SN/T 3306.10-2017.Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port- Part 10 : Bacillus anthracis.
1范围
SN/T 3306.10规定了在国境口岸利用环介导恒温核酸扩增(LAMP)法检测炭疽芽孢杆菌的检测对象、检测程序及检测结果的报告。
SN/T 3306.10适用于国境口岸炭疽芽有杆菌的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
SN/T 1214国境口岸处理炭疽杆菌污染可疑物品操作规程
SN/T 2358国境口岸炭疽芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法
SN/T 2701动物炭疽病检疫规范
人间传染的病原微生物名录(卫科教发[2006115号
3技术概要
根据炭疽芽孢杆菌的特异性毒力基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对 ,共三对引物,特异性识别靶序列上的BAS3788基因,利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成,在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产生副产物(焦磷酸镁)形成乳白色沉淀,即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可加入显色液,通过观察颜色变化判定结果。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3306.10—2017
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第10部分：炭疽芽孢杆菌
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontierport-Part10:Bacillus anthracis2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》分为14个部分：第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌：
第3部分：志贺氏菌；
第4部分：嗜肺军团菌；
第5部分：布鲁氏菌；
第6部分：黄热病毒；
第7部分：猴痘病毒；
第8部分：基孔肯雅病毒；
第9部分：结核分枝杆菌：
第10部分：炭疽芽孢杆菌；
第11部分：副溶血性弧菌；
第12部分：空肠弯曲菌；
第13部分：症原虫；
第14部分：大肠杆菌0157：H7。本部分为SN/T3306的第10部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T3306.102017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本部分主要起草人：祁军、王飞、朱俊贤、潘娟、王馨1范围
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第10部分：炭疽芽孢杆菌
SN/T3306.10—2017
国境口岸利用环介导恒温核酸扩增（LAMP）法检测炭疽芽孢杆菌SN/T3306的本部分规定了在此内容来自标准下载网
的检测对象、检测程序及检测结果的报告。本部分适用于国境口岸炭疽芽孢杆菌的筛选检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是心不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法GB/T6682
GB19489
WS/T230
实验室生物安全通用要
临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用SN/T1214
SN/T2358
SN/T2701
国境口岸处理炭疽杆菌污
染可疑物品操作规程
光定量PCR检测方法
泡杆菌
国境口岸炭疽芽
动物炭疽病检疫规范
人间传染的病原微生物名录卫科教发【2003缩略语
下列缩略语适用于本文件
Betaine：甜菜碱。
Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）[BstDNApolymerase(largefragment)]DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid)LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚生物安全及防污染措施
实验操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定执行，由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T230的规定。SN/T3306.10—2017
5技术概要
根据炭疽芽孢杆菌的特异性毒力基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对，共三对引物，特异性识别靶序列上的BA.S3788基因，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物：从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可加人显色液，通过观察颜色变化判定结果。6试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。6.1引物。
根据炭疽芽孢杆菌特有的靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2.内引物1，内引物2和环状引物1,环状引物2。外引物1(F3，5-3）：GTAATCCTCTGTTAAAACACGACGC外引物2(B3，5-3\）：TGCTGTTGTTTGTTGGGATGGT内引物1(FIR，5-3')：TGGAGAATTGTGGTTCTCTAAGCCGTTTCAGTGTAATCTTTAGGGTGTAATGTG
内引物2(BIP,5，-3')：AATTCCATTCTTACAGCGGTTTCCGTTTAGCGATGGGGTGGAATACTAAG
环状引物1(LF，5-3）：GCGGTGAGGTAGCGAGTTACT环状引物2(LB，5*-3）：GATGTTTTCGTCCAAGTATTATCTG6.2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-100。6.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。6.4BstDNA聚合酶：8U/μL。
6.510XThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(pH8.8）100mmol/L(NH)zSO、100mmol/LKCI.20mmol/LMgSO4、1%TritonX-100。6.6MgSO,溶液：25mmol/L
甜菜碱：5mol/L。
显色液：浓度为1000XSYBRGreenI。6.9
阳性对照：含目的片段的DNA。
0.2mL、1.5mL和10mL塑料离心管。6.10
吸头，配套移液器使用。
7仪器设备
7.1移液器：量程0.1μL~2μL，量程0.5μL~10μL，量程10μL~100μL，量程100μL~1000μL。7.2高速台式离心机：≥7000g。7.3水浴锅或加热模块：65℃±1℃和100℃土1℃。2
7.4计时器。
检测程序
炭疽芽孢杆菌LAMP检测程序见图1。阴性
样本采集
样本的增菌及分离培养
样本前处理
模板DNA提取
LAMP反应
结果报告
经分离培养鉴定确认
图1炭疽芽孢杆菌LAMP检测程序
9操作步骤
9.1样本采集与处理
按照SN/T2358、SN/T1214执行。模板DNA的提取
按照SN/T2358执行，也可按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作。SN/T3306.10—2017
SN/T3306.10—2017
9.3环介导恒温核酸扩增
反应体系
炭疽芽孢杆菌环介导引物恒温扩增反应体系见表1。炭疽芽孢杆菌环介导引物恒温扩增反应体系表1
试剂名称
10XThermoPol缓冲液
F3引物
B3引物
FIR引物
BIP引物
LF引物
LB引物
甜菜碱
硫酸镁溶液
BetDNA聚合酶
9.3.2反应过程
储备液浓度
10pemol/1
100mol/
100μmol/L
体系加样量
按照表1所述配制反应体系，上述组分加入后，轻柔混勾并短暂离心后加入10的凡士林（密封液），最后将1μL的显色液加人反应管顶端。盖上管盖后，置于65℃恒温扩增60min，观察结果。空白对照、阴性对照、阳性对照设置9.3.3
每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照采用无菌水作为扩增模板。阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。阳性对照以含检测序列的质粒DNA作为扩增模板。结果观察
取出反应管，短暂离心使反应管盖中显色液进人反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化，判断结果。
结果判定
SN/T3306.10—2017
在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：a)
阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，则报告为LAMP检测阳性。如需通过分离培养鉴定对上述检测结果进行确认，可按SN/T2701执行。阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，则报告为LAMP检测阴性。
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