SN/T 4824-2017
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标准简介
SN/T 4824-2017.Detection method for Akabane virus of bovine and ovine by LAMP.
1范围
SN/T 4824规定了牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法。
SN/T 4824适用于牛羊赤羽病病毒核酸现场快速初筛检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 18088 出入境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AKAV赤羽病病毒( Akabane virus)
LAMP环介导等温扩增(Loop- mediated isothermal amplification)
4赤羽病概况
赤羽病病毒为单股RNA病毒,属布尼病毒科布尼病毒属,由其引发的赤羽病概况参见附录A.
5试剂
5.1 RNA抽提试剂盒。
5.2 Bst DNA聚合酶。
5.3 Betaine 甜菜碱。
5.4 0.01 mol/L PBS缓冲液(见附录B)。
5.510X Thermopol缓冲液。
6设备与材料
6.1冷冻离心机。
6.2 恒温水浴箱。
6.3 生物安全柜。
6.4 移液器
7原理
根据AKAV特异性S基因6个特异区域设计两对引物,在具有连置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下，由4条引物识别靶序列上的6个特定区域(参见C.1).在63℃左右对核酸进行等温扩增。扩增产物加入染料后阳性孔会出现肉眼可见的绿色。
1范围
SN/T 4824规定了牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法。
SN/T 4824适用于牛羊赤羽病病毒核酸现场快速初筛检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 18088 出入境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AKAV赤羽病病毒( Akabane virus)
LAMP环介导等温扩增(Loop- mediated isothermal amplification)
4赤羽病概况
赤羽病病毒为单股RNA病毒,属布尼病毒科布尼病毒属,由其引发的赤羽病概况参见附录A.
5试剂
5.1 RNA抽提试剂盒。
5.2 Bst DNA聚合酶。
5.3 Betaine 甜菜碱。
5.4 0.01 mol/L PBS缓冲液(见附录B)。
5.510X Thermopol缓冲液。
6设备与材料
6.1冷冻离心机。
6.2 恒温水浴箱。
6.3 生物安全柜。
6.4 移液器
7原理
根据AKAV特异性S基因6个特异区域设计两对引物,在具有连置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下，由4条引物识别靶序列上的6个特定区域(参见C.1).在63℃左右对核酸进行等温扩增。扩增产物加入染料后阳性孔会出现肉眼可见的绿色。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4824—2017
牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法
Detection method for Akabane virus of bovine and ovine by LAMP2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、华南农业大学SN/T4824—2017
本标准主要起草人：鱼海琼、蔡先全、程珏益、贾坤、赵吟、王莹，田纯见、陈芳、陈茹、林志雄I
1范围
牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法
本标准规定了牛、羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法。本标准适用于牛、羊赤羽病病毒核酸现场快速初筛检测。规范性引用文件
SN/T4824—2017
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088
出入境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AKAV赤羽病病毒（Akabanevirus）LAMP环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification）4赤羽病概况
赤羽病病毒为单股RNA病毒，属布尼病毒科布尼病毒属，由其引发的赤羽病概况参见附录A。5试剂
RNA抽提试剂盒。
Bst DNA聚合酶。
Betaine甜菜碱。
0.01mol/LPBS缓冲液（见附录B）。5.5
10xThermopol缓冲液。
100mmol/LMgSO.。
10mmol/LdNTP
5XAMVBuffer及AMVRTase
AKAV细胞培养物（灭活）。
内引物（FIP+BIP）。
外引物（F3+B3）。
RNasin
SN/T4824—2017
设备与材料
6.1冷冻离心机。
恒温水浴箱。
生物安全柜。
移液器。
7原理
根据AKAV特异性S基因6
6个特异区域设计两对引物，在具有链置换活性的BstDNA聚合酶的作用下，由4条引物识别靶序列上的6个特定区域（参见C.1），在63℃左右对核酸进行等温扩增。扩增产物加入染料后阳性孔会出现肉眼可见的绿色8
操作步骤
引物序列
参见C.2。
样品的采集与前处理
采样参照GB/T18088进行
程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴手套，在具备相应生物安全条件的区域内按照生物安全要求进行操作。8.2.2
死胎或组织样品
用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.09于研钵中或超声裂解仪器中充分研磨裂解，再加5.0mLPBS混匀.然后将组织悬液转人无菌8.2.3血液
用无菌注射器直接吸取200uL
8.2.4存放与运送
ml离心管中，离心取上清，编号备用。500血液至无菌
mL离心管中，抗凝，编号备用。采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存不超过24h：若需长期保存，须放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融采集的样品密封后，冷链运送到实验室。8.3扩增试剂准备与配制
8.3.1核酸提取
移取200μL正常细胞培养物作为阴性对照，移取等量DEPC水作为空白对照。将200μL处理好的待检样品移至1.5mL离心管中。最后移取经过灭活处理的AKAV细胞培养液至另外的1.5mL离心管中作为阳性对照，按照核酸提取试剂盒要求提取病毒RNA。2
8.3.2cDNA模板的制备
SN/T4824—2017
将8.3.1中提取的RNA按照表1所列反转录体系加入各成分.总体积为20μL.混勾后置于42℃水浴1h，反应产物置于一20℃保存或立即进行扩增，表1
5XAMV Buffer
随机引物
RNasin
提取的RNA
AMVRTase
8.4扩增加样
反转录体系
体积（浓度）
2 μL(10 pmol/μL)
μL(30pmol/μL)
1μL(20U)
1pL(5U)
记录样本摆放顺序，按表2所示体系加样，最后加对应浓度的引物和模板。按照空白对照、阴性对照、被检样品、阳性对照的顺序依次加样，也可直接选取商品化LAMP反应试剂盒，按照试剂盒要求添加各项组分（包括染料）及设置反应条件
反应体系
表2LAMP
RT-LAMP反应液组分
10XThermopol Buf
dNTP(1ommol/L
MgSO,(100mmol)
FIP+BIP(4OμmolL
F3+B3(10μmol/L
Betaine
BstDNA聚合酶
CDNA模板或样品
总体积www.bzxz.net
8.5加入染料
体积（反应）/L
轻轻混勾离心管中的反应液，给每个反应管中加人1uLSYBRGreenl染料。8.6
SLAMP扩增
将离心管放人63℃水浴锅扩增60min。SN/T4824—2017
结果判定的条件
LAMP阳性对照有绿色颜色变化产生，阴性和空白对照无绿色颜色出现时方可判定被检样品的结果。
结果判定
8.7.2.1LAMP产物管中呈现绿色颜色变化，表明样品中AKAV核酸初筛阳性，可采用其他方法进步确认。
LAMP产物管不呈现绿色颜色变化，表明样品中AKAV核酸初筛阴性8.7.2.2
A.1病原
附录A
（资料性附录）
疫病概况
SN/T4824—2017
赤羽病（Akabanedisease）由赤羽病病毒（Akabanevirus，AKAV）引起。该病毒属布尼病毒科布尼病毒属，为单股RNA病毒，病毒呈球形，直径为90nm～100nm，有囊膜。囊膜上有糖蛋白组成的5nm~10nm的纤突。该病毒不耐热，对乙醚和三氯甲烷敏感。0.1%的β丙内酯在4℃下于3d内将其灭活。病毒于pH6.010.0之间稳定，易被脂溶剂、紫外线和去垢剂等灭活，Mg2+不能提高其抵抗力。赤羽病病毒能在仓鼠肾细胞、HmLu-1、Vero、PK-15、BHK-21、RK-13等细胞上生长，其中能引起HmLu-1、Vero和BHK-21细胞明显的细胞病变。临床症状和流行病学
赤羽病是牛，羊的多型性急性传染病，又称阿卡斑病，该病以流产，早产、死胎、畸形胎和木乃伊胎等为特征，有些新生幼仔还会发生关节弯曲和积水性无脑综合症。该病是一种重要的虫媒病毒病，也是出人境口岸牛、羊检疫的重要外来病之一。该病于20世纪30年代即在澳大利亚的牛、绵羊、山羊群中流行，随后在日本亦有报道。1959年首次在日本群马县阿卡斑村的骚扰伊蚊和三带喙库蚊体内分离到株病毒。
SN/T4824—2017
附录B
（规范性附录）
试剂配制
磷酸盐缓冲液（PBS0.01mol/L.pH7.2）：磷酸二氢钾0.20g，碳酸氢钠1.15g，氯化钠8.00g，氯化钾0.20g，双蒸水加至1000mL，（121土2)℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、链霉素各10000IU/mL，2℃～8℃保存备用。6
C.1LAMP扩增位点示意及扩增序列F3
附录C
（资料性附录）
参考序列
SN/T4824—2017
CCCAGTACACTGCAAATCCAGTGTCAGACACTGCCTTTACGCTTCACCGCATCTCGGGGGGTCATGTGACGTTTAGGTCACAGTCTGTGACGGAAATGCGAAGTGGCGTAGAGCCCCTACTTAGCTCGCTGGGTTGCTGAGCAGTGCAAGGCTAATCAGATCAAATTTGCAGAGGATGAATCGAGCGACCCAACGACTCGTCACGTTCCGATTAGTCTAGTTTAAACGTCTCBle
GCAGCTGCCACAATTGTGATGCCACTGGTTGAGGTGAAGGGTTGCACTTGGAGTGACGCGTCGACGGTGTTAACACTACGGTGACCAACTCCACTTCCCAACGTGAACCTCACTGCB2
GGTATGCAATGTACCT
CCATACGTTACATGGA
LAMP引物序列
Primer
FIP(F1e-F2)
BIP(BIc-B2）
CCCAGTACACTGCAAATCCA
AGGTACATTGCATACCCGTC
Sequence(5'-3\）
CTGCTCAGCAACCCAGCGAGTGTCAGACACTGCCTTTACGGCAGAGGCAGCTGCCACAATACTCCAGGTGCAACCCTT
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牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法
Detection method for Akabane virus of bovine and ovine by LAMP2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、华南农业大学SN/T4824—2017
本标准主要起草人：鱼海琼、蔡先全、程珏益、贾坤、赵吟、王莹，田纯见、陈芳、陈茹、林志雄I
1范围
牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法
本标准规定了牛、羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法。本标准适用于牛、羊赤羽病病毒核酸现场快速初筛检测。规范性引用文件
SN/T4824—2017
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088
出入境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AKAV赤羽病病毒（Akabanevirus）LAMP环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification）4赤羽病概况
赤羽病病毒为单股RNA病毒，属布尼病毒科布尼病毒属，由其引发的赤羽病概况参见附录A。5试剂
RNA抽提试剂盒。
Bst DNA聚合酶。
Betaine甜菜碱。
0.01mol/LPBS缓冲液（见附录B）。5.5
10xThermopol缓冲液。
100mmol/LMgSO.。
10mmol/LdNTP
5XAMVBuffer及AMVRTase
AKAV细胞培养物（灭活）。
内引物（FIP+BIP）。
外引物（F3+B3）。
RNasin
SN/T4824—2017
设备与材料
6.1冷冻离心机。
恒温水浴箱。
生物安全柜。
移液器。
7原理
根据AKAV特异性S基因6
6个特异区域设计两对引物，在具有链置换活性的BstDNA聚合酶的作用下，由4条引物识别靶序列上的6个特定区域（参见C.1），在63℃左右对核酸进行等温扩增。扩增产物加入染料后阳性孔会出现肉眼可见的绿色8
操作步骤
引物序列
参见C.2。
样品的采集与前处理
采样参照GB/T18088进行
程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴手套，在具备相应生物安全条件的区域内按照生物安全要求进行操作。8.2.2
死胎或组织样品
用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.09于研钵中或超声裂解仪器中充分研磨裂解，再加5.0mLPBS混匀.然后将组织悬液转人无菌8.2.3血液
用无菌注射器直接吸取200uL
8.2.4存放与运送
ml离心管中，离心取上清，编号备用。500血液至无菌
mL离心管中，抗凝，编号备用。采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存不超过24h：若需长期保存，须放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融采集的样品密封后，冷链运送到实验室。8.3扩增试剂准备与配制
8.3.1核酸提取
移取200μL正常细胞培养物作为阴性对照，移取等量DEPC水作为空白对照。将200μL处理好的待检样品移至1.5mL离心管中。最后移取经过灭活处理的AKAV细胞培养液至另外的1.5mL离心管中作为阳性对照，按照核酸提取试剂盒要求提取病毒RNA。2
8.3.2cDNA模板的制备
SN/T4824—2017
将8.3.1中提取的RNA按照表1所列反转录体系加入各成分.总体积为20μL.混勾后置于42℃水浴1h，反应产物置于一20℃保存或立即进行扩增，表1
5XAMV Buffer
随机引物
RNasin
提取的RNA
AMVRTase
8.4扩增加样
反转录体系
体积（浓度）
2 μL(10 pmol/μL)
μL(30pmol/μL)
1μL(20U)
1pL(5U)
记录样本摆放顺序，按表2所示体系加样，最后加对应浓度的引物和模板。按照空白对照、阴性对照、被检样品、阳性对照的顺序依次加样，也可直接选取商品化LAMP反应试剂盒，按照试剂盒要求添加各项组分（包括染料）及设置反应条件
反应体系
表2LAMP
RT-LAMP反应液组分
10XThermopol Buf
dNTP(1ommol/L
MgSO,(100mmol)
FIP+BIP(4OμmolL
F3+B3(10μmol/L
Betaine
BstDNA聚合酶
CDNA模板或样品
总体积www.bzxz.net
8.5加入染料
体积（反应）/L
轻轻混勾离心管中的反应液，给每个反应管中加人1uLSYBRGreenl染料。8.6
SLAMP扩增
将离心管放人63℃水浴锅扩增60min。SN/T4824—2017
结果判定的条件
LAMP阳性对照有绿色颜色变化产生，阴性和空白对照无绿色颜色出现时方可判定被检样品的结果。
结果判定
8.7.2.1LAMP产物管中呈现绿色颜色变化，表明样品中AKAV核酸初筛阳性，可采用其他方法进步确认。
LAMP产物管不呈现绿色颜色变化，表明样品中AKAV核酸初筛阴性8.7.2.2
A.1病原
附录A
（资料性附录）
疫病概况
SN/T4824—2017
赤羽病（Akabanedisease）由赤羽病病毒（Akabanevirus，AKAV）引起。该病毒属布尼病毒科布尼病毒属，为单股RNA病毒，病毒呈球形，直径为90nm～100nm，有囊膜。囊膜上有糖蛋白组成的5nm~10nm的纤突。该病毒不耐热，对乙醚和三氯甲烷敏感。0.1%的β丙内酯在4℃下于3d内将其灭活。病毒于pH6.010.0之间稳定，易被脂溶剂、紫外线和去垢剂等灭活，Mg2+不能提高其抵抗力。赤羽病病毒能在仓鼠肾细胞、HmLu-1、Vero、PK-15、BHK-21、RK-13等细胞上生长，其中能引起HmLu-1、Vero和BHK-21细胞明显的细胞病变。临床症状和流行病学
赤羽病是牛，羊的多型性急性传染病，又称阿卡斑病，该病以流产，早产、死胎、畸形胎和木乃伊胎等为特征，有些新生幼仔还会发生关节弯曲和积水性无脑综合症。该病是一种重要的虫媒病毒病，也是出人境口岸牛、羊检疫的重要外来病之一。该病于20世纪30年代即在澳大利亚的牛、绵羊、山羊群中流行，随后在日本亦有报道。1959年首次在日本群马县阿卡斑村的骚扰伊蚊和三带喙库蚊体内分离到株病毒。
SN/T4824—2017
附录B
（规范性附录）
试剂配制
磷酸盐缓冲液（PBS0.01mol/L.pH7.2）：磷酸二氢钾0.20g，碳酸氢钠1.15g，氯化钠8.00g，氯化钾0.20g，双蒸水加至1000mL，（121土2)℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、链霉素各10000IU/mL，2℃～8℃保存备用。6
C.1LAMP扩增位点示意及扩增序列F3
附录C
（资料性附录）
参考序列
SN/T4824—2017
CCCAGTACACTGCAAATCCAGTGTCAGACACTGCCTTTACGCTTCACCGCATCTCGGGGGGTCATGTGACGTTTAGGTCACAGTCTGTGACGGAAATGCGAAGTGGCGTAGAGCCCCTACTTAGCTCGCTGGGTTGCTGAGCAGTGCAAGGCTAATCAGATCAAATTTGCAGAGGATGAATCGAGCGACCCAACGACTCGTCACGTTCCGATTAGTCTAGTTTAAACGTCTCBle
GCAGCTGCCACAATTGTGATGCCACTGGTTGAGGTGAAGGGTTGCACTTGGAGTGACGCGTCGACGGTGTTAACACTACGGTGACCAACTCCACTTCCCAACGTGAACCTCACTGCB2
GGTATGCAATGTACCT
CCATACGTTACATGGA
LAMP引物序列
Primer
FIP(F1e-F2)
BIP(BIc-B2）
CCCAGTACACTGCAAATCCA
AGGTACATTGCATACCCGTC
Sequence(5'-3\）
CTGCTCAGCAACCCAGCGAGTGTCAGACACTGCCTTTACGGCAGAGGCAGCTGCCACAATACTCCAGGTGCAACCCTT
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