SN/T 4819-2017
基本信息
标准号： SN/T 4819-2017
中文名称：裸鼠过度角化症检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4819-2017.Quarantine protocol for hyperkeratosis in athymic nude mice.
1范围
SN/T 4819规定了裸鼠过度角化症的临床诊断、病原分离与鉴定、组织切片和聚合酶链式反应检测方法。
SN/T 4819适用于裸鼠过度角化症的临床诊断、病原鉴定与检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养 基和试剂的质量要求
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出 人境动物检疫采样
GB 19489实验室生物安 全通用要求
GB/T 27403- -2008 实验室 质量控制规范食品分子生物学检测
3临床诊断
受感染动物全身出现鳞片样黄白色皮屑,粘附于皮肤表面。消瘦,群体发病率达80% ,但死亡率为1%。临床上可根据感染动物全身出现鳞片样黄白色皮屑粘附于皮肤表面的典型症状作初步诊断(参见附录A)
4实验室诊断
4.1 设备、材料和试剂
4.1.1主要设备
4.1.1.1天平:读数精度0.1 g。
4.1.1.2冰箱。
4.1.1.3二氧化碳培养箱。
4.1.1.4恒温水浴锅。
4.1.1.5生物显微镜。
4.1.1.6切片机。
4.1.1.7 II 级生物安全柜。
4.1.1.8红外加热 器。
4.1.1.9台式冷 冻高速离心机。
4.1.1.10 PCR 仪。
4.1.1.11电泳仪。
1范围
SN/T 4819规定了裸鼠过度角化症的临床诊断、病原分离与鉴定、组织切片和聚合酶链式反应检测方法。
SN/T 4819适用于裸鼠过度角化症的临床诊断、病原鉴定与检疫。
2规范性引用文件
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GB/T 4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养 基和试剂的质量要求
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出 人境动物检疫采样
GB 19489实验室生物安 全通用要求
GB/T 27403- -2008 实验室 质量控制规范食品分子生物学检测
3临床诊断
受感染动物全身出现鳞片样黄白色皮屑,粘附于皮肤表面。消瘦,群体发病率达80% ,但死亡率为1%。临床上可根据感染动物全身出现鳞片样黄白色皮屑粘附于皮肤表面的典型症状作初步诊断(参见附录A)
4实验室诊断
4.1 设备、材料和试剂
4.1.1主要设备
4.1.1.1天平:读数精度0.1 g。
4.1.1.2冰箱。
4.1.1.3二氧化碳培养箱。
4.1.1.4恒温水浴锅。
4.1.1.5生物显微镜。
4.1.1.6切片机。
4.1.1.7 II 级生物安全柜。
4.1.1.8红外加热 器。
4.1.1.9台式冷 冻高速离心机。
4.1.1.10 PCR 仪。
4.1.1.11电泳仪。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4819—2017
裸鼠过度角化症检疫技术规范
Quarantine protocol for hyperkeratosis in athymic nude mice2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草言
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4819—2017
本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、福建医科大学附属第一医院，本标准主要起草人：王武军、白泉阳、张强、高丽钦、张体银、郑腾、于师宇、张志灯、熊炜、林素洁。1范围
裸鼠过度角化症检疫技术规范
SN/T4819—2017
本标准规定了裸鼠过度角化症的临床诊断、病原分离与鉴定、组织切片和聚合酶链式反应检测方法。
本标准适用于裸鼠过度角化症的临床诊断、病原鉴定与检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3临床诊断
受感染动物全身出现鳞片样黄白色皮屑，粘附于皮肤表面。消瘦，群体发病率达80%，但死亡率为1%。临床上可根据感染动物全身出现鳞片样黄白色皮屑粘附于皮肤表面的典型症状作初步诊断（参见附录A）
4实验室诊断
4.1设备、材料和试剂
主要设备
天平：读数精度0.1g。
冰箱。
二氧化碳培养箱。
恒温水浴锅。
生物显微镜。
切片机。
Ⅱ级生物安全柜。
红外加热器。
台式冷冻高速离心机。
PCR仪。
电泳仪。
SN/T4819—2017
凝胶成像仪。
灭菌试管。
灭菌吸管。
单道可调微量移液器（2μl～20μ，20μl~200μL，100μL1000μL）及其配套吸头。4.1.2材料和试剂
水：符合GB/T6682中三级水的规格要求。除另有规定，所用试剂均为分析纯普通琼脂绵羊血平板培养基、脑心浸液（BHI)培养基及其琼脂培养基的制备方法参见附录B。革兰染色液。
过氧化氢酶试剂。
细菌生化鉴定管或商品化生化鉴定试剂盒。细菌基因组DNA提取试剂盒
商品化DNA扩增试剂盒：一20℃保存，不要反复冻融扩增牛棒状杆菌16SrRNA基因的1391bp片断的引物序列如下：4.1.2.9
C.bovis16S-F：5-GATCCTGGCTCAGGACGAAC-3C.bovis16S-R：5*-GTTACCAACTTTCATGACGTGAC-34.1.2.10扩增rpoB基因的1167bp片断的引物序列如下：rpoB-F：5'-AAGTTCGAGCGCACCAACCA-3',TPoB-R：5\-TGGCCCACACCTCCATCT-34.1.2.11其他试剂：无水乙醇、琼脂糖（电泳纯）、分子量标准（100bp~1500bp）。4.1.2.12电泳缓冲液、电泳加样缓冲液溴化乙锭（EB）染色液，配制方法参见附录B4.1.2.13牛棒状杆菌标准菌株，由相关菌种保藏机构提供。4.2样品采集
4.2.1用于细菌分离用样品的采集皮肤表面样品采集时，灭菌棉签于灭菌磷酸盐缓冲液中浸泡后打干，在裸鼠背部皮肤涂擦后按4.3.1.1接种。粪便样品采集时，固定颈部皮肤和小鼠尾部，使小鼠竖直，直接将粪便接入灭菌1.5mL离心管中，加人适量灭菌磷酸盐缓冲液后，于40℃保存和运送。采样数量、包装和运输参照GB/T18088。4.2.2组织学样品的采集
使用CO室息法迫杀裸鼠后，眼科手术剪迅速剪下完整的裸鼠背部皮肤（如有血污可在灭菌PBS中漂洗），大小约1.5cm×1.5cm，将其贴在硬纸片上，放人新鲜配制的饱和Bouin氏液中固定24h。4.3细菌分离、培养和鉴定
4.3.1细菌分离、培养和初步鉴定4.3.1.1细菌分离
凡是涉及生物安全的操作和处理均应符合GB19489的相关规定，本病原应在二级生物安全柜内操作。皮肤表面搽拭样品直接划线接种普通琼脂绵羊血平板粪便样品用一次性接种环或经红外加热器灭菌并冷却的接种环蘸取样品后划线接种于普通琼脂绵羊血平板（参见附录B），于37℃5%CO2培养48h，如菌落生长缓慢，可延长至72h后观察，使之形成单个菌落，以供后续鉴定用。2
4.3.1.2增菌培养
SN/T4819—2017
挑取在普通琼脂绵羊血平板上生长的单个可疑菌落分别接种脑心浸液（BHI)培养液和BHI琼脂斜面（参见附录B).37℃5%CO.培养48h。4.3.1.3初步鉴定
4.3.1.3.1培养特性：在37℃5%CO2培养48h后，牛棒状杆菌在普通琼脂绵羊血平板上形成针尖大小，圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、周围无溶血环的菌落。在脑心浸液（BHI）培养基中，培养液上部清亮，底部有丝状沉淀。
4.3.1.3.2革兰染色：取可疑菌落做革兰8的方法进行染色），牛棒状杆菌为革兰阳性。形态不规则，菌体细长，直或微弯，一端常膨大呈棒状，有时呈球杆状，常成排或成簇排列。细胞着色不均，可见节段染色或异染颗粒。4.3.1.3.3初步判断：菌落生长特征、革兰状杆菌。
4.3.2生化鉴定
体形态与上述插述相符合的菌株，可初步确定为牛棒4.3.2.1经4.3.1.3初步确定为牛棒状杆菌的菌株，进行如下生化鉴定试验：溶血实验、水解实验［七叶苷、明胶（25℃）、硝酸盐还原、脲酶、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木糖试验。或店立用商品化的细菌生化鉴定
系统进行生化鉴定。
4.3.2.2牛棒状杆菌上述生化鉴定试验结果参见附录C.为便于同该属其他菌鉴别诊断，同时列出库氏棒状杆菌和伪结核棒状杆菌的主要生化反应特性。4.4组织切片检查
组织切片的制备
取出在Bouin氏固定液中固定的样本，度（50%、70%、80%95%、100%和1O
用刀片将样本修切成约1cm×
水，每级2h
温箱中浸蜡4h：石蜡包埋后切片，厚度5μm4.4.2结果观察
cm×0.5cm大小，酒精梯
甲苯透明40min~45min：于56℃~58℃东木素伊红（HE）染色后，镜检。显微镜下，正常的裸鼠皮肤角质层完整紧附于活性表皮（表皮基底层、棘层、颗粒层和透明层的合称）之上，角质层经HE染色后呈嗜酸性，沿活性表皮呈带状均勾分布。表皮脊隆起.活性表皮细胞排列较为紧密。患病裸鼠皮肤切片中，角质层增厚，表皮棘细胞层和基底层也出现明显增厚，真皮层出现单核细胞浸润。
4.5PCR检测
4.5.1DNA提取
4.5.1.1DNA提取可选用等效的商品化试剂盒或等效的提取方法，下面以TIANGEN\公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANampBacteriaDNAKit）进行DNA提取使用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANampBacteriaDNAKit)只是为了叙述方便，并不1
代表推荐TIANGEN公司的产品，标准的使用者可以使用其他公司的同类产品。3
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4.5.1.2取分离菌的肉汤培养物1mL于1.5mL灭菌离心管中，10000r/min离心1min，沉淀菌体，吸弃上清。
4.5.1.3向菌体沉淀中加人溶菌酶进行破壁处理，具体方法为：加人180μL缓冲液（20mMTris.pH8.0；2mMNaz-EDTA；l.2%Triton：终浓度为20mg/mL的溶菌酶），37℃处理30min。4.5.1.4向管中加人20μLProteinaseK溶液，混匀。4.5.1.5加人220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4.5.1.6加220uL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4.5.1.7将上一步所得溶液和絮状沉淀都加人一个吸附柱CB3中（吸附柱放人收集管中），12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放人收集管中。4.5.1.8向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放人收集管中。
4.5.1.9向吸附柱CB3中加人600μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，倒掉废液，吸附柱CB3放人收集管中
4.5.1.10重复操作步骤4.5.1.9。4.5.1.11将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。4.5.1.12将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min~5min，12000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。可重复洗脱一次。4.5.1.13将DNA提取液进行PCR检测，或于一20℃保存备用。4.5.2PCR扩增
4.5.2.1反应体系
扩增DNA按照TIANGEN公司的DNA扩增试剂盒（2×TaqPCRMasterMix）进行。25μL反应体系内含2×TaqPCRMasterMix反应液12.5μL（含Taq酶1.25U），10μmol/LC.bovis16S-FC.bovis16S-R引物对各1.0μL（或10μmol/LrpoB-F、rpoB-R引物对各1.0μL)，灭菌双蒸水8.5uL，样品或对照模板DNA2μL。
同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照。以阳性标准菌株提取的DNA或人工合成的含目的片段的质粒为阳性对照、以培养基为阴性对照、以灭菌双蒸水作为空白对照。4.5.2.2反应条件
C.bovis16S-F.C.bovis16S-R引物对反应条件：93℃预变性3min，93℃15s.55℃30s，72℃1min，返回第2步，35个循环，72℃10min，4℃保存。rpoB-FrpoB-R引物对反应条件：95℃15min，5个循环（95℃30s，65℃30s，72℃60s），5个循环（95℃30s.60℃30s.72℃60s).35个循环95℃30s，54℃30s，72℃60s）.72℃10min4℃保存。
2）使用TIANGEN公司的2×TaqPCRMasterMixDNA扩增试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐TIANGEN公司的产品，标准的使用者可以使用其他公司的同类产品。4
4.5.3琼脂糖凝胶电泳
SN/T4819—2017
用TBE电泳缓冲液（配制方法参见附录B）配制1%的琼脂糖，加热完全溶解后，制成凝胶平板。待冷却后，将凝胶平板放人水平电泳槽，加入电泳缓冲液至充分没过凝胶面，取下梳子。将5μLPCR产物和1μL电泳加样缓冲液（配制方法参见附录B）混勾后加人凝胶孔中进行电泳。在电泳时设立DNA标准分子量Marker作对照。5V/cm电泳约50min，当溴酚蓝到达凝胶块底部时停止电泳。4.5.4凝胶成像分析和测序
将电泳完毕的凝胶放人含0.5ug/mLEB（配制方法参见附录B）溶液中染色10min~30min后，在水中漂洗凝胶，凝胶成像仪观察和记录。被检样品如在1391bp处或1167bp处有特异性扩增条带的，应切胶回收DNA片段进行测序，参考序列见附录D。
4.5.5结果判定
阴性对照和空白对照无条带，阳性对照分别在1391bp（16SrRNA基因）处或1167bp处（rpoB基因）有特异性扩增条带时，实验成立。被检样品在1391bp处有特异性扩增条带并经测序验证者，为牛棒状杆菌阳性。被检样品在1167bP处有特异性扩增条带并经测序验证者，为牛棒状杆菌阳性。被检样品无条带或条带的大小不是1391bp或1167bp的，为牛棒状杆菌阴性。5综合判断
5.1满足以下条件可判定为裸鼠过度角化症可疑：a）分离到的病原菌菌落培养特性、染色形态与4.3.1中描述相符。b）组织学检查出现典型的棘细胞层增厚。5.2满足以下任何一条均可判定为裸鼠过度角化症阳性：a）临床症状和病理变化符合第3章中的描述：革兰染色为阳性杆菌，呈棒状或球杆状，成排或成簇排列，主要生化特性符合4.3.2中的描述。牛棒状杆菌16SrRNA基因或rpoB基因PCR检测结果为牛棒状杆菌阳性。b
c）组织切片检查结果疑似裸鼠过度角化症的，且同时满足上述判定条件之一者，可判定为裸鼠过度角化症阳性。
6防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403一2008中附录D的规定执行。SN/T4819—2017
附录A
（资料性附录）
裸鼠过度角化症简介
裸鼠过度角化症（Hyperkeratosis）是由牛棒状杆菌（Corynebacteriumbovis）引起裸鼠的过度角化性皮炎和棘皮症。感染动物典型的临床症状为全身出现鳞片样黄白色皮屑，粘附于皮肤表面，俗称“鲜皮病”。该病曾经在日本、美国、意大利的实验动物中暴发，是国外实验动物机构对裸鼠的重点监控疫病之一，我国2010年有从进口实验动物中分离到该病原的报道。该病对裸鼠等特定免疫状态的实验动物具有重要危害，且一旦感染，饲养环境很难彻底清除该病原牛棒状杆菌（Corynebacterium boouis），属棒状杆菌属，为一种形态不规则的革兰阳性杆菌或球杆
菌，形态不规则，常成排或成簇排列。在含1%吐温80的营养琼脂上形成白色至乳白色菌落。为非抗酸性杆菌，菌体细长，直或微弯，一段常膨大呈棒状，细胞着色不均，可见节段染色或异染颗粒。无鞭毛，不运动，也不形成英膜和芽孢。对干燥具有较强抵抗力。培养基中加人血液可促进其生长。免疫功能正常的大小鼠一般不会（长期）携带该病病原，但该菌对于无毛鼠和免疫缺陷鼠致病，一且感染，几乎是终身性携带该菌。发病率可达到80%，但死亡率较低过常，“鳞屑”的暴发提示该病发生，皮肤组织暴学检查可见弥漫性表皮棘细胞层明显增厚，裸鼠于感杂后7d～10d出现上述“鳞屑”症状，该症状会在14d～20d后消失，但发病裸鼠会作为病原细菌的携带者继续感染其他裸鼠，至少要持续30d。对
实验动物的影响表现为体重减轻、摄水量增加、异种移植物生长缓慢、对化疗的敏感性增加、新生鼠死亡率增加等。一旦感染，则非常难以消除底消毒外，动物种群本身至少需要腹产净化，或其他类似胚胎移植等手段。其垂直传播情况尚未见研究报道。美国相关研究提及牛棒状杆菌可能会污染肿瘤组织。携带该病病原但无临床症状的裸鼠，是该病重要的传染源。加强对进境实验动物的动物检疫和监管，将裸鼠过度角化症列入进境实
验动物疫病检疫项目中，是防止该病病原通过进口实验动物传人我国的最为直接和有效的预防措施。羊白色皮屑黏附
于皮肤表面、表皮棘细胞层增厚的典型症状裸鼠过度角化症可根据全身出现鳞片样行细菌培养特性
作初步诊断。确诊需从病灶分离细菌，进行肤组织病理学观察，及对16SrRNArpob鉴定。
革兰染色，生化试验判定，必要时，可进行皮PCR扩增、测序、序列比对等进一步性目的基因进行
普通琼脂绵羊血平板
牛肉膏
蛋白陈
氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KH,PO）
蒸馏水
脱纤维无菌绵羊血
附录B
（资料性附录）
培养基和试剂的配置
1000mL
SN/T4819—2017
除无菌绵羊血外，其他各成分混匀，加热溶解，调至pH7.6后分装人锥形瓶，115℃灭菌15min，冷却至45℃时，加人5%无菌脱纤维绵羊血，混后倾注天菌平板或一次性使用平板。4℃保存备用B.2
脑心浸液（BHI)培养基
蛋白陈
牛脑浸粉
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牛心浸粉
氯化钠
磷酸氢二钠
蒸馏水
将以上各成分混勾，加热煮沸至完全溶解，冷却至室温，调至pH7.4后分装试管，115℃灭菌15min，冷却至室温，4℃保存备用。脑心浸液（BHI)琼脂培养基
在B.2脑心浸液（BHI）培养基中加人15.0g琼脂，各成分混勾，加热煮沸至完全溶解，冷却至室温，调至pH7.4后分装试管，115℃灭菌15min，冷却制成试管斜面，4℃保存备用。B.4TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）Tris
蒸馏水
用5.0mol/L的盐酸调pH到8.0，室温储存。使用时，用蒸馏水10倍稀释至工作浓度。SN/T4819—2017
B.56x电泳加样缓冲液
称取溴酚蓝200mg，加水10mL，室温下过夜溶解：再称取蔗糖50.0g，加水溶解后与溴酚蓝溶液混合均匀：加水定容至100mL，再加人1mol/LNaOH1~2滴，调至蓝色。B.6
SEB染色液
戴手套小心称量200mgEB，转移到棕色广口瓶中，加人20mL水或者TE，搅拌至完全溶解，配制成10mg/mL的浓缩液，于4℃储存。使用时每20mL水或者TE溶液中加入1μL浓缩液，配制成0.5μg/mL的EB染色液。
附录C
（资料性附录）
牛棒状杆菌主要生化反应特性
SN/T4819—2017
牛棒状杆菌、库氏棒状杆菌和伪结核棒状杆菌的主要生化反应特性比较，见表C.1。牛棒状杆菌、库氏棒状杆菌和伪结核棒状杆菌的主要生化反应特性表C.1
β溶血
七叶昔
明胶（25℃）
还原硝酸盐
葡萄糖
麦芽糖
牛棒状杆菌
(C.bovis)
注1：+，阳性反应：一，阴性反应：V.变化不定。库氏棒状杆菌
(C.kutscheri)
伪结核棒状杆菌
(C.pseudotaberculosis)
注2：此表中增列库棒状杆菌、伪结核棒状杆菌的主要生化反应特性，以便于同牛棒状杆菌鉴别。SN/T4819—2017
附录D
（规范性附录）
扩增产物的参考序列
D.1牛棒状杆菌16SrRNA基因扩增产物的1391bp片段的参考序列（9bp~1399bp）gatectggctcaggacgaac
ccccagcttn
tgcactctgg
tgtgcggtgg
gtaatggcet
gactgagaca
gcaagcctga
cggcagggac
agcagccgcg
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牛棒状杆菌rpoB基因扩增产物的1167bp片段的参考序列（1959bp~3125bp）1
aagttcgagc
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裸鼠过度角化症检疫技术规范
Quarantine protocol for hyperkeratosis in athymic nude mice2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草言
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4819—2017
本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、福建医科大学附属第一医院，本标准主要起草人：王武军、白泉阳、张强、高丽钦、张体银、郑腾、于师宇、张志灯、熊炜、林素洁。1范围
裸鼠过度角化症检疫技术规范
SN/T4819—2017
本标准规定了裸鼠过度角化症的临床诊断、病原分离与鉴定、组织切片和聚合酶链式反应检测方法。
本标准适用于裸鼠过度角化症的临床诊断、病原鉴定与检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3临床诊断
受感染动物全身出现鳞片样黄白色皮屑，粘附于皮肤表面。消瘦，群体发病率达80%，但死亡率为1%。临床上可根据感染动物全身出现鳞片样黄白色皮屑粘附于皮肤表面的典型症状作初步诊断（参见附录A）
4实验室诊断
4.1设备、材料和试剂
主要设备
天平：读数精度0.1g。
冰箱。
二氧化碳培养箱。
恒温水浴锅。
生物显微镜。
切片机。
Ⅱ级生物安全柜。
红外加热器。
台式冷冻高速离心机。
PCR仪。
电泳仪。
SN/T4819—2017
凝胶成像仪。
灭菌试管。
灭菌吸管。
单道可调微量移液器（2μl～20μ，20μl~200μL，100μL1000μL）及其配套吸头。4.1.2材料和试剂
水：符合GB/T6682中三级水的规格要求。除另有规定，所用试剂均为分析纯普通琼脂绵羊血平板培养基、脑心浸液（BHI)培养基及其琼脂培养基的制备方法参见附录B。革兰染色液。
过氧化氢酶试剂。
细菌生化鉴定管或商品化生化鉴定试剂盒。细菌基因组DNA提取试剂盒
商品化DNA扩增试剂盒：一20℃保存，不要反复冻融扩增牛棒状杆菌16SrRNA基因的1391bp片断的引物序列如下：4.1.2.9
C.bovis16S-F：5-GATCCTGGCTCAGGACGAAC-3C.bovis16S-R：5*-GTTACCAACTTTCATGACGTGAC-34.1.2.10扩增rpoB基因的1167bp片断的引物序列如下：rpoB-F：5'-AAGTTCGAGCGCACCAACCA-3',TPoB-R：5\-TGGCCCACACCTCCATCT-34.1.2.11其他试剂：无水乙醇、琼脂糖（电泳纯）、分子量标准（100bp~1500bp）。4.1.2.12电泳缓冲液、电泳加样缓冲液溴化乙锭（EB）染色液，配制方法参见附录B4.1.2.13牛棒状杆菌标准菌株，由相关菌种保藏机构提供。4.2样品采集
4.2.1用于细菌分离用样品的采集皮肤表面样品采集时，灭菌棉签于灭菌磷酸盐缓冲液中浸泡后打干，在裸鼠背部皮肤涂擦后按4.3.1.1接种。粪便样品采集时，固定颈部皮肤和小鼠尾部，使小鼠竖直，直接将粪便接入灭菌1.5mL离心管中，加人适量灭菌磷酸盐缓冲液后，于40℃保存和运送。采样数量、包装和运输参照GB/T18088。4.2.2组织学样品的采集
使用CO室息法迫杀裸鼠后，眼科手术剪迅速剪下完整的裸鼠背部皮肤（如有血污可在灭菌PBS中漂洗），大小约1.5cm×1.5cm，将其贴在硬纸片上，放人新鲜配制的饱和Bouin氏液中固定24h。4.3细菌分离、培养和鉴定
4.3.1细菌分离、培养和初步鉴定4.3.1.1细菌分离
凡是涉及生物安全的操作和处理均应符合GB19489的相关规定，本病原应在二级生物安全柜内操作。皮肤表面搽拭样品直接划线接种普通琼脂绵羊血平板粪便样品用一次性接种环或经红外加热器灭菌并冷却的接种环蘸取样品后划线接种于普通琼脂绵羊血平板（参见附录B），于37℃5%CO2培养48h，如菌落生长缓慢，可延长至72h后观察，使之形成单个菌落，以供后续鉴定用。2
4.3.1.2增菌培养
SN/T4819—2017
挑取在普通琼脂绵羊血平板上生长的单个可疑菌落分别接种脑心浸液（BHI)培养液和BHI琼脂斜面（参见附录B).37℃5%CO.培养48h。4.3.1.3初步鉴定
4.3.1.3.1培养特性：在37℃5%CO2培养48h后，牛棒状杆菌在普通琼脂绵羊血平板上形成针尖大小，圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、周围无溶血环的菌落。在脑心浸液（BHI）培养基中，培养液上部清亮，底部有丝状沉淀。
4.3.1.3.2革兰染色：取可疑菌落做革兰8的方法进行染色），牛棒状杆菌为革兰阳性。形态不规则，菌体细长，直或微弯，一端常膨大呈棒状，有时呈球杆状，常成排或成簇排列。细胞着色不均，可见节段染色或异染颗粒。4.3.1.3.3初步判断：菌落生长特征、革兰状杆菌。
4.3.2生化鉴定
体形态与上述插述相符合的菌株，可初步确定为牛棒4.3.2.1经4.3.1.3初步确定为牛棒状杆菌的菌株，进行如下生化鉴定试验：溶血实验、水解实验［七叶苷、明胶（25℃）、硝酸盐还原、脲酶、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木糖试验。或店立用商品化的细菌生化鉴定
系统进行生化鉴定。
4.3.2.2牛棒状杆菌上述生化鉴定试验结果参见附录C.为便于同该属其他菌鉴别诊断，同时列出库氏棒状杆菌和伪结核棒状杆菌的主要生化反应特性。4.4组织切片检查
组织切片的制备
取出在Bouin氏固定液中固定的样本，度（50%、70%、80%95%、100%和1O
用刀片将样本修切成约1cm×
水，每级2h
温箱中浸蜡4h：石蜡包埋后切片，厚度5μm4.4.2结果观察
cm×0.5cm大小，酒精梯
甲苯透明40min~45min：于56℃~58℃东木素伊红（HE）染色后，镜检。显微镜下，正常的裸鼠皮肤角质层完整紧附于活性表皮（表皮基底层、棘层、颗粒层和透明层的合称）之上，角质层经HE染色后呈嗜酸性，沿活性表皮呈带状均勾分布。表皮脊隆起.活性表皮细胞排列较为紧密。患病裸鼠皮肤切片中，角质层增厚，表皮棘细胞层和基底层也出现明显增厚，真皮层出现单核细胞浸润。
4.5PCR检测
4.5.1DNA提取
4.5.1.1DNA提取可选用等效的商品化试剂盒或等效的提取方法，下面以TIANGEN\公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANampBacteriaDNAKit）进行DNA提取使用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANampBacteriaDNAKit)只是为了叙述方便，并不1
代表推荐TIANGEN公司的产品，标准的使用者可以使用其他公司的同类产品。3
SN/T4819—2017
4.5.1.2取分离菌的肉汤培养物1mL于1.5mL灭菌离心管中，10000r/min离心1min，沉淀菌体，吸弃上清。
4.5.1.3向菌体沉淀中加人溶菌酶进行破壁处理，具体方法为：加人180μL缓冲液（20mMTris.pH8.0；2mMNaz-EDTA；l.2%Triton：终浓度为20mg/mL的溶菌酶），37℃处理30min。4.5.1.4向管中加人20μLProteinaseK溶液，混匀。4.5.1.5加人220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4.5.1.6加220uL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4.5.1.7将上一步所得溶液和絮状沉淀都加人一个吸附柱CB3中（吸附柱放人收集管中），12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放人收集管中。4.5.1.8向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放人收集管中。
4.5.1.9向吸附柱CB3中加人600μL漂洗液PW，12000r/min离心30s，倒掉废液，吸附柱CB3放人收集管中
4.5.1.10重复操作步骤4.5.1.9。4.5.1.11将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。4.5.1.12将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min~5min，12000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。可重复洗脱一次。4.5.1.13将DNA提取液进行PCR检测，或于一20℃保存备用。4.5.2PCR扩增
4.5.2.1反应体系
扩增DNA按照TIANGEN公司的DNA扩增试剂盒（2×TaqPCRMasterMix）进行。25μL反应体系内含2×TaqPCRMasterMix反应液12.5μL（含Taq酶1.25U），10μmol/LC.bovis16S-FC.bovis16S-R引物对各1.0μL（或10μmol/LrpoB-F、rpoB-R引物对各1.0μL)，灭菌双蒸水8.5uL，样品或对照模板DNA2μL。
同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照。以阳性标准菌株提取的DNA或人工合成的含目的片段的质粒为阳性对照、以培养基为阴性对照、以灭菌双蒸水作为空白对照。4.5.2.2反应条件
C.bovis16S-F.C.bovis16S-R引物对反应条件：93℃预变性3min，93℃15s.55℃30s，72℃1min，返回第2步，35个循环，72℃10min，4℃保存。rpoB-FrpoB-R引物对反应条件：95℃15min，5个循环（95℃30s，65℃30s，72℃60s），5个循环（95℃30s.60℃30s.72℃60s).35个循环95℃30s，54℃30s，72℃60s）.72℃10min4℃保存。
2）使用TIANGEN公司的2×TaqPCRMasterMixDNA扩增试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐TIANGEN公司的产品，标准的使用者可以使用其他公司的同类产品。4
4.5.3琼脂糖凝胶电泳
SN/T4819—2017
用TBE电泳缓冲液（配制方法参见附录B）配制1%的琼脂糖，加热完全溶解后，制成凝胶平板。待冷却后，将凝胶平板放人水平电泳槽，加入电泳缓冲液至充分没过凝胶面，取下梳子。将5μLPCR产物和1μL电泳加样缓冲液（配制方法参见附录B）混勾后加人凝胶孔中进行电泳。在电泳时设立DNA标准分子量Marker作对照。5V/cm电泳约50min，当溴酚蓝到达凝胶块底部时停止电泳。4.5.4凝胶成像分析和测序
将电泳完毕的凝胶放人含0.5ug/mLEB（配制方法参见附录B）溶液中染色10min~30min后，在水中漂洗凝胶，凝胶成像仪观察和记录。被检样品如在1391bp处或1167bp处有特异性扩增条带的，应切胶回收DNA片段进行测序，参考序列见附录D。
4.5.5结果判定
阴性对照和空白对照无条带，阳性对照分别在1391bp（16SrRNA基因）处或1167bp处（rpoB基因）有特异性扩增条带时，实验成立。被检样品在1391bp处有特异性扩增条带并经测序验证者，为牛棒状杆菌阳性。被检样品在1167bP处有特异性扩增条带并经测序验证者，为牛棒状杆菌阳性。被检样品无条带或条带的大小不是1391bp或1167bp的，为牛棒状杆菌阴性。5综合判断
5.1满足以下条件可判定为裸鼠过度角化症可疑：a）分离到的病原菌菌落培养特性、染色形态与4.3.1中描述相符。b）组织学检查出现典型的棘细胞层增厚。5.2满足以下任何一条均可判定为裸鼠过度角化症阳性：a）临床症状和病理变化符合第3章中的描述：革兰染色为阳性杆菌，呈棒状或球杆状，成排或成簇排列，主要生化特性符合4.3.2中的描述。牛棒状杆菌16SrRNA基因或rpoB基因PCR检测结果为牛棒状杆菌阳性。b
c）组织切片检查结果疑似裸鼠过度角化症的，且同时满足上述判定条件之一者，可判定为裸鼠过度角化症阳性。
6防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403一2008中附录D的规定执行。SN/T4819—2017
附录A
（资料性附录）
裸鼠过度角化症简介
裸鼠过度角化症（Hyperkeratosis）是由牛棒状杆菌（Corynebacteriumbovis）引起裸鼠的过度角化性皮炎和棘皮症。感染动物典型的临床症状为全身出现鳞片样黄白色皮屑，粘附于皮肤表面，俗称“鲜皮病”。该病曾经在日本、美国、意大利的实验动物中暴发，是国外实验动物机构对裸鼠的重点监控疫病之一，我国2010年有从进口实验动物中分离到该病原的报道。该病对裸鼠等特定免疫状态的实验动物具有重要危害，且一旦感染，饲养环境很难彻底清除该病原牛棒状杆菌（Corynebacterium boouis），属棒状杆菌属，为一种形态不规则的革兰阳性杆菌或球杆
菌，形态不规则，常成排或成簇排列。在含1%吐温80的营养琼脂上形成白色至乳白色菌落。为非抗酸性杆菌，菌体细长，直或微弯，一段常膨大呈棒状，细胞着色不均，可见节段染色或异染颗粒。无鞭毛，不运动，也不形成英膜和芽孢。对干燥具有较强抵抗力。培养基中加人血液可促进其生长。免疫功能正常的大小鼠一般不会（长期）携带该病病原，但该菌对于无毛鼠和免疫缺陷鼠致病，一且感染，几乎是终身性携带该菌。发病率可达到80%，但死亡率较低过常，“鳞屑”的暴发提示该病发生，皮肤组织暴学检查可见弥漫性表皮棘细胞层明显增厚，裸鼠于感杂后7d～10d出现上述“鳞屑”症状，该症状会在14d～20d后消失，但发病裸鼠会作为病原细菌的携带者继续感染其他裸鼠，至少要持续30d。对
实验动物的影响表现为体重减轻、摄水量增加、异种移植物生长缓慢、对化疗的敏感性增加、新生鼠死亡率增加等。一旦感染，则非常难以消除底消毒外，动物种群本身至少需要腹产净化，或其他类似胚胎移植等手段。其垂直传播情况尚未见研究报道。美国相关研究提及牛棒状杆菌可能会污染肿瘤组织。携带该病病原但无临床症状的裸鼠，是该病重要的传染源。加强对进境实验动物的动物检疫和监管，将裸鼠过度角化症列入进境实
验动物疫病检疫项目中，是防止该病病原通过进口实验动物传人我国的最为直接和有效的预防措施。羊白色皮屑黏附
于皮肤表面、表皮棘细胞层增厚的典型症状裸鼠过度角化症可根据全身出现鳞片样行细菌培养特性
作初步诊断。确诊需从病灶分离细菌，进行肤组织病理学观察，及对16SrRNArpob鉴定。
革兰染色，生化试验判定，必要时，可进行皮PCR扩增、测序、序列比对等进一步性目的基因进行
普通琼脂绵羊血平板
牛肉膏
蛋白陈
氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KH,PO）
蒸馏水
脱纤维无菌绵羊血
附录B
（资料性附录）
培养基和试剂的配置
1000mL
SN/T4819—2017
除无菌绵羊血外，其他各成分混匀，加热溶解，调至pH7.6后分装人锥形瓶，115℃灭菌15min，冷却至45℃时，加人5%无菌脱纤维绵羊血，混后倾注天菌平板或一次性使用平板。4℃保存备用B.2
脑心浸液（BHI)培养基
蛋白陈
牛脑浸粉
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牛心浸粉
氯化钠
磷酸氢二钠
蒸馏水
将以上各成分混勾，加热煮沸至完全溶解，冷却至室温，调至pH7.4后分装试管，115℃灭菌15min，冷却至室温，4℃保存备用。脑心浸液（BHI)琼脂培养基
在B.2脑心浸液（BHI）培养基中加人15.0g琼脂，各成分混勾，加热煮沸至完全溶解，冷却至室温，调至pH7.4后分装试管，115℃灭菌15min，冷却制成试管斜面，4℃保存备用。B.4TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）Tris
蒸馏水
用5.0mol/L的盐酸调pH到8.0，室温储存。使用时，用蒸馏水10倍稀释至工作浓度。SN/T4819—2017
B.56x电泳加样缓冲液
称取溴酚蓝200mg，加水10mL，室温下过夜溶解：再称取蔗糖50.0g，加水溶解后与溴酚蓝溶液混合均匀：加水定容至100mL，再加人1mol/LNaOH1~2滴，调至蓝色。B.6
SEB染色液
戴手套小心称量200mgEB，转移到棕色广口瓶中，加人20mL水或者TE，搅拌至完全溶解，配制成10mg/mL的浓缩液，于4℃储存。使用时每20mL水或者TE溶液中加入1μL浓缩液，配制成0.5μg/mL的EB染色液。
附录C
（资料性附录）
牛棒状杆菌主要生化反应特性
SN/T4819—2017
牛棒状杆菌、库氏棒状杆菌和伪结核棒状杆菌的主要生化反应特性比较，见表C.1。牛棒状杆菌、库氏棒状杆菌和伪结核棒状杆菌的主要生化反应特性表C.1
β溶血
七叶昔
明胶（25℃）
还原硝酸盐
葡萄糖
麦芽糖
牛棒状杆菌
(C.bovis)
注1：+，阳性反应：一，阴性反应：V.变化不定。库氏棒状杆菌
(C.kutscheri)
伪结核棒状杆菌
(C.pseudotaberculosis)
注2：此表中增列库棒状杆菌、伪结核棒状杆菌的主要生化反应特性，以便于同牛棒状杆菌鉴别。SN/T4819—2017
附录D
（规范性附录）
扩增产物的参考序列
D.1牛棒状杆菌16SrRNA基因扩增产物的1391bp片段的参考序列（9bp~1399bp）gatectggctcaggacgaac
ccccagcttn
tgcactctgg
tgtgcggtgg
gtaatggcet
gactgagaca
gcaagcctga
cggcagggac
agcagccgcg
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atacgggcat
cgcagatatc
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cecgcctggg
tgcttaacac
gctggcggcg
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cgagtggcgaacgggtgagtaaca
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ggaaactgggtetaataccggata
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ggcttca
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gagtcgctag
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tgctttagtg
tgttggtggg
gccacattgg
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gtaaagagct
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gccgtaaacg
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ggcccgcaca
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aagccggtct
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caccgcccgtcacgteatga
牛棒状杆菌rpoB基因扩增产物的1167bp片段的参考序列（1959bp~3125bp）1
aagttcgagc
gaccgcgtcg
gcgctgggca
gcgatcatcc
gagcacgaga
ccgaacgtcg
gccgacgtcc
ctgaccccgg
gcaccaacca
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