SN/T 4828-2017.Quarantine protocol for antibodies against Wesselsbrol disease virus by HI.
1范围
SN/T 4828规定了进出口动物韦塞尔斯布朗病抗体的血凝抑制试验检测方法。
SN/T 4828适用于进出口动物韦塞不斯布朗病抗体的检测
2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PBS:磷酸盐缓冲盐水
HA:血凝试验
HI:血凝抑制试验
HAU:血凝单位
3设备、材料和试剂
3.1设备
3.1.1台式离心机。
3.1.2振荡器。
3.1.3冰箱。
3.1.4恒温箱。
3.1.5微量可调移液器。
3.2材料和试剂
3.2.1 96孔V型微量反应板。
3.2.2含0.4%卵清蛋白的pH7.5PBS和含0.4%卵清蛋白的pH5.7 PBS,配制方法见附录A.
3.2.3阿氏(Alsevers)液,配制方法见附录B的B.1。
3.2.4 0.5%鹅红细 胞悬液,配制方法见B.2。
3.2.5韦塞尔斯布朗病血凝抗原，阳性血清和阴性血清。
3.3被检血清
无菌采集动物血液,凝固后离心分离血清,56℃灭活处理30min后,置于4℃或-20℃保存备用。
被检血清须采用高岭土鹅红细胞吸附法去除非特异性凝集素。按如下方法进行处理:0.1ml. 被检血清,加入0.4mLpH7.5磷酸盐缓冲液,再加入0.5 mL 25%高岭土,充分振荡混合,室温作用20min,然后1000r/min离心30min取上清,加入25pμL0.5%鹅红细胞悬液,轻轻振荡,冰浴吸附20 min,1000r/min离心10min,吸取上清,即为1:10稀释的被检血清。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4828—2017
韦塞尔斯布朗病抗体血凝抑制试验检测方法
Quarantine protocol for antibodies against Wesselsbrol disease virus by Hl2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局SN/T4828—2017
本标准主要起草人：刘艳华、高志强、谷强、张伟、蒲静、乔彩霞、尹羿、汪琳、张利峰、凌凤俊。I
1范围
韦塞尔斯布朗病抗体血凝抑制试验检测方法
本标准规定了进出口动物韦塞尔斯布朗病抗体的血凝抑制试验检测方法。本标准适用于进出口动物韦塞尔斯布朗病抗体的检测。2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PBS：
HAU：
3设备、材料和试剂
3.1设备
台式离心机。
振荡器。
冰箱。
恒温箱。
磷酸盐缓冲盐水
血凝试验
血凝抑制试验
血凝单位
微量可调移液器。
材料和试剂
96孔V型微量反应板。
SN/T4828—2017
含0.4%卵清蛋白的PH7.5PBS和含0.4%卵清蛋白的pH5.7PBS，配制方法见附录A。阿氏（Alsevers）液，配制方法见附录B的B.l。3.2.40.5%鹅红细胞悬液，配制方法见B.2。5韦塞尔斯布朗病血凝抗原，阳性血清和阴性血清。3.2.5
3.3被检血清
无菌采集动物血液，凝固后离心分离血清，56℃灭活处理30min后，置于4℃或一20℃保存备用。被检血清须采用高岭土-鹅红细胞吸附法去除非特异性凝集素。按如下方法进行处理：0.1mL被检血清，加人0.4mLpH7.5磷酸盐缓冲液，再加人0.5mL25%高岭土，充分振荡混合，室温作用20min，然后1000r/min离心30min取上清，加人25μL0.5%鹅红细胞悬液，轻轻振荡，冰浴吸附20min，1000r/min离心10min，吸取上清，即为1：10稀释的被检血清1
SN/T4828—2017
4操作步骤
血凝试验（见表1）
4.1.1在微量反应板的每孔均加人25μL含0.4%卵清蛋白的pH7.5PBS4.1.2吸取25μL韦塞尔斯布朗病血凝抗原加入第1孔，反复吹打混勾。4.1.3
3从第1孔吸取25μL液体加人第2孔，混勾后吸取25μL液体加人第3孔，如此对倍稀释至第11孔，第11孔混勾后吸弃25μL。4.1.4
每孔加人25L含0.4%卵清蛋白的PH5.7PBS。每孔加人50μL0.5%鹅红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇勾）。4.1.6轻轻振荡混匀，在20℃~25℃下静置60min后观察结果。4.1.7血凝效价确定：对照孔（第12孔）红细胞应呈现明显的纽扣状沉淀于孔底。将板倾斜，观察红细胞有无呈泪珠状流尚，完全血凝（不流尚）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝效价，代表1个血凝单位(HAU)。bzxz.net
4.1.8根据4.1.7的结果，使用含0.4%卵清蛋白的pH7.5PBS配制4HAU的病毒抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为4HAU抗原的稀释倍数。例如表2抗原效价为2*（1：16），4HAU抗原的稀释倍数为2（1：4）。4.1.9将25μL含4个血凝单位的抗原用PBS做等量倍比稀释，使每孔（25μL）含有2HAU、1HAU0.5HAU和0.25HAU，每孔补加25μLPBS，再加人50μL0.5%鹅红细胞悬液，判定血凝结果与预期结果是否相符合。2HAU、1HAU孔红细胞应出现完全凝集，0.5HAU孔红细胞应出现50%凝集，0.25HAU孔红细胞应不凝集。若不相符，应重新配制抗原，测定效价。表1血凝试验
试验项目
0.4%卵清蛋白的pH7.5
PBS/μL
抗原倍比稀释/uL
0.4%卵清蛋白的pH5.7
PBS/μL
0.5%鹅红细胞/μL
作用时间及温度条件
判定举例
血凝抑制试验（见表2）
在20℃
~25℃下静置60min
4.2.1在微量反应板的每孔均加人25μL含0.4%卵清蛋白的pH5.7PBS10
4.2.2吸取25μL已经处理1：10稀释的被检血清加入第1孔内，充分混匀后吸取25μL于第2孔内，如此对倍稀释至第10孔，混匀后吸弃25μL。最后2孔不加血清，分别作抗原对照和空白对照。4.2.3除空白对照孔外，每孔加人4HAU的抗原25uL，空白对照孔加人25μL含0.4%卵清蛋白的pH5.7PBS，在20℃~25℃下静置60min。4.2.4每孔加人50μL0.5%鹅红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇勾）。2
4.2.5轻轻振荡混匀，在20℃25℃下静置60min后观察结果。4.2.6每次测定应设阳性血清和阴性血清对照，按被检血清进行系列稀释测定。表2血凝抑制试验
试验项目
0.4%卵清蛋白的pH5.7
PBS/μL
被检血清倍比稀释/pμL
4HAU抗原/μL
作用时间及温度条件
0.5%鹅红细胞/μL
作用时间及温度条件
判定举例
5结果判定
5.1判定时首先观察对照孔是否成立。3
5℃下静置60min
在20℃~25
在20℃~
~25℃下静置60min
SN/T4828—2017
5.2红细胞凝集：红细胞均勾分散在孔底周围，将板倾斜，红细胞不流尚判为完全凝集，判定为血凝作用阳性，记作“十”。
5.3无凝集：红细胞集中在孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时呈泪珠状流消，判定为不凝集或血凝抑制，记作“一”
5.4血凝抑制价：以能使4个HAU抗原凝集红细胞作用完全被抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制价（如表2的血凝抑制价为1：160）。5.5血凝抑制价大于或等于1/40为阳性，血凝抑制价等于1/20为可疑，需重复试验，重复试验结果仍为1/20，判为阳性。
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0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：
附录A
（规范性附录）
含0.4%卵清蛋白PBS配制
NaHPO.·HzO27.6g，溶于蒸馏水中，A.2B液
0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：
Na2HPO,·7HzO53.6g（或NazHPO-12HO71.6g或NazHPO·2H2O35.6g）).加蒸馏水溶解，最后稀释至1000mL。
含0.4%卵清蛋白pH7.5PBS的配制A.3
0.2mol/LA液8ml
0.2mol/LB液42mL
氯化钠8.5g
4g卵清蛋白
用蒸馏水定容至1000mL，过滤除菌后2A.4含0.4%卵清蛋白pH5.7PBS的配制0.2mol/LA液46.75mL
0.2mol/LB液3.25mL
氯化钠8.5g
4g卵清蛋白
水箱保存
用蒸馏水定容至1000mL，过滤除菌后2℃～8℃冰箱保存。阿氏（Alsevers）液配制
葡萄糖20.5g
二水合柠檬酸钠8.0g
柠檬酸0.55g
附录B
（规范性附录）
阿氏（Alsevers）液、0.5%鹅红细胞悬液配制溶于蒸馏水，并稀释至1000mL，径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌。B.20.5%鹅红细胞悬液制备
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nol/L的NaOH或1mol/L的HCl调节至pH=6.1，用孔采集鹅血液与等体积阿氏液混合摇匀，用5倍量生理盐水洗涤次，每次均以1000r/min离心
10min，直至上清透明无色。配制红细胞悬液时，再用含0.4%卵清蛋蛋白pH5.7PBS洗涤1次，以
1000r/min离心10min，取沉淀红细胞用含0.4%卵清蛋白pH5.7PBS配成体积分数为0.5%鹅红细胞悬液，4℃保存备用。
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