SN/T 4826-2017.Quarantine protocol for Avian Spirochaetosis.
1范围
SN/T 4826规定了禽螺旋体病的病原分离与鉴定.聚合酶链式反应(PCR).实时荧光PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)的检测技术。
SN/T 4826适用于禽螺旋体病的检疫或流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件I仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范'
3疫病概述
禽螺旋体病(Avian Spirochaetosis,AS)是由伯氏疏螺旋体( Borrelia burgdorferi)引起的,可致多种禽类感染的以发热、精神沉郁、厌食和下痢为其特征的急性败血性传染病。伯氏疏螺旋体属于原核生物界(Kingdom Monera). 螺旋体目( Spirochaetidae).螺旋体科( Spirochaetaceae)疏螺旋体属(Borrelia)(也称包柔氏螺旋体属)。禽螺旋体病呈世界性分布,我国农业部和质检总局发布的《进境动物检疫疫病名录》,将其列人二类进境动物疫病,欧洲发生较多。我国新疆(1983年)曾有发生过鸡螺旋体病的报道。其流行病学临床及病理变化参见附录A。
5样本采集
5.1试剂和材料
5.1.1主要试剂 :BSK-H培养基(见附录B).吉姆萨染液、革兰氏染液、生理盐水、甲醇。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4826—2017
禽螺旋体病检疫技术规范
Quarantine protocol for Avian Spirochaetosis2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出人境检验检疫局SN/T4826—2017
本标准主要起草人：刘生峰、杨俊、陆丽华、聂福平、王昱、张雷、李贤良、王国民、李应国。1范围
禽螺旋体病检疫技术规范
SN/T4826—2017
本标准规定了禽螺旋体病的病原分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光PCR和酶联免疫吸附试验（ELISA）的检测技术。本标准适用于禽螺旋体病的检疫或流行病学调查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集，运输和保存规范3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AS：禽螺旋体病
B.B：伯氏疏螺旋体
BSK-H：BSK-H培养基（Barbour-StonnerKelly-Hmedium）ELISA：酶联免疫吸附试验
PBS：磷酸缓冲液
HRP：辣根过氧化物酶
OD值：光密度值
PCR：聚合酶链式反应
BSA：牛血清白蛋白
dNTPs：脱氧核苷酸
SDS：十二烷基硫酸钠
4疫病概述
禽螺旋体病（AvianSpirochaetosis，AS）是由伯氏疏螺旋体（Borreliaburgdorferi）引起的，可致多种禽类感染的以发热、精神沉郁、厌食和下为其特征的急性败血性传染病。伯氏疏螺旋体属于原核生物界（KingdomMonera）、螺旋体目（Spirochaetidae）、螺旋体科（Spirochaetaceae）、疏螺旋体属（Borrelia）（也称包柔氏螺旋体属）。禽螺旋体病呈世界性分布，我国农业部和质检总局发布的《进境动物检疫疫病名录》，将其列人二类进境动物疫病，欧洲发生较多。我国新疆（1983年）曾有发生过鸡螺旋体病的报道。其流行病学、临床及病理变化参见附录A。5样本采集
5.1试剂和材料
5.1.1主要试剂：BSK-H培养基（见附录B)、吉姆萨染液、革兰氏染液、生理盐水、甲醇。SN/T4826—2017
5.1.2主要仪器设备和器材：无菌剪刀、镊子、平皿、烧杯、玻璃瓶、组织研磨器、注射器、离心机、高压灭菌锅、冰柜、生物安全柜、生物显微镜等。5.2病料的采集、保存和运输
病料从发热或发病活禽及滨死禽中采集。对于活禽可用翼静脉采血，分离血清用于抗体的ELISA检测，用肝素钠为抗凝剂无菌采集抗凝全血用于病原分离试验。对于病、死禽应无菌采集小肠、脾、肝、肾、心、肺等组织脏器。采样后应立即处理（见6.1)，若暂时不能处理，可于一70℃冰柜中保存。样品的保存和运送按SN/T2123进行操作。6病原分离与鉴定
6.1组织样品的处理
将组织样品2g，无菌接种至装有7mLBSK-H培养基的10mL具塞试管中，32℃～33℃增殖培养7d后，取菌悬液涂片镜检。血液样品处理；取待凝血经1000r/min离心10min后，取血清及血细胞交界处淡白色悬液涂片镜检
6.2病原显微镜检
取6.1的待检悬液数滴到载玻片中央，用接种环将悬液均匀涂布在载玻片上形成液膜，待液膜干燥后，用甲醇固定2min~3min。滴加稀释好吉姆萨染液使全部覆盖玻片，室温染色15min~30min后，用蒸馏水从玻片一端冲洗，晾干后镜检。也可经革兰氏染色后镜检。7PCR
7.1试剂和材料
7.1.1主要试剂：液氮、十二烷基硫酸钠（SDS)、蛋白酶K、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP、琼脂糖、DNAmarker。7.1.2主要仪器设备和器材：研钵、PCR仪、离心机、电流仪、电泳槽、凝胶成像系统、一20℃冰箱。7.1.3样品及处置：对脏器组织样品取约2g，置人无菌研钵中，加液氮研磨后，取匀浆液200μL置人1.5mL离心管中；对6.1中增菌悬液取200μL~500μL置人1.5mL离心管中；对血液样品，取待凝血经1000r/min离心10min后，取血清及血细胞交界处淡白色悬液200μL~500μL置人1.5mL离心管中。对离心管中收集物经12000r/min离心10min后弃上清，收集沉淀用于提取核酸；同时设立伯氏疏螺旋体标准菌株培养物作为阳性对照：SPF鸡血为阴性对照。7.2引物和序列
引物和序列如下：
P1:5'-CTTCTCAAGGCGGAGTTAA-3';-P2:5'-CCTCATCTGTCATTGTAGCA-3°。扩增目的片段为225bp。
7.3核酸提取
向5.1.3收集的沉淀中，加人500μL抽提缓冲液（100mmol/L氯化钠，10mmol/LTris-Cl7.3.1
pH8.025mmol/LEDTApH8.0终浓度10g/LSDS和终浓度0.1g/L蛋白酶K)悬浮后，55℃水浴2
SN/T4826—2017
中反应2h，同时设立伯氏疏螺旋体标准菌株培养物作为阳性对照；SPF鸡血为阴性对照。7.3.2加入等体积的苯酚：三氯甲烷：异戊醇（苯酚：三氯甲烷：异戊醇比例为25：24：1）反复12000r/min离心10min，将上层液体转移至另一个1.5mL离心管中，加人1/10体积3mol/L的乙酸钠和2倍体积无水乙醇，一20℃放置2h（或更长时间）。7.3.312000r/min离心10min，弃去上清液。加人500L70%冷乙醇洗涤一次，尽量弃去上清7.3.4待离心管中液体自然干燥后，加人50μL双蒸水溶解沉淀，即为DNA模板。7.3.5
核酸提取可使用等效的商品化细菌核酸提取试剂盒。7.4PCR检测
7.4.1反应体系
10XPCR缓冲液
10μmol/LP1(P1)
10μmol/LP2(P2)
DNA模板
TaqDNA聚合酶
总体积
反应程序
反应程序95℃5min94℃30s，55℃45s.72℃1min，共35个循环：72℃延伸10min7.5琼脂糖凝胶电泳分析
用1×TBE电泳缓冲液配制2%琼脂糖凝胶平板（见附录B)，将平板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好没胶面。取8LPCR产物和2L样品缓冲液混匀后加人样品孔·同时在凝胶的另一孔加人DNA分子量标准物质（DNAmarker）。调节电压为约5V/cm电泳约25min。在紫外灯下观察是否出现大小约为225bp的基因片段。
7.6结果判定
在阴性对照、空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待测样本未出现相应大小的扩增条带，则判定该样本的PCR检测结果为阴性；如待测样本出现预期大小扩增条带则应测序验证，参考序列参见附录C。实时荧光PCR
8.1试剂和材料
8.1.1主要试剂：液氮、十二烷基硫酸钠（SDS）、蛋白酶K、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs。8.1.2主要仪器设备和器材：研钵、荧光PCR仪、离心机，一20C冰箱。8.1.3样品及处置：对脏器组织样品取约2g，置人无菌研钵中，加液氮研磨后，取匀浆液200μL置入1.5mL离心管中；对6.1中增菌悬液取200μL～500μL置人1.5mL离心管中；对血液样品，取待凝血经1000r/min离心10min后，取血清及血细胞交界处淡白色悬液200μL~500μL置人1.5mL离心3
SN/T4826—2017
管中。对离心管中收集物经12000r/min离心10min后弃上清，收集沉淀用于提取核酸：同时设立伯氏疏螺旋体标准菌株培养物作为阳性对照；SPF鸡血为阴性对照。引物和探针序列
引物和探针序列如下：
RP1:5'-GCTCAAATAAAAGATGCTACA-3';RP2:5-GCAGATTGTGTTAAAATACTATTAG-3：探针：5'-FAM-TGCTGCTACAACCTCATCTGTCA-TAMRA-3。8.3核酸提取
8.3.1向8.1.3收集的沉淀中，加人500L抽提缓冲液（100mmol/L氯化钠，1ommol/LTris-Cl
pH8.0.25mmol/LEDTApH8.0.终浓度10g/LSDS和终浓度0.1g/L蛋白酶K)悬浮后，55℃水浴中反应2h·同时设立阳性和阴性对照8.3.2加人等体积的苯酚：三氯甲烷：异戊醇（苯酚12000r/min离心10min，将上层液体转移至另三氯甲烷：异戊醇比例为25：24：1)反复1.5mL离心管中，加人1/10体积3mol/L的乙酸钠和2倍体积无水乙醇，一20℃放置2h（或更长时间）8.3.312000r/min离心10min，弃去上清液。加人500μL70%冷乙醇洗涤一次，尽量弃去上清。待离心管中液体自然干燥后，加人50叫L双蒸水溶解沉淀，即为DNA模板。8.3.4
核酸提取可使用等效的商品化细菌核酸提取试剂盒8.3.5
荧光PCR检测
反应体系
2XPCR缓反应MIX
10 μmol/LRP1
10μmol/LRP2
10μmol/L探针
DNA模板
TaqDNA聚合酶
总体积
8.4.2反应程序
95℃预变性5min：95℃变性15$，60℃退火30s；45个循环，每个循环结束后采集FAM通道数据。
8.5结果判定
结果分析条件设定
读取检测结果。阅值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。8.5.2质控标准
阴性对照无Ct值且无扩增曲线：阳性对照Ct值小于28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实4
验视为无效。
8.5.3结果描述及判定
阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表示样品中无伯氏疏螺旋体8.5.3.1
SN/T48262017
阳性：Ct值小于或等于30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样本中存在伯氏疏螺旋体。8.5.3.2
有效原则：Ct值大于30.0的样本须重做，重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。9酶联免疫吸附试验
试剂和材料
包被抗原：纯化的伯氏疏螺旋体重组抗原，由指定单位提供阳性血清：鸡抗伯氏疏螺旋体
阳性血清，由指定单位提供。
阴性血清：SPF鸡血清。
酶标记抗体：辣根过氧化物酶标记的免抗鸡L检测样品：鸡血清样品，检测前需56℃处理30minELISA包被液、封闭液、稀释液、洗涤液（PBST）、底物液、终止液见附录B。主要设备和器材：酶标仪、37℃恒温箱、4℃冰箱ELISA洗板机9.2试验操作
9.2.1包被酶标板：用包被液稀释纯化的伯氏疏螺旋体抗原原至终浓度为10mg/L，包被96孔ELISA板，50μL/孔，置4℃冰箱过夜。9.2.2封闭：弃去包被液，加人1%BSA9.2.3加样：分别在阴、阳性对照孔中释液40μL，然后再加待测样品10浴液
孔.37℃放置
Ih，弃去封闭液，用PBST洗3遍。1人阴性对照，阳性对照50L。
寸应将样品加
混匀，轻轻敲打酶标板边缘，使孔内夜均铺满孔底。
反应液
3遍。
9.2.4加人用稀释液稀释的酶标记抗体50uL/孔，使孔内反应液均匀铺满孔底然后在待测样品孔先加样品稀
再标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动置于37℃反应1h，弃去反应物，用PBST洗相关说明书进行稀释），轻轻敲打酶标板边缘，：3000或按相
7℃反应
，弃去反应物，用PBST洗3遍。
9.2.5加人底物液，50uL/孔，轻轻敲打酶标板边缘使孔内反应液均匀铺满孔底。室温避光反应10min。
9.2.6加人终止液，50μL/孔。
9.2.7用酶标仪读取OD45o值。
9.3结果判定
9.3.1试验有效性判定条件：阳性对照孔平均值≥1.00；阴性对照平均值≤0.10。9.3.2结果判定：
临界值（CUTOFF)计算：临界值=阴性对照孔平均值十O.15；阴性判定：样品OD值<临界值（CUTOFF)者为禽螺旋体抗体阴性；阳性判定：样品OD值≥临界值（CUTOFF)者为禽螺旋体抗体阳性。注：可使用等效的商品化ELISA试剂盒检测禽螺旋体抗体，5
SN/T4826—2017
结果判定与报告
10.1病原分离鉴定、PCR或实时荧光PCR检测任一检测结果阳性，则直接报告禽螺旋体病阳性，否则报告为禽螺旋体病阴性
10.2ELISA试验阳性同时符合试验有效性判定条件，报告为禽螺旋体抗体阳性；ELISA试验阴性同时符合试验有效性判定条件，则报告为禽螺旋体抗体阴性。A.1流行病学
附录A
（资料性附录）
禽螺旋体病
SN/T4826—2017
鸡、鹅、鸭、火鸡和雉都易感，年龄较大的禽类有较大的抵抗力，容易自然恢复。禽疏螺旋体病是自然疫源性疾病，本病主要发生在能保持其中间宿主一一蜱繁息的地区，因此，病的流行季节与蜱的活动有密切关系。自然条件下，由于蜱的叮咬或摄食了有感染性的血液和蜱卵而发生感染，潜伏期一般为3d～12d。家庭鸡舍中捕捉到的蜱，其传染性高于商业鸡舍中的蜱，雄蜱的传染性高于雌蜱。这些蜱可经卵巢把病原传染给后代或叮咬禽后引起禽感染。在波斯锐缘蜱体内，禽疏螺旋体完整结构在1个～4个月后便可消失，但这些蜱仍有1年以上的传染性。鸡螨、鸡虱以及库蚊也是该病的传染性媒介，食人污染的粪便、异嗜病户以及皮肤损伤也可被感染A.2
2临床症状
禽感染螺旋体多见急性症状：急性病例常突然出现体温升高、感染鸡体温升高到42.9℃～43.6℃以上，肉冠、肉舞肉冠、肉髯蜡样透红、严重发或苍白，精神不振、食欲减退或不食、呆立不动，头下垂等症状，并排出含有胆汁和尿酸盐的绿色稀粪。随后鸡冠苍白松弛，贫血症状，步态不稳，严重者腿翅麻痹，重症鸡出现轻瘫、麻痹、嗜睡，最后抽搐死亡。有的维鸡出现腿、翅膀无力，一侧或双侧翅膀麻痹，经常呈犬坐式。由于螺旋体在病禽体内大量繁殖，血液中红细胞被大量破坏，细胞碎片阻塞毛细血管，以致出现明显的贫血和黄疽，这是本病最典型的特征性症状。急性病程一般为4d～6d。慢性病例较少见，症状与急性者相似而较轻缓，一般经2周左右可以完全康复A.3
3病理变化
检病鸡可见尸体消瘦，严重脱水，被毛粗乱，肉臀、肉冠发或苍白，肛周被绿色粪便污染。户体血液稀薄如水，呈咖啡色，血清呈黄绿色。脾脏有特征性病变，脾脏比正常体积大5倍～6倍，呈紫红色或棕红色，被膜下有暗红色斑点状出血与灰白色坏死灶，使脾脏呈斑驳状外观。肝脏肿大、柔软，呈暗红色，偶见被膜下出血。病程稍长者，肝脏肿胀不明显，可见到针尖大至1mm～2mm大小的灰白色坏死点，有时偶见梗死。病死鹅的肝脏，坏死面积较大而不规则。病禽皮下组织、心外膜、腹腔脂肪、消化道浆膜以及内脏器官的点状或斑点状出血，有时可见黄疽。户体嗪囊空虚，仅见少量水样液体。肠内容物呈暗绿色，黏膜表面被覆卡他性渗出物或出血性卡他性渗出物。肾肿大，呈苍白或棕红色，有时可见到坏死灶。肺脏高度淤血、水肿，部分区域出血。心肌实质变性，心外膜被覆一层纤维素性渗出物，产蛋禽常见卵黄破裂，常有出血性肠炎。上述症状和变化，常难以确诊，采取发热期的血液或各实质脏器涂片，用姬姆萨染色或革兰氏染色后镜检，发现疏状螺旋体即可确诊。7
SN/T4826—2017
B.1BSK-H完全培养基的配制
羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）免费标准bzxz.net
蛋白陈
柠檬酸钠
葡萄糖
TC-酵母自溶物
丙酮酸钠
N-乙酰葡糖胺
牛血清白蛋白
CMRL1066.(10X)
兔血清（热灭活）
去离子水
附录B
（规范性附录）
培养基和试剂的配制
用蒸馏水溶解各配方成分及牛血清白蛋白，用NaOIHI调节至pH=7.5并过滤除菌，无菌添加100mLCMRL1066和60mL兔血清，然后混合均勾、无菌分装注：也可购置等效的商品化BSK-H培养基。B.2
0.01mol/LPBS(pH7.2)的配制
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12HO)
磷酸二氢钠（NaH,PO）
氯化钠(NaCI)
蒸馏水
1000ml
用氢氧化钠（NaOH）或盐酸（HCI）调至pH=3ELISA包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）B.3
碳酸氢钠（NaHCO）
碳酸钠（Na2CO）
蒸馏水
72.灭菌或过
1000ml
溶解后置于4℃冰箱保存，在一周内使用。B.4
洗涤液（含0.1%Tween-20pH7.4PBS.PBST）氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KH,PO.）
磷酸氢二钠（NazHPO,）
氯化钾（KCI）
Tween-20
蒸馏水
溶解后置于4℃冰箱备用。
封闭液
1000ml
3%BSA溶液：取3gBSA粉，加人100mL蒸馏水，混匀，置于4℃冰箱备用。5稀释液
含有1%BSA的PBST，用于血清样品、酶标记抗体的稀释B.7
底物液
乙酸-柠檬酸缓冲液（pH6.0）
A液：乙酸钠溶液
乙酸钠
双蒸水
B液：柠檬酸缓冲液
柠檬酸
蒸馏水
配制：取B液约2mL至A液中，调至pH-6.0，置于4C冰箱保存备用。B.7.2TMB溶液
甲醇100mL
加温溶解后于暗盒中室温保存
3底物工作液（现用现配）
乙酸-柠檬酸缓冲液（pH6.0）
TMB溶液
注：可使用等效商品化底物溶液。B.8
终止液（2mol/LHzSO）
浓硫酸（H.SO,）
蒸馏水
SN/T4826—2017
SN/T4826—2017
5XTBE电泳缓冲液
Tris碱
0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）
蒸馏水定容至1000mL，充分溶解，4℃保存。B.10
2%琼脂糖凝胶
在200mL三角烧瓶中加入琼脂糖2g；1XTBE缓冲液100mL。微波炉中使之完全溶解，加人2μL浓度为10mg/mL溴化乙锭溶液（或等效商品化DNA染料）2μL充分摇勾，备用；待琼脂糖冷却至60℃左右，倒人制胶板并防止气泡产生，使琼脂糖厚度达3mm～5mm，待凝胶完全凝固后去掉梳子，将凝胶托盘放人电泳槽，加人1×TBE电泳缓冲液使之高出凝胶2mm～3mm。B.11
硼酸缓冲液（pH8.6）
四硼酸钠
蒸馏水
1000ml
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