司。实别法主要核糖人：郑甲杰、赵良娟、高宏伟、刘培、李宗梦、张霞、张宏伟、陈颖、尹长域、孙金生。1
1范围
iiiKAacJouaKAa
SN/T 5145.5—2019
出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第5部分：狗成分检测PCR-试纸条法本部分规定了食品及饲料中狗源性成分检测的PCR-试纸条方法本部分适用于肉、肉制品及饲料中狗源性成分的定性检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样
GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语
术语和定义
下列术语和定义适应于本文件。3.1.1
狗Canis
属于犬科，犬亚科，犬属动物。本标准中狗成分即指狗特异性DNA片段3.2缩略语
下列缩路语适用于木文件。
DNA：deoxyribonuleicacid，脱氧核糖核酸dNTP：deoxyribonuleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸CTAB：cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵Tris：Tris(Hydroxymethyl):minomethane，三羟甲基氨基甲烷。EDTAEthylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸。FITCFluorescein5-isothiocyanate，异硫氰酸盐。4方法原理
利用裂解液破碎样本细胞，苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，以提取的DNA为模板，采用上游和下游弓物分别经异硫氰酸盐（Fluorescein5-isothiocyanate，FITC）和生物素（Brotin）标记进行PCR扩增，获得两端分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的PCR产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的免多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条对PCR产物进行筛选检测，并对PCR阳性产物进行测序确证。SN/T 5145.5—2019
5试剂和材料
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效展有规定开，试仪为分析一加生化试仪，实验用水色作GB/T6682的要人。5.1狗源性成分检测用引物（对)等列及标增物为：狗成分体阳引物时后灭1。
表1试验用引物
物菌预无
5.2试仪
引物等列（6'→3)
F:5\-GGCTCATTTTCACTATGTGC-3R:5CGATCCTATAGAGGAGACG3
5.2.1ExTagHotStartDNA蒸作正(Taq,Termusauaticu)。5'序标增物
异硫氰酸液(FITC)
生物扩（hiotin）
双基经
5.2.2dNTPs：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧向三磷酸），dTTP(deoxythymidinetriphosphate：脱氧反苷三磷酸），dCTP（deoxyadenosinecytidinetriphosphate，脱氧取苷三磷酸）dGTP（deoxyguannosinetriphosphate，脱氧变苷三磷酸）。5.2.310XPCR退延因:200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/LKCl,20mmol/LMgCl25.2.4三板甲烷（板上）。
5.2.5异伸循。
5.2.6CTAB提行因.20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl.0.02mol/LNaEDTA,pH8.0。
5.2.7CTAB环随因:5g/LCTAB,40mmol/LNaCl-pII8.0。5.2.8模/三板甲烷/异同循程因：按照Tris设和模：三板甲烷：异同循程因比阴空为25：24：1产含已制。
三板甲烷/异同循程因：按照三板甲烷：异同循程因比阴空为24：1产含已制。5.2.1070%乙循（V/V)。
NaCI程因(1.2 nol/L)。
蛋白正K（2cmg/mL）。
试纸条：证有金标增的剂异硫氰酸液的见缓冲积剂比和过定有参附和扩的录用核酸检测试纸5.2.13
条，可录知采代的替料试仪点含进垫（到后观察A）加采用结果的满品化试纸条。5.2.14足视因：10mmol/LTris，1%BSA1%（v/v)Tween20以及浓度为0.05mol/L的NaOH：加采用结果的满品化确品。
6仪器设备
离心机（离心力≥12000g），4℃士1℃。6.2
微量移因器（100m-1000，20-200，2200.5m-10）。6.3PCR仪。
恒温水浴锅，65℃1℃。
天平：感量0.01g。
6.6pH计。
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核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7
7检验步骤
7.1样品制备
7.1.1食品
SN/T5145.5—2019
将固状待检样品研磨混勾，分装三份，其中一份为检样，另外两份为留存样品。液状样品直接分装，加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方式尽量去除样品中的盐、糖和色素等杂质。7.1.2饲料
何料样品按照GB/T11699.1采样，或若粒度为20目称取200mg.60日称取100mg，100日称取100mg
7.2样品DNA提取
称取100mg样品于2mL离心管中，加人1mLCTAB提取液，加入10μL20mg/mL蛋白酶K，65温育1h，期间不时震荡混勾，应保证样品白由悬浮丁液体中，必要时再加人适量CTAB提取缓冲液：取出后12000g离心10min，转移上清至2ml.离心管中，加入等体积的室温酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1)颠倒混勾，120c0g转速下离心10min；转移上清至另一灭菌的离心管中，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24：1），颠倒混匀，室温下12000g离心10min；转移上清至干净离心管中，加人等体积的CTAB沉淀液混勾，室温沉淀1h：加人0.8倍体积的异内醇或2倍体积一20℃冰箱中预冷的无水乙醇混匀，一20℃放置30min，12000g4℃离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12c00g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。加入50uL双蒸水，室温10min，混匀，一20保存。L述方法可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA，7.3DNA浓度和纯度的测定
取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式（1)计算：C-AXNX50/1000
式中：
C——DNA浓度，单位为微克每微升（g/μL)；A—260nm处的吸光值；
N—核酸稀释倍数。
当A260/A280比值在1.7-1.9之间时，适宜于PCR扩增。7.4PCR扩增
7.4.1PCR反应体系
见表2。
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SN/T5145.5—2019
表2PCR反应体系
10×PCR体固盐（梵20mMMg+）
无置引物（5μmol/L）
述置引物（5μmol/L）
ExTaqlotStart(5U/μL)
DNA组上(4ng/μL)
dNTP(2.5 mM each)
色作ddH.O
7.4.2反应条件
94℃粒吸性5min;94℃吸性30sec55℃在火30sec72℃向反30sec，30个垫结直记光72℃5min。PCR述应条件随不同的PCR参略有改吸。检测通程中分别设含性对照、阴性对照和空白对照。用已知带狗源性成分的样品移含性对照，用已知不带狗源性成分的样品移阴性对照，用或产链的至首水代替组上DNA移空白对照。7.4.3试纸条检测
因5μLPCR两物点于核酸试纸条样品垫.展光到95uL表过盐中记扩检测5min直观察结果。8质量控制
以下条件有附条不满足一，实验视为时合：a）空白对照：质控线吸红，检测线未吸红。b)
阴性对照：质控线吸红，检测线未吸红。c
含性对照：质控线吸红，检测线吸红。结果判断与报告
结果判定
试纸条质控线吸红开，且检测线吸红开，PCR增获两物为可疑含性。可疑含性两物素测抗记扩免多(抗列选隆阳另B)。
试纸条质控线吸红开，检测线不吸开，PCR增获两物为阴性。9.2结果报告
PCR两物试纸条检测为可疑含性，同一测抗结果与NCBI基液库同源性达到97%及以经者，判为带有狗源成分，结果报告为检出狗源成分：PCR两物试纸条检测为可疑含性，测抗结果与NCBI基液库同源性低丁97%者，视亲对结果具产分析，判定是否带有狗源成分；PCR两物试纸条检测为阴性，判为不带有狗源成分，结果报告为未检出狗源成分。4
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检测过程中防止交叉污染的措施10
SN/T5145.5—2019
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。11
废弃物处理
检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中楚烧处理。12
检出限
本部分所规定方法的最低检出限(LOD)为0.1%（质量分数）。5
SN/T5145.5—2019
iiiKAa~cJouaKAa
附录A
（资前性附录）
含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条A.1组言言分
A.1.1抗FITC抗体单克隆抗体或多克隆抗体：单克降抗体：Anti-FITCantibody鼠单克降抗体多克隆抗体：Anti-Fluorescein免多克隆抗体A.1.2质控线上的二抗：依据上述免多抗或鼠单抗方案可分别选择羊抗免或者羊抗鼠抗体。3链亲和素：重组链亲和素，大肠杆菌表达的重组Streptavidin蛋白。A.1.3
A,2试纸条结构
吸水滤纸垫：
结合物垫，附有FITC抗体（免源）与胶体金颗粒的交联体：侧向层析基质（硝酸纤维素膜）：检测带·附有链亲和素；
质控带·附有可结合免源抗体的抗体；衬底：
吸水垫。
A.3试纸条检测原理
捡测用试纸条的吸水垫上含有金标记的抗异硫氰酸盐（FITC)的免多克降抗体，可与PCR产物条链上的FAM标记分子结合，在检测线位置土固定有链亲和素，可与PCR产物另一条链上的生物素结合。
阳性PCR扩增产物在展开液的作用下，首先与金标记的羧基荧光素抗体结合·通过虹吸作用向上部移动，在经过固定有链亲和素的检测线位置时，因带有生物素标记而被链亲和素捕获在该位置上，显示棕红色，过量的产物继续向上移动至固定有羊抗免抗体的质控线位置，因其带有抗异硫氰酸盐的免多克降抗体而被捕获在质控线上，从而显示出两条色带。非特异性扩增的PCR产物因无生物素或异硫氰酸盐标记的缘故，不能与金标记的异硫氰酸盐抗体结合，且被链亲和素捕获，从而不能在检测线位置显示颜色，而未参与反应的PCR引物因带有异硫氧酸盐标记，故也可被异硫氰酸盐抗体捕获问上一直移动至质控线被羊抗兔抗体捕获而显色6
iiiKAacJouakAa
行业B
（标中出行业）
PCR口华和食验疫
SN/T 5145.5—2019
国人出民共入品及境检饲准料动食物（gennbank源：AY656755.1l）GGCTCATTTTCACTATGTGCTTTCAATAGGAGCAGTTTTTGCCATTATGGGAGGATTTGCCCACTGATTCCCTTTATTCTCAGGTTATACTCTTAACGATACTTGAGCAAAGATTCACTTTACAATTATGTTTGTGGGAGTAAATATAACTTTCTTCCCTCAACATTTCCTAGGTTTATCTGGAATACCTCGTCGATACTCTGACTACCCAGATGCATATACTACCTGAAATACCGTCTCCTCTATAGGATCG
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5145.5—2019
出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第5部分：狗成分检测
PCR-试纸条法
Rapid Identification of animal ingredient in export food and feedPart 5:Detection of Canis IngredientPCR-Lateral flow dipstick method2019-10-25发布
中华人民共和国海关总署发布
2020-05-01实施
iiiKAa~cJouaKAa=
SN/T 5145.5—2019
SN/T5145%出食品饲料中物分速检测方法为下试的按照》法可能发13不别法：由1别法：和方法试的PCR-提单位照；由2别法：验方法试的PCR-提单位照；由3别法：研方法试的
PCR-提单位照；
由4别法：蛋白方法试的
PCR-提单位照：
由5别法：质方法试的PCR-提单位照；PCR提单位照；
由6别法：心方法试的wwW.bzxz.Net
由7别法：有要方法试的
PCR-提单位照：
PCR-提单位照；
由8别法：生方法试的
由9别法：适用方法试的PCR-提单位照；由10别法：于方法试的PCR-提单位照；由11别法：应方法试的
PCR-提单位照：
由12别法：必期方法试的
PCR-提单位照：
山13别法：其析方法试的PCR-提单位照：实别法室SN/T5145水由5别法。
实别法采样GB/T1.12009量出水目异核糖。酸三烷实甲乙水某些内容可能涉料专利。实甲乙水发布机构不承担识别这些专利水责任。实别法由分华人民共和国海关总署提出并归食。实别法核糖单位：分华人民共和国天津海关、天津师范大学、分华人民共和国青岛海美、分国试验试疫科学研究院、北京华大蛋白质研发分心有限公司。实别法主要核糖人：郑甲杰、赵良娟、高宏伟、刘培、李宗梦、张霞、张宏伟、陈颖、尹长域、孙金生。1
1范围
iiiKAacJouaKAa
SN/T 5145.5—2019
出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第5部分：狗成分检测PCR-试纸条法本部分规定了食品及饲料中狗源性成分检测的PCR-试纸条方法本部分适用于肉、肉制品及饲料中狗源性成分的定性检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样
GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语
术语和定义
下列术语和定义适应于本文件。3.1.1
狗Canis
属于犬科，犬亚科，犬属动物。本标准中狗成分即指狗特异性DNA片段3.2缩略语
下列缩路语适用于木文件。
DNA：deoxyribonuleicacid，脱氧核糖核酸dNTP：deoxyribonuleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸CTAB：cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵Tris：Tris(Hydroxymethyl):minomethane，三羟甲基氨基甲烷。EDTAEthylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸。FITCFluorescein5-isothiocyanate，异硫氰酸盐。4方法原理
利用裂解液破碎样本细胞，苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，以提取的DNA为模板，采用上游和下游弓物分别经异硫氰酸盐（Fluorescein5-isothiocyanate，FITC）和生物素（Brotin）标记进行PCR扩增，获得两端分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的PCR产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的免多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条对PCR产物进行筛选检测，并对PCR阳性产物进行测序确证。SN/T 5145.5—2019
5试剂和材料
iiiKAacJouaKAa
效展有规定开，试仪为分析一加生化试仪，实验用水色作GB/T6682的要人。5.1狗源性成分检测用引物（对)等列及标增物为：狗成分体阳引物时后灭1。
表1试验用引物
物菌预无
5.2试仪
引物等列（6'→3)
F:5\-GGCTCATTTTCACTATGTGC-3R:5CGATCCTATAGAGGAGACG3
5.2.1ExTagHotStartDNA蒸作正(Taq,Termusauaticu)。5'序标增物
异硫氰酸液(FITC)
生物扩（hiotin）
双基经
5.2.2dNTPs：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧向三磷酸），dTTP(deoxythymidinetriphosphate：脱氧反苷三磷酸），dCTP（deoxyadenosinecytidinetriphosphate，脱氧取苷三磷酸）dGTP（deoxyguannosinetriphosphate，脱氧变苷三磷酸）。5.2.310XPCR退延因:200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/LKCl,20mmol/LMgCl25.2.4三板甲烷（板上）。
5.2.5异伸循。
5.2.6CTAB提行因.20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl.0.02mol/LNaEDTA,pH8.0。
5.2.7CTAB环随因:5g/LCTAB,40mmol/LNaCl-pII8.0。5.2.8模/三板甲烷/异同循程因：按照Tris设和模：三板甲烷：异同循程因比阴空为25：24：1产含已制。
三板甲烷/异同循程因：按照三板甲烷：异同循程因比阴空为24：1产含已制。5.2.1070%乙循（V/V)。
NaCI程因(1.2 nol/L)。
蛋白正K（2cmg/mL）。
试纸条：证有金标增的剂异硫氰酸液的见缓冲积剂比和过定有参附和扩的录用核酸检测试纸5.2.13
条，可录知采代的替料试仪点含进垫（到后观察A）加采用结果的满品化试纸条。5.2.14足视因：10mmol/LTris，1%BSA1%（v/v)Tween20以及浓度为0.05mol/L的NaOH：加采用结果的满品化确品。
6仪器设备
离心机（离心力≥12000g），4℃士1℃。6.2
微量移因器（100m-1000，20-200，2200.5m-10）。6.3PCR仪。
恒温水浴锅，65℃1℃。
天平：感量0.01g。
6.6pH计。
iiiKAa~cJouaKAa
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7
7检验步骤
7.1样品制备
7.1.1食品
SN/T5145.5—2019
将固状待检样品研磨混勾，分装三份，其中一份为检样，另外两份为留存样品。液状样品直接分装，加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方式尽量去除样品中的盐、糖和色素等杂质。7.1.2饲料
何料样品按照GB/T11699.1采样，或若粒度为20目称取200mg.60日称取100mg，100日称取100mg
7.2样品DNA提取
称取100mg样品于2mL离心管中，加人1mLCTAB提取液，加入10μL20mg/mL蛋白酶K，65温育1h，期间不时震荡混勾，应保证样品白由悬浮丁液体中，必要时再加人适量CTAB提取缓冲液：取出后12000g离心10min，转移上清至2ml.离心管中，加入等体积的室温酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1)颠倒混勾，120c0g转速下离心10min；转移上清至另一灭菌的离心管中，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24：1），颠倒混匀，室温下12000g离心10min；转移上清至干净离心管中，加人等体积的CTAB沉淀液混勾，室温沉淀1h：加人0.8倍体积的异内醇或2倍体积一20℃冰箱中预冷的无水乙醇混匀，一20℃放置30min，12000g4℃离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12c00g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。加入50uL双蒸水，室温10min，混匀，一20保存。L述方法可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA，7.3DNA浓度和纯度的测定
取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式（1)计算：C-AXNX50/1000
式中：
C——DNA浓度，单位为微克每微升（g/μL)；A—260nm处的吸光值；
N—核酸稀释倍数。
当A260/A280比值在1.7-1.9之间时，适宜于PCR扩增。7.4PCR扩增
7.4.1PCR反应体系
见表2。
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表2PCR反应体系
10×PCR体固盐（梵20mMMg+）
无置引物（5μmol/L）
述置引物（5μmol/L）
ExTaqlotStart(5U/μL)
DNA组上(4ng/μL)
dNTP(2.5 mM each)
色作ddH.O
7.4.2反应条件
94℃粒吸性5min;94℃吸性30sec55℃在火30sec72℃向反30sec，30个垫结直记光72℃5min。PCR述应条件随不同的PCR参略有改吸。检测通程中分别设含性对照、阴性对照和空白对照。用已知带狗源性成分的样品移含性对照，用已知不带狗源性成分的样品移阴性对照，用或产链的至首水代替组上DNA移空白对照。7.4.3试纸条检测
因5μLPCR两物点于核酸试纸条样品垫.展光到95uL表过盐中记扩检测5min直观察结果。8质量控制
以下条件有附条不满足一，实验视为时合：a）空白对照：质控线吸红，检测线未吸红。b)
阴性对照：质控线吸红，检测线未吸红。c
含性对照：质控线吸红，检测线吸红。结果判断与报告
结果判定
试纸条质控线吸红开，且检测线吸红开，PCR增获两物为可疑含性。可疑含性两物素测抗记扩免多(抗列选隆阳另B)。
试纸条质控线吸红开，检测线不吸开，PCR增获两物为阴性。9.2结果报告
PCR两物试纸条检测为可疑含性，同一测抗结果与NCBI基液库同源性达到97%及以经者，判为带有狗源成分，结果报告为检出狗源成分：PCR两物试纸条检测为可疑含性，测抗结果与NCBI基液库同源性低丁97%者，视亲对结果具产分析，判定是否带有狗源成分；PCR两物试纸条检测为阴性，判为不带有狗源成分，结果报告为未检出狗源成分。4
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检测过程中防止交叉污染的措施10
SN/T5145.5—2019
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。11
废弃物处理
检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中楚烧处理。12
检出限
本部分所规定方法的最低检出限(LOD)为0.1%（质量分数）。5
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附录A
（资前性附录）
含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条A.1组言言分
A.1.1抗FITC抗体单克隆抗体或多克隆抗体：单克降抗体：Anti-FITCantibody鼠单克降抗体多克隆抗体：Anti-Fluorescein免多克隆抗体A.1.2质控线上的二抗：依据上述免多抗或鼠单抗方案可分别选择羊抗免或者羊抗鼠抗体。3链亲和素：重组链亲和素，大肠杆菌表达的重组Streptavidin蛋白。A.1.3
A,2试纸条结构
吸水滤纸垫：
结合物垫，附有FITC抗体（免源）与胶体金颗粒的交联体：侧向层析基质（硝酸纤维素膜）：检测带·附有链亲和素；
质控带·附有可结合免源抗体的抗体；衬底：
吸水垫。
A.3试纸条检测原理
捡测用试纸条的吸水垫上含有金标记的抗异硫氰酸盐（FITC)的免多克降抗体，可与PCR产物条链上的FAM标记分子结合，在检测线位置土固定有链亲和素，可与PCR产物另一条链上的生物素结合。
阳性PCR扩增产物在展开液的作用下，首先与金标记的羧基荧光素抗体结合·通过虹吸作用向上部移动，在经过固定有链亲和素的检测线位置时，因带有生物素标记而被链亲和素捕获在该位置上，显示棕红色，过量的产物继续向上移动至固定有羊抗免抗体的质控线位置，因其带有抗异硫氰酸盐的免多克降抗体而被捕获在质控线上，从而显示出两条色带。非特异性扩增的PCR产物因无生物素或异硫氰酸盐标记的缘故，不能与金标记的异硫氰酸盐抗体结合，且被链亲和素捕获，从而不能在检测线位置显示颜色，而未参与反应的PCR引物因带有异硫氧酸盐标记，故也可被异硫氰酸盐抗体捕获问上一直移动至质控线被羊抗兔抗体捕获而显色6
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行业B
（标中出行业）
PCR口华和食验疫
SN/T 5145.5—2019
国人出民共入品及境检饲准料动食物（gennbank源：AY656755.1l）GGCTCATTTTCACTATGTGCTTTCAATAGGAGCAGTTTTTGCCATTATGGGAGGATTTGCCCACTGATTCCCTTTATTCTCAGGTTATACTCTTAACGATACTTGAGCAAAGATTCACTTTACAATTATGTTTGTGGGAGTAAATATAACTTTCTTCCCTCAACATTTCCTAGGTTTATCTGGAATACCTCGTCGATACTCTGACTACCCAGATGCATATACTACCTGAAATACCGTCTCCTCTATAGGATCG
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