SN/T 4827-2017
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标准简介
SN/T 4827-2017.Quarantine protocol for Chr yseobacterium meningosepticum of frog.
1范围
SN/T 4827规定了用于蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的临床症状及细菌学、PCR等实验室诊断、检测方法。
SN/T 4827适用于蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的流行病学调查、监测、诊断和出人境检验检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 18088出 入境动物检疫采样
3试剂和培养基
除另有规定外,以下所用生化试剂均为分析纯。正文中试剂配制方法见附录A。
3.1营养肉汤。
3.2胰蛋白 胨大豆琼脂(TSA)。
3.3硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂(TCBS)。
3.4营养琼脂。
3.5生化鉴定试剂盒。
4疾病概述
蛙脑膜炎败血金黄杆菌病,是由脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)引起蛙.鳖等多种水生动物的一种传染病。脑膜炎败血伊丽莎白菌也称脑膜脓毒性金黄杆菌、脑膜炎败血黄杆菌或脑膜炎败血金黄杆菌。该菌可感染牛蛙、美国青蛙、虎纹蛙、中华鳖和沙鳖等各种养殖蛙类和鳖类,蛙是主要宿主，也可感染猫、犬、鼠和人。5月~10月为主要的发病季节;室内恒温养殖情况下,发病季节不明显。
病蛙出现运动机能失调、头部歪斜.身体失去平衡或浮于水面打转等,眼部因感染出现白色坏死(白内障)症状,同时伴有皮肤溃疡、肝坏死等症状。
取濒死发病蛙内脏或脑部组织,涂片,镜检,可观察到革兰氏阴性、细长、末端略圆突状的杆菌。
1范围
SN/T 4827规定了用于蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的临床症状及细菌学、PCR等实验室诊断、检测方法。
SN/T 4827适用于蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的流行病学调查、监测、诊断和出人境检验检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 18088出 入境动物检疫采样
3试剂和培养基
除另有规定外,以下所用生化试剂均为分析纯。正文中试剂配制方法见附录A。
3.1营养肉汤。
3.2胰蛋白 胨大豆琼脂(TSA)。
3.3硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂(TCBS)。
3.4营养琼脂。
3.5生化鉴定试剂盒。
4疾病概述
蛙脑膜炎败血金黄杆菌病,是由脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)引起蛙.鳖等多种水生动物的一种传染病。脑膜炎败血伊丽莎白菌也称脑膜脓毒性金黄杆菌、脑膜炎败血黄杆菌或脑膜炎败血金黄杆菌。该菌可感染牛蛙、美国青蛙、虎纹蛙、中华鳖和沙鳖等各种养殖蛙类和鳖类,蛙是主要宿主，也可感染猫、犬、鼠和人。5月~10月为主要的发病季节;室内恒温养殖情况下,发病季节不明显。
病蛙出现运动机能失调、头部歪斜.身体失去平衡或浮于水面打转等,眼部因感染出现白色坏死(白内障)症状,同时伴有皮肤溃疡、肝坏死等症状。
取濒死发病蛙内脏或脑部组织,涂片,镜检,可观察到革兰氏阴性、细长、末端略圆突状的杆菌。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4827—2017
蛙脑膜炎败血金黄杆菌病检疫技术规范Quarantine protocol for Chryseobacterium meningosepticum of frog2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4827—2017
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：徐淑菲、孔繁德、谢明星、唐泰山、王凯民、姜焱。I
1范围
蛙脑膜炎败血金黄杆菌病检疫技术规范SN/T4827—2017
本标准规定了用于蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的临床症状及细菌学，PCR等实验室诊断、检测方法本标准适用于蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的流行病学调查、监测、诊断和出人境检验检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出入境动物检疫采样
3试剂和培养基
除另有规定外，以下所用生化试剂均为分析纯。正文中试剂配制方法见附录A。3.1营养肉汤。
胰蛋白陈大豆琼脂（TSA)。
硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂（TCBS）。3.4营养琼脂。
3.5生化鉴定试剂盒。
6革兰氏染色液。
3.7DNA提取试剂：蛋白酶K，SDS、酚-氯仿抽提法所需要的相关试剂；商品化的DNA提取试剂盒3.8
PCR试剂：10×浓缩缓冲液、dNTP、氯化镁、6×电泳上样缓冲液、琼脂糖、5X电泳缓冲液（TBE）等，均为商品化试剂盒中成分。3.9引物：
a）特异性引物：
—P1:5-GATTCGTCGGATTATATTG-3P25\-CCACTTCAACCTTACTCAAGACTAAC-3。浓度为10μmol/L，扩增产物大小为475bp~479bp。b）通用引物：
P3:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3\；P4.5-GGYTACCTTGTTACGACTT-3
浓度为10μmol/L，扩增产物大小为1488bp。3.10阴性和阳性对照：由国家质检总局指定实验室提供。3.11DNADL2000Marker：适合检测分子量大小100bp~2000bp间的DNA片段，-20℃保存。4疾病概述
蛙脑膜炎败血金黄杆菌病，是由脑膜炎败血伊丽莎白菌（Elizabethkingiameningoseptica）引起1
SN/T4827—2017
蛙、鳖等多种水生动物的一种传染病。脑膜炎败血伊丽莎白菌也称脑膜脓毒性金黄杆菌、脑膜炎败血黄杆菌或脑膜炎败血金黄杆菌。该菌可感染牛蛙、美国青蛙、虎纹蛙、中华鳖和沙鳖等各种养殖蛙类和整类，蛙是主要宿主，也可感染猫、犬、鼠和人。5月～10月为主要的发病季节；室内恒温养殖情况下，发病季节不明显。
病蛙出现运动机能失调、头部歪斜、身体失去平衡或浮于水面打转等，眼部因感染出现白色坏死（白内障症状，同时伴有皮肤溃疡、肝坏死等症状。取濒死发病蛙内脏或脑部组织，涂片，镜检，可观察到革兰氏阴性、细长、末端略圆突状的杆菌。5设备和材料
5.1天平。
5.2离心机。
5.3微量移液器
5.4凝胶成像仪或紫外透射仪。
5.5PCR仪。
5.6恒温培养箱。
5.7冰箱。
显微镜。
6检测方法
细菌学检测方法
6.1.1取样
按照GB/T18088的规定采样。取发病蛙眼、脑、肝脏等组织作为样品。6.1.2操作步骤
6.1.2.1增菌
无菌取待检样品25g，加人营养肉汤225ml，用均质器以8000r/min~10000r/min均质1min2min；或置于盛有225mL营养肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min，于28℃±1℃培养18h~24h。
6.1.2.2分离培养
将上述经过增菌的培养物，用无菌接种环分别划线接种到TSA，TCBS、营养琼脂等平板上，于28℃土1℃培养18h~24h。典型菌落特征：在TSA上，菌落直径1mm~2mm，圆形突起，有光泽，呈白色、微黄或亮黄色；在TCBS上，菌落呈绿色：在营养琼脂平板上，菌落呈微黄或亮黄色脑膜炎败血伊丽莎白菌可在37℃生长，但无明显色素形成。挑取典型菌落，接种营养肉汤或其他培养基作为纯培养物，用于后续试验。6.1.2.3革兰氏染色镜检
取一干净的载玻片，用接种环挑取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀；晾干载玻片；按照说明书用革兰氏染色试剂（见A.1、A.2）进行染色。显微镜下观察，脑膜炎败血伊丽莎白菌为革兰氏阴性、细长，末端略圆突的杆菌，大小（0.4μm~0.5um）×（0.8μm~1.0um）。单个分散排列，无鞭毛、无芽孢2
无英膜，不运动。
6.1.2.4生化试验
6.1.2.4.1氧化酶试验
SN/T4827—2017
用无菌接种环或其他无菌工具挑取纯培养物，滴加氧化酶试剂或涂布于氧化酶试纸表面进行氧化酶试验。如果氧化酶试剂或试纸在规定的范围内变为紫色或深紫色，则为氧化酶阳性脑膜炎败血伊丽莎白菌氧化酶试验为阳性。6.1.2.4.2其他生化试验
可选择商品化的生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行生化试验。脑膜炎败血伊丽莎白菌生化鉴定结果参见附录B。6.2PCR方法
6.2.1取样
同5.2.1。为提高检出率，样本可保存于95%的乙醇中，或于冰上冷藏并于24h内送检。或80℃低温冰箱长期保存。试验必须设立阴性、阳性和空白对照可疑菌接种营养肉汤，提取细菌核酸DNA以待检测。6.2.2
DNA的提取
取15mg~30mg上述样品加到1.5mL离心管中，若是菌液5000r/min离心5min，去除上清液；若是组织器官用研磨棒充分研磨。加20μL蛋蛋白酶K（见A.3)，再加SDS（见A.4)至终浓度为1%，上h；接着向勾浆液中按1：1
下颠倒混匀；混合液置于55℃水浴，水浴2.5比例加酚/氯仿/异戊醇混合液
12000g离心5min：吸上层水相800μL于一灭菌塑料离（25：24：1）（见A.5），轻轻震荡混匀5min.心管中，再加人等体积酚/氯仿/异皮醇混合液，轻轻震荡混勾5min，12000g离心5min；吸上层水相的无水乙醇，
500μ于一塑料离心管中，加人两倍体积20℃放置2h或液氮中放置5min：12000g乙醇溶液500L，轻轻混匀后12000g离心离心5min，沉淀DNA，吸弃上清液：于沉淀中加人75%5min，吸弃上清液，室温挥干；向DNA沉淀中加200μLTE（见
A6缓冲液，一20℃保存备用。或者采用等效的商业化的DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作6.2.3第一次PCR检测
6.2.3.1反应体系
PCR总体积50μL，10×浓缩缓冲液5μL，氯化镁（25mmol/L）4μL，dNTP（10mmol/L）2μL，Tag酶（5U)1μL，P1、P2各2μL，33μL灭菌双蒸水，然后加人1μL待测样品DNA作为模板。6.2.3.2设立对照
在样品处理过程中必须设立阳性样品对照（标准阳性菌株或其他标准的阳性质控作对照）、阴性样品对照（用核酸裂解液代替模板作为阴性对照）、空白对照（取等体积的水代替模板作为空白对照）。6.2.3.3反应条件
将反应混合液混匀后稍离心，按以下反应程序进行扩增：95℃5min，1个循环然后95℃30s，50℃30s，72℃1min.25个循环，再72℃5min3
SN/T4827—2017
6.2.3.4琼脂糖电泳
用0.5×TBE（见A.7)电泳缓冲液配制1%的琼脂糖（含0.1μg/mLEB，即溴化乙锭，见A.8)均匀铺板，厚度为3mm~5mm。将平板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将10μL样品和2μL6X电泳上样缓冲液（见A.9）混匀后加人样品孔。在电泳时选择合适的DNA相对分子质量标准作对照，5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达底部时停止，在紫外灯下观察核酸条带。6.2.4第二次PCR检测
反应体系按照6.2.3.1加人除引物外的各反应组分，P3、P4引物各2μL。设立阳性对照、阴性对照和空白对照。反应条件：95℃5min，1个循环；然后95℃1min，55℃1min，72℃2min，30个循环再72℃5min。
6.2.5PCR结果判定
特异性引物P1、P2扩增的产物电泳后阳性对照出现一条475bp～479bp的DNA片段，而阴性对照和空白对照没有该核酸带，说明实验方法成立。此时待测样品电泳后也在475bp～479bpDNA的位置上有核酸条带，将其PCR扩增产物进行测序，并用BALST进行生物序列的相似性搜索和分析。如果其序列与GenBank中的参考序列同源性在98%以上，则可判定该待测样品为脑膜炎败血伊丽莎白菌阳性（参见附录C）：而无条带或条带的大小不是475bp~479bp，采用通用引物P3P4进行第二次PCR检测。
通用引物P3、P4扩增的产物电泳后阳性对照出现一条1488bp的DNA片段，而阴性对照和空白对照没有该核酸带，说明实验方法成立。此时待测样品电泳后也在1488bpDNA的位置上有核酸条带，将其PCR扩增产物进行测序，并用BALST进行生物序列的相似性搜索和分析。如果与脑膜炎败血伊丽莎白菌的同源性在98%以上，则可判定该待测样品为脑膜炎败血伊丽莎白菌阳性；而无条带或条带的大小不是1488bp，则判定为脑膜炎败血伊丽莎白菌阴性。6.3综合判定
6.3.1如果临床症状相符分离到可疑菌株，且主要生化反应符合脑膜炎败血伊丽莎白菌的主要生化特征者，判定为脑膜炎败血伊丽莎白菌阳性。6.3.2如果临床症状相符，分离到可疑菌株，但主要生化反应不完全相符者，判定为可疑，进一步进行PCR鉴定。若PCR结果为阳性，判定为脑膜炎败血伊丽莎白菌阳性；若PCR结果为阴性，判定为脑膜炎败血伊丽莎白菌阴性
6.3.3如果未分离到可疑菌株，判定为脑膜炎败血伊丽莎白菌阴性。革兰氏染色液
革兰氏碘液
碘化钾
加蒸馏水至
附录A
（规范性附录）
试剂配制
SN/T4827—2017
将碘与碘化钾先行混合，加人蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.2
草酸铵结晶紫染液
A液：结晶紫（crystalviolet）95%酒精
B液：草酸铵（ammoniumoxalate）加蒸馏水至
混合A、B二液，静置48h后使用。A.3蛋白酶K
蛋白酶K
蒸馏水
配制方法：将200mg蛋白酶K溶于9.5mL蒸馏水中。为减少变性，切记只能将蛋白酶K加人溶液中而不能将溶液加人到蛋白质中。将加塞试管轻轻摇晃至蛋白质完全溶解。不能涡旋搅拌（这样会起泡沫，提示蛋白质已变性）。调节体积至10mL，等份分装，一20℃贮存。一般来说，此溶液不需除菌。
A.410%SDS（十二烷基硫酸钠）
蒸馏水
溶解后将体积调至
可高压除菌，室温可永久保存。A.5
酚/氯仿/异戊醇混合液
饱和酚
异戊醇
1000ml
SN/T4827—2017
三种试剂按比例混合均匀后加人等体积的0.01mol/LTris-HCl(pH8.0）中，移人棕色玻璃瓶中4℃保存。也可购买现成的试剂。A.6TE缓冲液（pH8.0)
1mol/LTris-HCI缓冲液（pH8.0)500mmol/LEDTA(pH8.0)
加入约800mL的双蒸馏水，均匀混合。溶液定容至1000mL。高温高压灭菌后，4℃保存。A.75×TBE电泳缓冲液
Tris碱
加蒸馏水至
用5mol/L的盐酸调到pH8.0
L000ml
使用液为0.5×TBE电泳缓冲液或1×TBE电泳缓冲液。用前采用蒸馏水5或10倍稀释即可。A.8EB（溴化乙锭，核酸染色剂）EB
加蒸馏水至
配制成10mg/mL的浓缩液。
于室温即可。
6×电泳上样缓冲液
溴酚蓝
加蒸馏水至
A.10.1成分
酵母膏
蛋白陈
硫代硫酸钠
柠檬酸钠
牛胆酸钠
牛胆汁粉
氯化钠
柠锰酸铁
OmL电泳液或琼脂中加uL。用铝箔或黑纸包裹容器，储用时每
溴麝香草酚蓝（2%溶液）
草酚蓝（1%溶液）
A.10.2制法
将上述成分加蒸馏水至1000mL，溶解，校正至pH=8.6，加热煮沸，倾注平板。A.11
营养肉汤
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
加蒸馅水至
1000ml
SN/T4827—2017
按上述成分混合，溶解后校正至pH=7.4，分装烧瓶，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。A.12
胰蛋白陈大豆琼脂（TSA）
A.12.1成分
胰蛋白陈
植物蛋白陈
氯化钠
加蒸馏水至
A.12.2制法
1000ml
按上述成分混合，加热搅拌溶解，校正至PH一（7.3士0.2），分装三角瓶，121℃高压灭菌15min备用。bZxz.net
营养琼脂
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
加蒸馏水至
15g~20g
1000ml
按上述成分混合，校正至pH=（7.27.4)，加热搅拌溶解，使琼脂溶化，分装，122℃高压灭菌15min。7
SN/T4827—2017
附录B
（资料性附录）
脑膜炎败血金黄杆菌生化鉴定表脑膜炎败血金黄杆菌生化鉴定表见表B.1。表B.1
脑膜炎败血金黄杆菌生化鉴定表氣
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性：“V\表示可变；“a\为主要生化反应特征指标（伯杰氏细菌鉴定手册第九版）；“b\为氧化型或弱发酵型（要2d~7d产酸）。附录c
（资料性附录）
脑膜炎败血金黄杆菌菌基因序列SN/T4827—2017
GeneBank中的登陆号为AY468477的脑膜炎败血伊丽莎白菌16SrRNA的部分基因序列(479bp)：GATTCGGCATCGGATTATATTGAAAACTACGGTGGATAAAGATGGGCACGCGCAAGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCTTTAGGGGGCCTGAGAGGGTGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGTGAAAGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTAGGAAGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTACTTTTATCTGGGGATAAACCTACTTACGTGTAAGTAGCTGAAGGTACCAGATGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGACTGATAAGTCAGTGGTGAAATCCGACAGCTTAACTGTCGAACTGCCATTGATACTGTTAGTCTTGAGTAAGGTTGAAGTGG注：加粗带下划线的序列分别为上下游引物结合序列9
SN/T4827—2017
参考文献
[1］中国科学院微生物研究所.伯杰氏细菌鉴定手册（第九版）[M].北京：科学出版社，1994，354-386.
[2]］陈爱平，江育林，钱东，等.蛙脑膜炎败血金黄杆菌病.中国水产，2012.5：51-52.[3］周永灿，朱传华，陈国华，等.虎纹蛙白内障病病原的分离鉴定及其免疫防治.上海水产大学学报，2001，10(1)：16-21.
[4] Zhen-Yu Xie,Zhou-Yong Can,Shi-Feng Wang,et al.First First isolation and identificationof Elizabethkingia meningoseptica from cultured tiger frog,Rana tigerina rugulosa.Veterinary Microbiology,2009,138.140-144.
[5]Yi-Cheng Chang,Hsueh-Hsia Lo,Hsiu-Ying Hsieh,et al.Identification and epidemiologicalrelatedness of clinical Elizabethkingia meningoseptica isolates from central Taiwan[JJ.Journal of Microbiology,mmunologyandInfection,2014,47.318-323.S
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中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4827—2017
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：徐淑菲、孔繁德、谢明星、唐泰山、王凯民、姜焱。I
1范围
蛙脑膜炎败血金黄杆菌病检疫技术规范SN/T4827—2017
本标准规定了用于蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的临床症状及细菌学，PCR等实验室诊断、检测方法本标准适用于蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的流行病学调查、监测、诊断和出人境检验检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出入境动物检疫采样
3试剂和培养基
除另有规定外，以下所用生化试剂均为分析纯。正文中试剂配制方法见附录A。3.1营养肉汤。
胰蛋白陈大豆琼脂（TSA)。
硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂（TCBS）。3.4营养琼脂。
3.5生化鉴定试剂盒。
6革兰氏染色液。
3.7DNA提取试剂：蛋白酶K，SDS、酚-氯仿抽提法所需要的相关试剂；商品化的DNA提取试剂盒3.8
PCR试剂：10×浓缩缓冲液、dNTP、氯化镁、6×电泳上样缓冲液、琼脂糖、5X电泳缓冲液（TBE）等，均为商品化试剂盒中成分。3.9引物：
a）特异性引物：
—P1:5-GATTCGTCGGATTATATTG-3P25\-CCACTTCAACCTTACTCAAGACTAAC-3。浓度为10μmol/L，扩增产物大小为475bp~479bp。b）通用引物：
P3:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3\；P4.5-GGYTACCTTGTTACGACTT-3
浓度为10μmol/L，扩增产物大小为1488bp。3.10阴性和阳性对照：由国家质检总局指定实验室提供。3.11DNADL2000Marker：适合检测分子量大小100bp~2000bp间的DNA片段，-20℃保存。4疾病概述
蛙脑膜炎败血金黄杆菌病，是由脑膜炎败血伊丽莎白菌（Elizabethkingiameningoseptica）引起1
SN/T4827—2017
蛙、鳖等多种水生动物的一种传染病。脑膜炎败血伊丽莎白菌也称脑膜脓毒性金黄杆菌、脑膜炎败血黄杆菌或脑膜炎败血金黄杆菌。该菌可感染牛蛙、美国青蛙、虎纹蛙、中华鳖和沙鳖等各种养殖蛙类和整类，蛙是主要宿主，也可感染猫、犬、鼠和人。5月～10月为主要的发病季节；室内恒温养殖情况下，发病季节不明显。
病蛙出现运动机能失调、头部歪斜、身体失去平衡或浮于水面打转等，眼部因感染出现白色坏死（白内障症状，同时伴有皮肤溃疡、肝坏死等症状。取濒死发病蛙内脏或脑部组织，涂片，镜检，可观察到革兰氏阴性、细长、末端略圆突状的杆菌。5设备和材料
5.1天平。
5.2离心机。
5.3微量移液器
5.4凝胶成像仪或紫外透射仪。
5.5PCR仪。
5.6恒温培养箱。
5.7冰箱。
显微镜。
6检测方法
细菌学检测方法
6.1.1取样
按照GB/T18088的规定采样。取发病蛙眼、脑、肝脏等组织作为样品。6.1.2操作步骤
6.1.2.1增菌
无菌取待检样品25g，加人营养肉汤225ml，用均质器以8000r/min~10000r/min均质1min2min；或置于盛有225mL营养肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min，于28℃±1℃培养18h~24h。
6.1.2.2分离培养
将上述经过增菌的培养物，用无菌接种环分别划线接种到TSA，TCBS、营养琼脂等平板上，于28℃土1℃培养18h~24h。典型菌落特征：在TSA上，菌落直径1mm~2mm，圆形突起，有光泽，呈白色、微黄或亮黄色；在TCBS上，菌落呈绿色：在营养琼脂平板上，菌落呈微黄或亮黄色脑膜炎败血伊丽莎白菌可在37℃生长，但无明显色素形成。挑取典型菌落，接种营养肉汤或其他培养基作为纯培养物，用于后续试验。6.1.2.3革兰氏染色镜检
取一干净的载玻片，用接种环挑取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀；晾干载玻片；按照说明书用革兰氏染色试剂（见A.1、A.2）进行染色。显微镜下观察，脑膜炎败血伊丽莎白菌为革兰氏阴性、细长，末端略圆突的杆菌，大小（0.4μm~0.5um）×（0.8μm~1.0um）。单个分散排列，无鞭毛、无芽孢2
无英膜，不运动。
6.1.2.4生化试验
6.1.2.4.1氧化酶试验
SN/T4827—2017
用无菌接种环或其他无菌工具挑取纯培养物，滴加氧化酶试剂或涂布于氧化酶试纸表面进行氧化酶试验。如果氧化酶试剂或试纸在规定的范围内变为紫色或深紫色，则为氧化酶阳性脑膜炎败血伊丽莎白菌氧化酶试验为阳性。6.1.2.4.2其他生化试验
可选择商品化的生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行生化试验。脑膜炎败血伊丽莎白菌生化鉴定结果参见附录B。6.2PCR方法
6.2.1取样
同5.2.1。为提高检出率，样本可保存于95%的乙醇中，或于冰上冷藏并于24h内送检。或80℃低温冰箱长期保存。试验必须设立阴性、阳性和空白对照可疑菌接种营养肉汤，提取细菌核酸DNA以待检测。6.2.2
DNA的提取
取15mg~30mg上述样品加到1.5mL离心管中，若是菌液5000r/min离心5min，去除上清液；若是组织器官用研磨棒充分研磨。加20μL蛋蛋白酶K（见A.3)，再加SDS（见A.4)至终浓度为1%，上h；接着向勾浆液中按1：1
下颠倒混匀；混合液置于55℃水浴，水浴2.5比例加酚/氯仿/异戊醇混合液
12000g离心5min：吸上层水相800μL于一灭菌塑料离（25：24：1）（见A.5），轻轻震荡混匀5min.心管中，再加人等体积酚/氯仿/异皮醇混合液，轻轻震荡混勾5min，12000g离心5min；吸上层水相的无水乙醇，
500μ于一塑料离心管中，加人两倍体积20℃放置2h或液氮中放置5min：12000g乙醇溶液500L，轻轻混匀后12000g离心离心5min，沉淀DNA，吸弃上清液：于沉淀中加人75%5min，吸弃上清液，室温挥干；向DNA沉淀中加200μLTE（见
A6缓冲液，一20℃保存备用。或者采用等效的商业化的DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作6.2.3第一次PCR检测
6.2.3.1反应体系
PCR总体积50μL，10×浓缩缓冲液5μL，氯化镁（25mmol/L）4μL，dNTP（10mmol/L）2μL，Tag酶（5U)1μL，P1、P2各2μL，33μL灭菌双蒸水，然后加人1μL待测样品DNA作为模板。6.2.3.2设立对照
在样品处理过程中必须设立阳性样品对照（标准阳性菌株或其他标准的阳性质控作对照）、阴性样品对照（用核酸裂解液代替模板作为阴性对照）、空白对照（取等体积的水代替模板作为空白对照）。6.2.3.3反应条件
将反应混合液混匀后稍离心，按以下反应程序进行扩增：95℃5min，1个循环然后95℃30s，50℃30s，72℃1min.25个循环，再72℃5min3
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6.2.3.4琼脂糖电泳
用0.5×TBE（见A.7)电泳缓冲液配制1%的琼脂糖（含0.1μg/mLEB，即溴化乙锭，见A.8)均匀铺板，厚度为3mm~5mm。将平板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将10μL样品和2μL6X电泳上样缓冲液（见A.9）混匀后加人样品孔。在电泳时选择合适的DNA相对分子质量标准作对照，5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达底部时停止，在紫外灯下观察核酸条带。6.2.4第二次PCR检测
反应体系按照6.2.3.1加人除引物外的各反应组分，P3、P4引物各2μL。设立阳性对照、阴性对照和空白对照。反应条件：95℃5min，1个循环；然后95℃1min，55℃1min，72℃2min，30个循环再72℃5min。
6.2.5PCR结果判定
特异性引物P1、P2扩增的产物电泳后阳性对照出现一条475bp～479bp的DNA片段，而阴性对照和空白对照没有该核酸带，说明实验方法成立。此时待测样品电泳后也在475bp～479bpDNA的位置上有核酸条带，将其PCR扩增产物进行测序，并用BALST进行生物序列的相似性搜索和分析。如果其序列与GenBank中的参考序列同源性在98%以上，则可判定该待测样品为脑膜炎败血伊丽莎白菌阳性（参见附录C）：而无条带或条带的大小不是475bp~479bp，采用通用引物P3P4进行第二次PCR检测。
通用引物P3、P4扩增的产物电泳后阳性对照出现一条1488bp的DNA片段，而阴性对照和空白对照没有该核酸带，说明实验方法成立。此时待测样品电泳后也在1488bpDNA的位置上有核酸条带，将其PCR扩增产物进行测序，并用BALST进行生物序列的相似性搜索和分析。如果与脑膜炎败血伊丽莎白菌的同源性在98%以上，则可判定该待测样品为脑膜炎败血伊丽莎白菌阳性；而无条带或条带的大小不是1488bp，则判定为脑膜炎败血伊丽莎白菌阴性。6.3综合判定
6.3.1如果临床症状相符分离到可疑菌株，且主要生化反应符合脑膜炎败血伊丽莎白菌的主要生化特征者，判定为脑膜炎败血伊丽莎白菌阳性。6.3.2如果临床症状相符，分离到可疑菌株，但主要生化反应不完全相符者，判定为可疑，进一步进行PCR鉴定。若PCR结果为阳性，判定为脑膜炎败血伊丽莎白菌阳性；若PCR结果为阴性，判定为脑膜炎败血伊丽莎白菌阴性
6.3.3如果未分离到可疑菌株，判定为脑膜炎败血伊丽莎白菌阴性。革兰氏染色液
革兰氏碘液
碘化钾
加蒸馏水至
附录A
（规范性附录）
试剂配制
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将碘与碘化钾先行混合，加人蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.2
草酸铵结晶紫染液
A液：结晶紫（crystalviolet）95%酒精
B液：草酸铵（ammoniumoxalate）加蒸馏水至
混合A、B二液，静置48h后使用。A.3蛋白酶K
蛋白酶K
蒸馏水
配制方法：将200mg蛋白酶K溶于9.5mL蒸馏水中。为减少变性，切记只能将蛋白酶K加人溶液中而不能将溶液加人到蛋白质中。将加塞试管轻轻摇晃至蛋白质完全溶解。不能涡旋搅拌（这样会起泡沫，提示蛋白质已变性）。调节体积至10mL，等份分装，一20℃贮存。一般来说，此溶液不需除菌。
A.410%SDS（十二烷基硫酸钠）
蒸馏水
溶解后将体积调至
可高压除菌，室温可永久保存。A.5
酚/氯仿/异戊醇混合液
饱和酚
异戊醇
1000ml
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三种试剂按比例混合均匀后加人等体积的0.01mol/LTris-HCl(pH8.0）中，移人棕色玻璃瓶中4℃保存。也可购买现成的试剂。A.6TE缓冲液（pH8.0)
1mol/LTris-HCI缓冲液（pH8.0)500mmol/LEDTA(pH8.0)
加入约800mL的双蒸馏水，均匀混合。溶液定容至1000mL。高温高压灭菌后，4℃保存。A.75×TBE电泳缓冲液
Tris碱
加蒸馏水至
用5mol/L的盐酸调到pH8.0
L000ml
使用液为0.5×TBE电泳缓冲液或1×TBE电泳缓冲液。用前采用蒸馏水5或10倍稀释即可。A.8EB（溴化乙锭，核酸染色剂）EB
加蒸馏水至
配制成10mg/mL的浓缩液。
于室温即可。
6×电泳上样缓冲液
溴酚蓝
加蒸馏水至
A.10.1成分
酵母膏
蛋白陈
硫代硫酸钠
柠檬酸钠
牛胆酸钠
牛胆汁粉
氯化钠
柠锰酸铁
OmL电泳液或琼脂中加uL。用铝箔或黑纸包裹容器，储用时每
溴麝香草酚蓝（2%溶液）
草酚蓝（1%溶液）
A.10.2制法
将上述成分加蒸馏水至1000mL，溶解，校正至pH=8.6，加热煮沸，倾注平板。A.11
营养肉汤
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
加蒸馅水至
1000ml
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按上述成分混合，溶解后校正至pH=7.4，分装烧瓶，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。A.12
胰蛋白陈大豆琼脂（TSA）
A.12.1成分
胰蛋白陈
植物蛋白陈
氯化钠
加蒸馏水至
A.12.2制法
1000ml
按上述成分混合，加热搅拌溶解，校正至PH一（7.3士0.2），分装三角瓶，121℃高压灭菌15min备用。bZxz.net
营养琼脂
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
加蒸馏水至
15g~20g
1000ml
按上述成分混合，校正至pH=（7.27.4)，加热搅拌溶解，使琼脂溶化，分装，122℃高压灭菌15min。7
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附录B
（资料性附录）
脑膜炎败血金黄杆菌生化鉴定表脑膜炎败血金黄杆菌生化鉴定表见表B.1。表B.1
脑膜炎败血金黄杆菌生化鉴定表氣
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性：“V\表示可变；“a\为主要生化反应特征指标（伯杰氏细菌鉴定手册第九版）；“b\为氧化型或弱发酵型（要2d~7d产酸）。附录c
（资料性附录）
脑膜炎败血金黄杆菌菌基因序列SN/T4827—2017
GeneBank中的登陆号为AY468477的脑膜炎败血伊丽莎白菌16SrRNA的部分基因序列(479bp)：GATTCGGCATCGGATTATATTGAAAACTACGGTGGATAAAGATGGGCACGCGCAAGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCTTTAGGGGGCCTGAGAGGGTGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGTGAAAGCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTAGGAAGACGGCCCTATGGGTTGTAAACTACTTTTATCTGGGGATAAACCTACTTACGTGTAAGTAGCTGAAGGTACCAGATGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGACTGATAAGTCAGTGGTGAAATCCGACAGCTTAACTGTCGAACTGCCATTGATACTGTTAGTCTTGAGTAAGGTTGAAGTGG注：加粗带下划线的序列分别为上下游引物结合序列9
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参考文献
[1］中国科学院微生物研究所.伯杰氏细菌鉴定手册（第九版）[M].北京：科学出版社，1994，354-386.
[2]］陈爱平，江育林，钱东，等.蛙脑膜炎败血金黄杆菌病.中国水产，2012.5：51-52.[3］周永灿，朱传华，陈国华，等.虎纹蛙白内障病病原的分离鉴定及其免疫防治.上海水产大学学报，2001，10(1)：16-21.
[4] Zhen-Yu Xie,Zhou-Yong Can,Shi-Feng Wang,et al.First First isolation and identificationof Elizabethkingia meningoseptica from cultured tiger frog,Rana tigerina rugulosa.Veterinary Microbiology,2009,138.140-144.
[5]Yi-Cheng Chang,Hsueh-Hsia Lo,Hsiu-Ying Hsieh,et al.Identification and epidemiologicalrelatedness of clinical Elizabethkingia meningoseptica isolates from central Taiwan[JJ.Journal of Microbiology,mmunologyandInfection,2014,47.318-323.S
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