SN/T 4793-2017
基本信息
标准号： SN/T 4793-2017
中文名称：国境口岸疟原虫实时荧光PCR检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 国境 口岸 疟原虫 实时 荧光 PCR 检测 方法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4793-2017.Test methods for Plasmodium by real time PCR at ports.
1范围
SN/T 4793规定了国境口岸疟疾检测的生物安全要求,标本的采集.运输和保存,疟疾实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4793适用于国境口岸入出境疑似恶性疟、间日疟、卵形疟种三日疟感染对象的实时荧光PCR检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是社日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通用要求
人间传染的病原微生物名录(卫科教发[2006)15号)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1疟疾malaria
由人类疟原虫感染引起的寄生虫病,主要由雌性按蚊叮咬传播。疟原虫先侵入肝细胞发育 繁殖,再侵人红细胞繁殖,引起红细胞成批破裂而发病。临床，上以反复发作的间歇性寒战、高热、继之出大汗后缓解为特点。
3.2疟原虫Plasmodium
属于真球虫目(Euccidiida)、疟原虫科(Plasmodidae)、疟原虫属(Plasmodium).是疟疾的病原体。寄生于人类的疟原虫有4种,即间日疟原虫( Plasmodium vivar)、恶性疟原虫( Plasmodium falci-parum)三日疟原虫( Plasmodium malariae )及卵形疟原虫( Plasmodium ovale),分别引起间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。
1范围
SN/T 4793规定了国境口岸疟疾检测的生物安全要求,标本的采集.运输和保存,疟疾实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4793适用于国境口岸入出境疑似恶性疟、间日疟、卵形疟种三日疟感染对象的实时荧光PCR检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是社日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通用要求
人间传染的病原微生物名录(卫科教发[2006)15号)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1疟疾malaria
由人类疟原虫感染引起的寄生虫病,主要由雌性按蚊叮咬传播。疟原虫先侵入肝细胞发育 繁殖,再侵人红细胞繁殖,引起红细胞成批破裂而发病。临床，上以反复发作的间歇性寒战、高热、继之出大汗后缓解为特点。
3.2疟原虫Plasmodium
属于真球虫目(Euccidiida)、疟原虫科(Plasmodidae)、疟原虫属(Plasmodium).是疟疾的病原体。寄生于人类的疟原虫有4种,即间日疟原虫( Plasmodium vivar)、恶性疟原虫( Plasmodium falci-parum)三日疟原虫( Plasmodium malariae )及卵形疟原虫( Plasmodium ovale),分别引起间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4793—2017
国境口岸疟原虫实时荧光PCR检测方法Test methods for Plasmodium by real time PCR at ports2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4793—2017
本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国汕头出人境检验检疫局，中华人民共和国广州机场出人境检验检疫局。本标准主要起草人：师永霞、李小波、朱俊贤、李燕、黄吉城、幸芦琴、洪烨、孙薇、钟玉清、相大鹏1范围
国境口岸症原虫实时荧光PCR检测方法SN/T4793-2017
本标准规定了国境口岸症疾检测的生物安全要求，标本的采集，运输和保存，疤疾实时荧光PCR检测方法。
本标准适用于国境口岸人出境疑似恶性症、间日、卵形痘和三日症感染对象的实时荧光PCR
检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物
安全通用要求
人间传染的病原微生物名录（卫科教发【2006]15号）3术语和定义
下列术语和定义适用于本工
malaria
由人类症原虫感染引起的寄生与虫病，主要由雌性按蚊叮咬传播。症原虫先侵人肝细胞发育整殖.再侵人红细胞繁殖，引起红细胞
成批破
缓解为特点。
宠原虫Plasmodium
裂而发病。临床上以反复发作的间歇性寒战、高热、继之出大汗后属于真球虫目（Eucoccidida）、症原虫科（Plasmodidae）、原虫属（Plasmodium），是症疾的病原体。寄生于人类的症原虫有4种，即间日症原虫（Plasmodiumvivar）、恶性症原虫（Plasmodiumfalci-parum）、三日症原虫（Plasmodiummalariae）及卵形原虫（Plasmodiumovale），分别引起间日症、恶性症、三日症和卵形症。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件
实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应。Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的國值时所经历的循环数。DNA：脱氧核糖核酸。
FAM:FAM荧光染料，一种荧光报告基团。SN/T47932017
生物安全要求
症原虫相关材料的实验活动按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》中的生物安全要求进行。
人抗凝血清标本的采集、运输和保存6
无菌采集疑似病例静脉血3mL~5mL至2%EDTA-Na2抗凝管，用耐低温油性记号笔记上编号，低温冷链送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，一20℃低温保存。实验室接到样本后，应尽快进行检测，并避免反复冻融。
主要仪器
本方法使用的主要仪器包括：
荧光定量PCR仪；
超净工作台：
-IIA级生物安全柜；
高压灭菌锅：
低温高速离心机（最大离心力20000×g）；漩涡振荡器；
冰箱（4℃、20℃和-70℃）；
移液器等。
主要试剂
本方法使用的主要试剂包括核酸提取试剂，如Qiagen公司的QIAampDNABloodExtractionMinikit提取症原虫核酸，实时荧光PCR通用试剂如中国CYbio公司的HRQpcrMasterMix”、染料掺人法荧光PCR试剂如Qiagen公司的QuantiTectSYBRGreenPCRKit、无DNA酶的双蒸水、引物和探针等，引物和探针序列见表1。表1症原虫实时荧光PCR检测的引物和探针引物/探针名称
Plas-FP
Plas-RP
Plas-Pro
PF-Pro
序列（5*-3\）
AGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGA
TCATCCAAMRCCTAGTCGGCATAGTTTATFAM-ACCGTCGTAATCTT-MGB
CTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAATATTCCATGCTGTAGTATTCAAACACAAFAM-TGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA-BHQ1备注
症原虫通用
恶性症
1)，2），3)由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。9
引物/探针名称
PV-Pro
PM-Pro
表1（续）
序列（5*-3\）
ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT
ACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCC
FAM-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC-BHQIATTAATGTGTCCTTTTCCCTATTCT
GCTTTACAATCAAACGAATACATTC
CCGACTAGGTGTTGGATGATAGAGTAAAAACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA
FAM-CTATCTAAAAGAAACACTCAT-MGE症疾的实时荧光PCR检测
核酸提取
按试剂盒说明提取核酸，用于实时荧光PCR检测或一20℃储存DNA待检症原虫通用实时荧光PCR检测
9.2.1加样
SN/T4793—2017
间日症
卵形症，熔解曲线
Tm值为72.5℃
三日痣
制备实时荧光PCR反应液，反应体系为25μL（见表2）。每个反应体系均设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据症原虫上下游引物间的核苷酸序列合成的DNA片段，阴性对照模板为不含症原虫核酸的标本或无DNA酶的水。表2
反应成分
2XMasterMix
10μmol/L正向引物
10μmol/L反向引物
5μmol/L探针
无DNA酶的双蒸水
待测样本DNA
实时荧光PCR扩增反应
痣原虫实时荧光PCR反应体系
体积/μL
在不同的荧光定量PCR仪上，TaqMan探针实时荧光PCR的反应条件略有不同。以ABI7500HT荧光定量PCR仪为例，实时荧光PCR检测扩增程序为：95℃5min95℃10s，58℃45s，40个循环，在58℃收集荧光。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求进行适当调整，SN/T4793—2017
9.3症原虫种特异性实时荧光PCR检测9.3.1加样下载标准就来标准下载网
采用荧光探针法进行恶性症、间日症和三日症的实时荧光PCR检测，分别在3个离心管中配制恶性症，间日症和三日症的反应液，反应体系为25（见表2）采用染料掺人法进行卵形症的实时荧光PCR检测反应体系为25μL（见表3）。每个反应体系均设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板分别为根据恶性症原虫、间日症原虫、卵形症原虫和三日症原虫上下游引物间的核苷酸序列合成的DNA片段，阴性对照模板为不含症原虫核酸的标本或无DNA酶的水。3
反应成分
2XPCRbuffer
10μmol/L正向引物PO-FP
10μmol/L反向引物PO-RP
无DNA酶的双蒸水
待测样本DNA
9.3.2实时荧光PCR扩增反
卵形症原虫实时荧光PCR反应体系体积/nL
在不同的荧光定量PCR仪上，TaqMan探针实时荧光PCR的反应程序略有不同。ABI7500HT荧光定量PCR仪的扩增程序如下
使用其他仪器，应根据其他仪器的要求进行适当调整：荧光探针法实时荧光PCR检测扩增程序为：95℃5mn95℃10s，58℃45s，40个循环，在58℃收集荧光；
染料掺入法实时荧光PCR反应程序为：9C
min:94
℃15s.50℃30s72℃30s（收集
荧光），40个循环：最后对PCR产物进行熔解曲线分析，程序为94℃15s，60℃60s，95℃15s。
10结果分析
阅值确定
-般是以荧光PCR反应的前3个～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阅值，以样品扩增产生的荧光信号达到荧光阐值时所对应的循环数为循环阅值(Ct值）。
10.2质量控制
反应结果应同时符合以下两个条件：阴性对照无扩增曲线：
阳性对照Ct<35并有明显扩增曲线。10.3结果判定
10.3.1症原虫通用引物探针检测结果判定根据以下条件进行结果判定：
SN/T4793—2017
症原虫通用引物和探针对应的检验样本无明显扩增曲线，且检测不到Ct值，判断为痣原虫荧光PCR检测阴性；
疟原虫通用引物和探针对应的检验样本Ct<35，并有明显扩增曲线，判断为疟原虫荧光PCR检测阳性。可使用症原虫种特异性引物和探针进行进一步的症原虫种类鉴定；原虫通用引物和探针对应的检验样本Ct值大于35且小于40的标本应重做。若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判断为症原虫荧光PCR检测阳性，否则为阴性。2症原虫种特异性引物探针检测结果判定10.3.2
根据以下条件进行结果判定：
某种种类症原虫引物和探针对应的检验样本无明显扩增曲线，且检测不到Ct值时，判断为该种类症原虫荧光PCR检测阴性：
某种种类症原虫引物和探针对应的检验样本Ct<35，并有明显扩增曲线，判断为该种类原虫荧光PCR检测阳性；
某种种类症原虫引物和探针对应的检验样本Ct值大于35且小于40的标本应重做。若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判断为该种类症原虫荧光PCR检测阳性，否则为阴性。S
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国境口岸疟原虫实时荧光PCR检测方法Test methods for Plasmodium by real time PCR at ports2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4793—2017
本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国汕头出人境检验检疫局，中华人民共和国广州机场出人境检验检疫局。本标准主要起草人：师永霞、李小波、朱俊贤、李燕、黄吉城、幸芦琴、洪烨、孙薇、钟玉清、相大鹏1范围
国境口岸症原虫实时荧光PCR检测方法SN/T4793-2017
本标准规定了国境口岸症疾检测的生物安全要求，标本的采集，运输和保存，疤疾实时荧光PCR检测方法。
本标准适用于国境口岸人出境疑似恶性症、间日、卵形痘和三日症感染对象的实时荧光PCR
检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物
安全通用要求
人间传染的病原微生物名录（卫科教发【2006]15号）3术语和定义
下列术语和定义适用于本工
malaria
由人类症原虫感染引起的寄生与虫病，主要由雌性按蚊叮咬传播。症原虫先侵人肝细胞发育整殖.再侵人红细胞繁殖，引起红细胞
成批破
缓解为特点。
宠原虫Plasmodium
裂而发病。临床上以反复发作的间歇性寒战、高热、继之出大汗后属于真球虫目（Eucoccidida）、症原虫科（Plasmodidae）、原虫属（Plasmodium），是症疾的病原体。寄生于人类的症原虫有4种，即间日症原虫（Plasmodiumvivar）、恶性症原虫（Plasmodiumfalci-parum）、三日症原虫（Plasmodiummalariae）及卵形原虫（Plasmodiumovale），分别引起间日症、恶性症、三日症和卵形症。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件
实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应。Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的國值时所经历的循环数。DNA：脱氧核糖核酸。
FAM:FAM荧光染料，一种荧光报告基团。SN/T47932017
生物安全要求
症原虫相关材料的实验活动按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》中的生物安全要求进行。
人抗凝血清标本的采集、运输和保存6
无菌采集疑似病例静脉血3mL~5mL至2%EDTA-Na2抗凝管，用耐低温油性记号笔记上编号，低温冷链送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，一20℃低温保存。实验室接到样本后，应尽快进行检测，并避免反复冻融。
主要仪器
本方法使用的主要仪器包括：
荧光定量PCR仪；
超净工作台：
-IIA级生物安全柜；
高压灭菌锅：
低温高速离心机（最大离心力20000×g）；漩涡振荡器；
冰箱（4℃、20℃和-70℃）；
移液器等。
主要试剂
本方法使用的主要试剂包括核酸提取试剂，如Qiagen公司的QIAampDNABloodExtractionMinikit提取症原虫核酸，实时荧光PCR通用试剂如中国CYbio公司的HRQpcrMasterMix”、染料掺人法荧光PCR试剂如Qiagen公司的QuantiTectSYBRGreenPCRKit、无DNA酶的双蒸水、引物和探针等，引物和探针序列见表1。表1症原虫实时荧光PCR检测的引物和探针引物/探针名称
Plas-FP
Plas-RP
Plas-Pro
PF-Pro
序列（5*-3\）
AGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGA
TCATCCAAMRCCTAGTCGGCATAGTTTATFAM-ACCGTCGTAATCTT-MGB
CTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAATATTCCATGCTGTAGTATTCAAACACAAFAM-TGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA-BHQ1备注
症原虫通用
恶性症
1)，2），3)由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。9
引物/探针名称
PV-Pro
PM-Pro
表1（续）
序列（5*-3\）
ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT
ACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCC
FAM-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC-BHQIATTAATGTGTCCTTTTCCCTATTCT
GCTTTACAATCAAACGAATACATTC
CCGACTAGGTGTTGGATGATAGAGTAAAAACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA
FAM-CTATCTAAAAGAAACACTCAT-MGE症疾的实时荧光PCR检测
核酸提取
按试剂盒说明提取核酸，用于实时荧光PCR检测或一20℃储存DNA待检症原虫通用实时荧光PCR检测
9.2.1加样
SN/T4793—2017
间日症
卵形症，熔解曲线
Tm值为72.5℃
三日痣
制备实时荧光PCR反应液，反应体系为25μL（见表2）。每个反应体系均设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据症原虫上下游引物间的核苷酸序列合成的DNA片段，阴性对照模板为不含症原虫核酸的标本或无DNA酶的水。表2
反应成分
2XMasterMix
10μmol/L正向引物
10μmol/L反向引物
5μmol/L探针
无DNA酶的双蒸水
待测样本DNA
实时荧光PCR扩增反应
痣原虫实时荧光PCR反应体系
体积/μL
在不同的荧光定量PCR仪上，TaqMan探针实时荧光PCR的反应条件略有不同。以ABI7500HT荧光定量PCR仪为例，实时荧光PCR检测扩增程序为：95℃5min95℃10s，58℃45s，40个循环，在58℃收集荧光。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求进行适当调整，SN/T4793—2017
9.3症原虫种特异性实时荧光PCR检测9.3.1加样下载标准就来标准下载网
采用荧光探针法进行恶性症、间日症和三日症的实时荧光PCR检测，分别在3个离心管中配制恶性症，间日症和三日症的反应液，反应体系为25（见表2）采用染料掺人法进行卵形症的实时荧光PCR检测反应体系为25μL（见表3）。每个反应体系均设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板分别为根据恶性症原虫、间日症原虫、卵形症原虫和三日症原虫上下游引物间的核苷酸序列合成的DNA片段，阴性对照模板为不含症原虫核酸的标本或无DNA酶的水。3
反应成分
2XPCRbuffer
10μmol/L正向引物PO-FP
10μmol/L反向引物PO-RP
无DNA酶的双蒸水
待测样本DNA
9.3.2实时荧光PCR扩增反
卵形症原虫实时荧光PCR反应体系体积/nL
在不同的荧光定量PCR仪上，TaqMan探针实时荧光PCR的反应程序略有不同。ABI7500HT荧光定量PCR仪的扩增程序如下
使用其他仪器，应根据其他仪器的要求进行适当调整：荧光探针法实时荧光PCR检测扩增程序为：95℃5mn95℃10s，58℃45s，40个循环，在58℃收集荧光；
染料掺入法实时荧光PCR反应程序为：9C
min:94
℃15s.50℃30s72℃30s（收集
荧光），40个循环：最后对PCR产物进行熔解曲线分析，程序为94℃15s，60℃60s，95℃15s。
10结果分析
阅值确定
-般是以荧光PCR反应的前3个～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阅值，以样品扩增产生的荧光信号达到荧光阐值时所对应的循环数为循环阅值(Ct值）。
10.2质量控制
反应结果应同时符合以下两个条件：阴性对照无扩增曲线：
阳性对照Ct<35并有明显扩增曲线。10.3结果判定
10.3.1症原虫通用引物探针检测结果判定根据以下条件进行结果判定：
SN/T4793—2017
症原虫通用引物和探针对应的检验样本无明显扩增曲线，且检测不到Ct值，判断为痣原虫荧光PCR检测阴性；
疟原虫通用引物和探针对应的检验样本Ct<35，并有明显扩增曲线，判断为疟原虫荧光PCR检测阳性。可使用症原虫种特异性引物和探针进行进一步的症原虫种类鉴定；原虫通用引物和探针对应的检验样本Ct值大于35且小于40的标本应重做。若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判断为症原虫荧光PCR检测阳性，否则为阴性。2症原虫种特异性引物探针检测结果判定10.3.2
根据以下条件进行结果判定：
某种种类症原虫引物和探针对应的检验样本无明显扩增曲线，且检测不到Ct值时，判断为该种类症原虫荧光PCR检测阴性：
某种种类症原虫引物和探针对应的检验样本Ct<35，并有明显扩增曲线，判断为该种类原虫荧光PCR检测阳性；
某种种类症原虫引物和探针对应的检验样本Ct值大于35且小于40的标本应重做。若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判断为该种类症原虫荧光PCR检测阳性，否则为阴性。S
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。