SN/T 4823-2017
基本信息
标准号： SN/T 4823-2017
中文名称：牛凝血因子XI缺失症巢式PCR检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4823-2017.Detection method for bovine factor XI deficiency by nested PCR.
1范围
SN/T 4823规定了牛凝血因子XI缺失症的巢式PCR检测方法。
SN/T 4823适用于牛凝血因子XI缺失症(参见附录A)的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 18088出 人境动物检疫采样
3缩略语
以下缩略语适用于本文件。
FXID凝血因子 XI缺失症(Factor XI deficiency)
nPCR巢式聚 合酶链式反应(Nested polymerase chain reaction)
ACD酸性柠檬酸 葡萄糖溶液
PBS磷酸 盐缓冲液
DNA脱氧核 糖核酸
4试剂
4.1 ACD(配制见附录 B)。
4.2 蛋白酶K.
4.310%SDS.
4.4酚:三氯甲烷:异戊醇(25: 24 : 1)混合液。
4.5无水乙醇。
4.6Tris饱和酚。
5仪器与设备
5.1 高速离心机。
5.2 恒温水浴锅:保持水温37℃士1℃.
5.3微量移液器:1μL~10μL .10μL~100μL.20 μL~200 μL.100 μL~100μL。
5.4 振荡器。
5.5 pH计。
5.6 PCR 仪。
5.7电泳仪。
5.8凝胶成像仪或紫外透射仪。
1范围
SN/T 4823规定了牛凝血因子XI缺失症的巢式PCR检测方法。
SN/T 4823适用于牛凝血因子XI缺失症(参见附录A)的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 18088出 人境动物检疫采样
3缩略语
以下缩略语适用于本文件。
FXID凝血因子 XI缺失症(Factor XI deficiency)
nPCR巢式聚 合酶链式反应(Nested polymerase chain reaction)
ACD酸性柠檬酸 葡萄糖溶液
PBS磷酸 盐缓冲液
DNA脱氧核 糖核酸
4试剂
4.1 ACD(配制见附录 B)。
4.2 蛋白酶K.
4.310%SDS.
4.4酚:三氯甲烷:异戊醇(25: 24 : 1)混合液。
4.5无水乙醇。
4.6Tris饱和酚。
5仪器与设备
5.1 高速离心机。
5.2 恒温水浴锅:保持水温37℃士1℃.
5.3微量移液器:1μL~10μL .10μL~100μL.20 μL~200 μL.100 μL~100μL。
5.4 振荡器。
5.5 pH计。
5.6 PCR 仪。
5.7电泳仪。
5.8凝胶成像仪或紫外透射仪。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4823—2017
牛凝血因子风缺失症巢式
PCR检测方法
Detection method for bovine factor XI deficiency by nested PCR2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4823—2017
请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：马保华、刘中勇、李贺、贾广乐、吴晓薇、邱索平、朱事康、朱道中、刘志玲、林志雄。
1范围
牛凝血因子缺失症巢式
PCR检测方法
本标准规定了牛凝血因子X缺失症的巢式PCR检测方法。本标准适用于牛凝血因子X缺失症（参见附录A)的筛查。2
规范性引用文件
SN/T4823—2017Www.bzxZ.net
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样
缩略语
以下缩略语适用于本文件。
凝血因子X缺失症（FactorXIdeficiency）巢式聚合酶链式反应（Nestedpolymerasechainreaction）酸性柠檬酸葡萄糖溶液
磷酸盐缓冲液
脱氧核糖核酸
脱氧核糖核苷三磷酸
核酸电泳缓冲液
ACD（配制见附录B)。
蛋白酶K。
10%SDS。
酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)混合液。无水乙醇。
Tris饱和酚。
75%乙醇。
TE缓冲液。
PfuDNAPolymerase酶或TaqDNA聚合酶。PCRBuffer。
dNTP。
2%的琼脂糖溶液。
DNA分子量标记物（Marker）。
SN/T4823—2017
5仪器与设备
高速离心机。
恒温水浴锅：保持水温37℃土1℃。5.2
微量移液器：1μL~10μ，10μ~100μl，20μ~200μ100μ~1000μ。振荡器。
5.5pH计。
5.6PCR仪。
电泳仪。
凝胶成像仪或紫外透射仪。
样品采集、处理、核酸提取
样品采集与预处理
按照GB/T18088进行。采血500μL，采集的血样立即与ACD混和均匀，冷藏运输与保存。若血样很快（一个月之内）提取DNA，可将其放于一20℃保存，如果长期保存，可将其放在一80℃。样品避免反复冻融。
6.2核酸提取
6.2.1将血液样品200aL，加人2ml塑料离心管中，加20μL蛋白酶K，再加SDS至终浓度为1%，上下颠倒混匀。
6.2.2混合液置于55℃.水浴2.5h6.2.3向匀浆液中按1：1比例加酚12000r/min离心5min。
24：1)，轻轻震荡混匀5min，
氯甲烷/异戊醇混合液（25：
6.2.4吸上层水相800μL于一灭菌塑料离心管中再次加入等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min，12000r/min离心5min6.2.5吸上层水相500μL于一塑料离心管中，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置2h或液氮中放置5min；12000r/min离心5min，沉淀DNA，倾去上清液。2500uL，轻轻混匀后
6.2.6向沉淀中加人75%乙醇溶液6.2.7向DNA沉淀中加100μLTE缓冲液，溶解沉淀000/min离心5min，倾去上清液，室温凉干。-20℃保存备用
注：DNA提取也可采用等效组织DNA提取试剂盒，按照说明书进行7
巢式PCR
巢式PCR扩增引物
P1:5\-GTGTTGAAGGGTGGAAAAAGTATTCATTG-3P2:5'-CTTTGCAGCCCTTCTCCCTTTTTAATG-3'P3:5\-GTCGAGTCACCTAATGTGTTG-3\P4:5-CCGTACCTGTGTAATTCATTGTC-3引物储存浓度10μmol/L，使用时终浓度为0.2μmol/L。外部引物对（P1、P2)扩增产物长度为540bp(616bp）：内部引物对（P3、P4）扩增产物长度为181bp（257bp）。7.2对照设立
从样品处理开始，应设置FXID野生型对照、FXID突变型对照和空白对照。2
空白对照：在扩增反应阶段设置，以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。7.3反应体系
采用25L反应体系，按照表1配制表1
引物（浓度为10pmol/L)
10 XPfu Buffer
dNTPMixture(2.5mmol/L)
PfuDNAPolymerase酶或TaqDNA聚合酶（2.5U/μL）ddHo
模板DNA
SN/T4823—2017
上下游引物各0.5μL
可采用其他等效商品化PCR反应试剂.PCR缓冲液Tag酶等用量按照试剂说明书使用7.4初始PCR
将PCR管放PCR仪，反应条件设定：94C预变性3min；94℃变性30s.66℃退火30s.68℃延伸20s.30个循环；68℃10min。
7.5巢式PCR扩增
以第一次PCR产物稀释100倍作为第二次PCR反应的模板将PCR管放人PCR仪，反应条件设定：94℃预变性3min：94℃变性30s，58.8℃退火305.67℃延伸15s.30个循环；67℃10min。7.6电泳检测
使用2%琼脂糖凝胶，采用Goldview或其他等效核酸染DNAMarker，5V/cm~8V/em，
电泳1h，用凝胶成像系统仪或紫外透射仪观察，拍照记录检测结果。8结果分析与判定
8.1对照结果
阴性对照未出现预期大小的扩增条带，空白对照未出现预期大小的扩增条带：阳性对照出现预期大小的扩增条带。以上指标有一项不符合，本次实验无效，需要重做8.2检测结果判定
套式PCR后，若只得到181bp左右的条带.则可判断为检测结果阴性，样品不是FXID携带者。若只得到257bp左右的条带，则可判断为FXID突变型：若得到257bp和181bp左右的两条带，则可判断为FXID杂合型；这两种结果都表明样品是FXID携带者。8.3巢式PCR检测结果的确证
可对巢式PCR扩增产物进行测序确证。因突变型序列的76bp插人的核苷酸序列主要由腺嘌呤（A）构成，测序信号较易发生中断，采用P3、P4两条引物同时测序，对结果进行拼接，对测序结果运用计算机软件进行分析。将所测得的序列与标准序列（参见附录C）进行比较，序列吻合（扩增区全序列比对同源性达95%以上）表明确证为阳性。3
SN/T4823—2017
附录A
（资料性附录）
牛凝血因子X缺失症
凝血因子X是一种丝氨酸蛋白酶原，在肝脏中合成，主要参与内源性凝血途径，凝血因子X的缺乏造成凝血障碍。1969年，Kociba等首次报道了美国两例荷斯坦母牛凝血因子X缺乏症病例。此后，在多国相继发现荷斯坦奶牛凝血因子XI缺乏症病例。FXID遗传学基础是由于位于第27号染色体的凝血因子XI外显子12上发生的一段76bp序列插入［AT（A）28TAAAG（A）26GGAAATAATAATTCAJ所致（Marronetal,2004）。这段插人的核苷酸序列主要由腺嘌吟构成，因此编码区位置形成了强终止子，阻碍了基因表达，从而不能合成具有完整序列的蛋白质，影响凝血酶原激酶的合成，导致凝血因子X的活性降低。奶牛凝血因子XI缺乏症没有明显的症状，部分个体表现为凝血时间延长、牛奶中带血和贫血等。部分患牛的繁殖性能异常，如屡配不孕、发情周期不稳定、卵泡直径小、排卵前血液中雌激素含量峰值降低、卵泡发育不完善和黄体溶解缓慢等。由于患牛抗病力下降，易患乳房炎、子宫炎和肺炎等，嗜中性粒细胞增多，产特率和特牛存活率降低，导致严重的经济损失B.1ACD(酸性柠檬酸葡萄糖溶液
附录B
（规范性附录）
溶液的配制
SN/T4823—2017
柠檬酸0.48g，柠檬酸钠1.32g，葡萄糖1.47g，加水至100mL，灭菌后4℃保存备用。每6mL新鲜血中加人1mLACD抗凝剂。
蛋白酶K（20mg/mL）
2g蛋白酶K加人100mL灭菌超纯水，1mL分装，一20℃保存310%SDS(10%十二烷基磺酸钠）
称取SDS（电泳级纯）2g，加超纯水20mL，加热至68℃助溶，加几滴HCl将pH值调至7.2。酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）B.4
苯酚100mL，三氯甲烷96mL：异戊醇4mL。51mol/LTris-HCI缓冲液
在800mL水中溶解121.1gTris碱.加人浓HCl调节pH值至8.0.加超纯水定容至1000mL，分装后高压灭菌。
B.60.5mol/LEDTA(pH8.0)
称取乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H，O)18.61g，NaOH约2g，加水至80mL，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，完全溶解后定容至100mL.高压灭菌。B.7
TE缓冲溶液（Tris-EDTAbuffer solution）量取下列溶液于500mL烧杯中：1mol/LTris-HCIBuffer（pH8.0）5mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)1mL，向烧杯中加人约400mLddH2O均匀混合；将溶液定容到500mL后，高温高压灭菌：室温保存。
50×TAE缓冲液（pH8.5）
Tris碱
冰醋酸
SN/T4823—2017
0.5mol/L的EDTA(pH8.0）100mL
1×TAE缓冲液（pH8.5）
取20mL的50×TAE缓冲液（pH8.5），加灭菌双蒸水或去离子水定容至1000mL。2%琼脂糖凝胶溶液
称取琼脂糖2g、10×TAE20mL、Goldview5μL和超纯水100mL（注意：所配制的琼脂糖凝胶溶液中的缓冲液应与电泳缓冲液的浓度一致）。6
附录C
（资料性附录）
FactorXI部分序列
SN/T4823—2017
C.1FXI部分序列，初始PCR扩增540bp或616bp(FactorXI缺失症），红色标注为插人序列。GTGTTGAAGGGTGGAAAAAG TATTCATTGA TGTTTTTGTG TTTAATATAA51
GGTAAATGATAGCCCAGGAC CTTCCATAAA AGAGGACTATGTGACTGAAA101 AATCTTAGCAGAAAATCACTTCTTTCCACC TAAAAGCCCCCCACTGGCTA151GGAATCATTAGTTAAATAGCACTGTATCTCAAAAGGTTGGGAATTACTTG201CTAACGGAAT TCTCTTTTCC TCTCTTGCTT ACTCCTTAGG GTCAAGTCAC251CTAATGTGTTGCGTGTCTATAGCGGCATTTTGAATCAATCAGAAATAAAA301GAGGATACATCTTTCTTTGG
GGTTCAAGAAATAATAATTCACAT(A)28372TAAAG(A)26GGAAATAATAATTCA)TGATCAATATGAAAAGGCA GAAAGTGGAT446ATGACATTGC CTTGTTGAAA CTAGAAACGGCAATGAATTATACAGGTACG496GGAAACTTTAAACAGAACGT TGTCTACAGTGATGCCGGGCTTCACACTCC546CAGGTTCCTGGCCTGACCTGGCAGTCCCTCCATGTATTACTGTCATTAAA596AAGGGAGAAGGGCTGCAAAG
FXI部分序列，套式PCR扩增181bp或257bp(FactorXI缺失症），红色标注为插入序列。GTCAAGTCACCTAATGTGTTGCGTGTCTATAGCGGCATTTTGAATCAATCAGAAATAAAAGAGGATACATCTTTCTTTGGGGTTCAAGAAATAATAATTCA(AT(A)28TAAAG(A)26GGAAATAATAATTCA)TGATCAATATGAAAAGGCAGAAAGTGGAT ATGACATTGCCTTGTTGAAACTAGAAACGG CAATGAATTATACGGGTACGG
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牛凝血因子风缺失症巢式
PCR检测方法
Detection method for bovine factor XI deficiency by nested PCR2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4823—2017
请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：马保华、刘中勇、李贺、贾广乐、吴晓薇、邱索平、朱事康、朱道中、刘志玲、林志雄。
1范围
牛凝血因子缺失症巢式
PCR检测方法
本标准规定了牛凝血因子X缺失症的巢式PCR检测方法。本标准适用于牛凝血因子X缺失症（参见附录A)的筛查。2
规范性引用文件
SN/T4823—2017Www.bzxZ.net
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样
缩略语
以下缩略语适用于本文件。
凝血因子X缺失症（FactorXIdeficiency）巢式聚合酶链式反应（Nestedpolymerasechainreaction）酸性柠檬酸葡萄糖溶液
磷酸盐缓冲液
脱氧核糖核酸
脱氧核糖核苷三磷酸
核酸电泳缓冲液
ACD（配制见附录B)。
蛋白酶K。
10%SDS。
酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)混合液。无水乙醇。
Tris饱和酚。
75%乙醇。
TE缓冲液。
PfuDNAPolymerase酶或TaqDNA聚合酶。PCRBuffer。
dNTP。
2%的琼脂糖溶液。
DNA分子量标记物（Marker）。
SN/T4823—2017
5仪器与设备
高速离心机。
恒温水浴锅：保持水温37℃土1℃。5.2
微量移液器：1μL~10μ，10μ~100μl，20μ~200μ100μ~1000μ。振荡器。
5.5pH计。
5.6PCR仪。
电泳仪。
凝胶成像仪或紫外透射仪。
样品采集、处理、核酸提取
样品采集与预处理
按照GB/T18088进行。采血500μL，采集的血样立即与ACD混和均匀，冷藏运输与保存。若血样很快（一个月之内）提取DNA，可将其放于一20℃保存，如果长期保存，可将其放在一80℃。样品避免反复冻融。
6.2核酸提取
6.2.1将血液样品200aL，加人2ml塑料离心管中，加20μL蛋白酶K，再加SDS至终浓度为1%，上下颠倒混匀。
6.2.2混合液置于55℃.水浴2.5h6.2.3向匀浆液中按1：1比例加酚12000r/min离心5min。
24：1)，轻轻震荡混匀5min，
氯甲烷/异戊醇混合液（25：
6.2.4吸上层水相800μL于一灭菌塑料离心管中再次加入等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min，12000r/min离心5min6.2.5吸上层水相500μL于一塑料离心管中，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置2h或液氮中放置5min；12000r/min离心5min，沉淀DNA，倾去上清液。2500uL，轻轻混匀后
6.2.6向沉淀中加人75%乙醇溶液6.2.7向DNA沉淀中加100μLTE缓冲液，溶解沉淀000/min离心5min，倾去上清液，室温凉干。-20℃保存备用
注：DNA提取也可采用等效组织DNA提取试剂盒，按照说明书进行7
巢式PCR
巢式PCR扩增引物
P1:5\-GTGTTGAAGGGTGGAAAAAGTATTCATTG-3P2:5'-CTTTGCAGCCCTTCTCCCTTTTTAATG-3'P3:5\-GTCGAGTCACCTAATGTGTTG-3\P4:5-CCGTACCTGTGTAATTCATTGTC-3引物储存浓度10μmol/L，使用时终浓度为0.2μmol/L。外部引物对（P1、P2)扩增产物长度为540bp(616bp）：内部引物对（P3、P4）扩增产物长度为181bp（257bp）。7.2对照设立
从样品处理开始，应设置FXID野生型对照、FXID突变型对照和空白对照。2
空白对照：在扩增反应阶段设置，以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。7.3反应体系
采用25L反应体系，按照表1配制表1
引物（浓度为10pmol/L)
10 XPfu Buffer
dNTPMixture(2.5mmol/L)
PfuDNAPolymerase酶或TaqDNA聚合酶（2.5U/μL）ddHo
模板DNA
SN/T4823—2017
上下游引物各0.5μL
可采用其他等效商品化PCR反应试剂.PCR缓冲液Tag酶等用量按照试剂说明书使用7.4初始PCR
将PCR管放PCR仪，反应条件设定：94C预变性3min；94℃变性30s.66℃退火30s.68℃延伸20s.30个循环；68℃10min。
7.5巢式PCR扩增
以第一次PCR产物稀释100倍作为第二次PCR反应的模板将PCR管放人PCR仪，反应条件设定：94℃预变性3min：94℃变性30s，58.8℃退火305.67℃延伸15s.30个循环；67℃10min。7.6电泳检测
使用2%琼脂糖凝胶，采用Goldview或其他等效核酸染DNAMarker，5V/cm~8V/em，
电泳1h，用凝胶成像系统仪或紫外透射仪观察，拍照记录检测结果。8结果分析与判定
8.1对照结果
阴性对照未出现预期大小的扩增条带，空白对照未出现预期大小的扩增条带：阳性对照出现预期大小的扩增条带。以上指标有一项不符合，本次实验无效，需要重做8.2检测结果判定
套式PCR后，若只得到181bp左右的条带.则可判断为检测结果阴性，样品不是FXID携带者。若只得到257bp左右的条带，则可判断为FXID突变型：若得到257bp和181bp左右的两条带，则可判断为FXID杂合型；这两种结果都表明样品是FXID携带者。8.3巢式PCR检测结果的确证
可对巢式PCR扩增产物进行测序确证。因突变型序列的76bp插人的核苷酸序列主要由腺嘌呤（A）构成，测序信号较易发生中断，采用P3、P4两条引物同时测序，对结果进行拼接，对测序结果运用计算机软件进行分析。将所测得的序列与标准序列（参见附录C）进行比较，序列吻合（扩增区全序列比对同源性达95%以上）表明确证为阳性。3
SN/T4823—2017
附录A
（资料性附录）
牛凝血因子X缺失症
凝血因子X是一种丝氨酸蛋白酶原，在肝脏中合成，主要参与内源性凝血途径，凝血因子X的缺乏造成凝血障碍。1969年，Kociba等首次报道了美国两例荷斯坦母牛凝血因子X缺乏症病例。此后，在多国相继发现荷斯坦奶牛凝血因子XI缺乏症病例。FXID遗传学基础是由于位于第27号染色体的凝血因子XI外显子12上发生的一段76bp序列插入［AT（A）28TAAAG（A）26GGAAATAATAATTCAJ所致（Marronetal,2004）。这段插人的核苷酸序列主要由腺嘌吟构成，因此编码区位置形成了强终止子，阻碍了基因表达，从而不能合成具有完整序列的蛋白质，影响凝血酶原激酶的合成，导致凝血因子X的活性降低。奶牛凝血因子XI缺乏症没有明显的症状，部分个体表现为凝血时间延长、牛奶中带血和贫血等。部分患牛的繁殖性能异常，如屡配不孕、发情周期不稳定、卵泡直径小、排卵前血液中雌激素含量峰值降低、卵泡发育不完善和黄体溶解缓慢等。由于患牛抗病力下降，易患乳房炎、子宫炎和肺炎等，嗜中性粒细胞增多，产特率和特牛存活率降低，导致严重的经济损失B.1ACD(酸性柠檬酸葡萄糖溶液
附录B
（规范性附录）
溶液的配制
SN/T4823—2017
柠檬酸0.48g，柠檬酸钠1.32g，葡萄糖1.47g，加水至100mL，灭菌后4℃保存备用。每6mL新鲜血中加人1mLACD抗凝剂。
蛋白酶K（20mg/mL）
2g蛋白酶K加人100mL灭菌超纯水，1mL分装，一20℃保存310%SDS(10%十二烷基磺酸钠）
称取SDS（电泳级纯）2g，加超纯水20mL，加热至68℃助溶，加几滴HCl将pH值调至7.2。酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）B.4
苯酚100mL，三氯甲烷96mL：异戊醇4mL。51mol/LTris-HCI缓冲液
在800mL水中溶解121.1gTris碱.加人浓HCl调节pH值至8.0.加超纯水定容至1000mL，分装后高压灭菌。
B.60.5mol/LEDTA(pH8.0)
称取乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H，O)18.61g，NaOH约2g，加水至80mL，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，完全溶解后定容至100mL.高压灭菌。B.7
TE缓冲溶液（Tris-EDTAbuffer solution）量取下列溶液于500mL烧杯中：1mol/LTris-HCIBuffer（pH8.0）5mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)1mL，向烧杯中加人约400mLddH2O均匀混合；将溶液定容到500mL后，高温高压灭菌：室温保存。
50×TAE缓冲液（pH8.5）
Tris碱
冰醋酸
SN/T4823—2017
0.5mol/L的EDTA(pH8.0）100mL
1×TAE缓冲液（pH8.5）
取20mL的50×TAE缓冲液（pH8.5），加灭菌双蒸水或去离子水定容至1000mL。2%琼脂糖凝胶溶液
称取琼脂糖2g、10×TAE20mL、Goldview5μL和超纯水100mL（注意：所配制的琼脂糖凝胶溶液中的缓冲液应与电泳缓冲液的浓度一致）。6
附录C
（资料性附录）
FactorXI部分序列
SN/T4823—2017
C.1FXI部分序列，初始PCR扩增540bp或616bp(FactorXI缺失症），红色标注为插人序列。GTGTTGAAGGGTGGAAAAAG TATTCATTGA TGTTTTTGTG TTTAATATAA51
GGTAAATGATAGCCCAGGAC CTTCCATAAA AGAGGACTATGTGACTGAAA101 AATCTTAGCAGAAAATCACTTCTTTCCACC TAAAAGCCCCCCACTGGCTA151GGAATCATTAGTTAAATAGCACTGTATCTCAAAAGGTTGGGAATTACTTG201CTAACGGAAT TCTCTTTTCC TCTCTTGCTT ACTCCTTAGG GTCAAGTCAC251CTAATGTGTTGCGTGTCTATAGCGGCATTTTGAATCAATCAGAAATAAAA301GAGGATACATCTTTCTTTGG
GGTTCAAGAAATAATAATTCACAT(A)28372TAAAG(A)26GGAAATAATAATTCA)TGATCAATATGAAAAGGCA GAAAGTGGAT446ATGACATTGC CTTGTTGAAA CTAGAAACGGCAATGAATTATACAGGTACG496GGAAACTTTAAACAGAACGT TGTCTACAGTGATGCCGGGCTTCACACTCC546CAGGTTCCTGGCCTGACCTGGCAGTCCCTCCATGTATTACTGTCATTAAA596AAGGGAGAAGGGCTGCAAAG
FXI部分序列，套式PCR扩增181bp或257bp(FactorXI缺失症），红色标注为插入序列。GTCAAGTCACCTAATGTGTTGCGTGTCTATAGCGGCATTTTGAATCAATCAGAAATAAAAGAGGATACATCTTTCTTTGGGGTTCAAGAAATAATAATTCA(AT(A)28TAAAG(A)26GGAAATAATAATTCA)TGATCAATATGAAAAGGCAGAAAGTGGAT ATGACATTGCCTTGTTGAAACTAGAAACGG CAATGAATTATACGGGTACGG
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