SN/T 3306.14-2017
基本信息
标准号： SN/T 3306.14-2017
中文名称：国境口岸环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第14部分:大肠杆菌0157 :H7
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 国境 口岸 介导 恒温 扩增 检测 方法 大肠杆菌
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3306.14-2017.Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 14: Escherichia coli O157:H7.
1范围
SN/T 3306.14规定了在国境口岸利用环介导恒温核酸扩增(LAMP)法检测大肠杆菌0157:H7的检测对象、检测程序及检测结果的报告。
SN/T 3306.14适用于国境口岸大肠杆菌O157:H7菌株的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件,凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.36食 品安全国家标准食品微生物学检验 大 肠埃希氏菌O157:H7/NM检验
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
WS271感染性腹泻诊断标准
人间传染的病原微生物名录( 卫科教发(2006)15号)
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA:脱氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid)
dNTP ;脱氧核苷三磷酸( deoxyribonocleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetie acid)
LAMP :环介导恒温扩增(loop mediated isothermal amplification)
Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚
4生物安全及防污染措施
实验生物安全要求、操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定执行,由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T 230的规定。
1范围
SN/T 3306.14规定了在国境口岸利用环介导恒温核酸扩增(LAMP)法检测大肠杆菌0157:H7的检测对象、检测程序及检测结果的报告。
SN/T 3306.14适用于国境口岸大肠杆菌O157:H7菌株的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件,凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.36食 品安全国家标准食品微生物学检验 大 肠埃希氏菌O157:H7/NM检验
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
WS271感染性腹泻诊断标准
人间传染的病原微生物名录( 卫科教发(2006)15号)
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA:脱氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid)
dNTP ;脱氧核苷三磷酸( deoxyribonocleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetie acid)
LAMP :环介导恒温扩增(loop mediated isothermal amplification)
Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚
4生物安全及防污染措施
实验生物安全要求、操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定执行,由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T 230的规定。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3306.14—2017
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第14部分：大肠杆菌0157：H7
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part14.Escherichiacoli0157.H72017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》分为14个部分：第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌；
第3部分：志贺氏菌；
第4部分：嗜肺军团菌：
第5部分：布鲁氏菌；
第6部分：黄热病毒；
第7部分：猴痘病毒；
第8部分：基孔肯雅病毒；
第9部分：结核分枝杆菌；
第10部分：炭疽芽孢杆菌；
第11部分：副溶血性弧菌；
第12部分：空肠弯曲菌；
第13部分：原虫；
第14部分：大肠杆菌O157：H7。本部分为SN/T3306的第14部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T3306.14—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本部分主要起草人：祁军、詹曦菁、滑娜、赵欣、左锋。I
1范围
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第14部分：大肠杆菌0157：H7
SN/T3306.14—2017
SN/T3306的本部分规定了在国境口岸利用环介导恒温核酸扩增（LAMP）法检测大肠杆菌0157H7的检测对象检测程序及检测结果的报告。本部分适用于国境口岸大肠杆菌O157：H7菌株的筛选检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB4789.36食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用WS/T230
WS271感染性腹泻诊断标准
人间传染的病原微生物名录（卫科教发（2006）15号）3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetieacid)）LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚4生物安全及防污染措施
实验生物安全要求、操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定执行，由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T230的规定。5技术概要
根据大肠杆菌O157：H7rfbE基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对，共三对引物，特异性识别靶序列上的rfbE基因，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在SN/T3306.14—2017
同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物：从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可通过加人显色液，通过颜色变化观察判定结果。6试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。6.1引物。
根据大肠杆菌O157：H7特有的rf6E序列靶序列基因（JQ907522.1)设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1，环状引物2。外引物1（F35-3\）：AACAGTCTTGTACAAGTCCA外引物2（B3，5-3）：GGTGCTTTTGATATTTTTCCG内引物1（FIP，5-3）：CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT内引物2(BIP,5'-3)：TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT环状引物1(LF，5*-3）：CCAGAGTTAAGATTGAT环状引物2（LB，5-3\）：CGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC6.2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-1006.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。6.4BstDNA聚合酶：8U/μL。
6.510×ThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.8）、100mmol/L（NH,）zSO4100mmol/LKCl,20mmol/LMgSO4、1%TritonX-100。6.6MgSO.溶液：25mmol/L。
6.7甜菜碱：5mol/L。
6.8显色液：浓度为1000×SYBRGreenI6.9阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。6.10mEC+n肉汤
0.2mL、1.5mL10mL塑料离心管。6.11
吸头，配套移液器使用。
无菌匀质袋（带滤网）。
仪器和设备
7.1移液器：量程0.1μL~2μ，0.5μL~10μL，量程10μL~100μL，量程100μL~1000μL。7.2高速台式离心机：≥7000g。7.3水浴锅或加热模块：65℃土1℃和100℃士1℃。7.4恒温培养箱：36℃±1℃。
7.5拍打式匀质器。此内容来自标准下载网
7.6计时器。
8检测程序
天肠杆菌O157：H7检测程序见图1g2
9操作步骤
样本采集
样本的增菌及分离培养
样本前处理
模板DNA提取
LAMP反应
结果报告
经分离培养鉴定确认
图1大肠杆菌0157：H7LAMP检测程序9.1样本采集、细菌增菌及分离培养按照GB4789.36、WS271执行。
9.2样本前处理
9.2.1粪便样本的前处理
SN/T3306.14—2017
选取黄豆大小的成型便，每份标本湿重约4g，收集在无菌塑料袋中，4℃冰箱保存。预处理时每份粪便标本放置于装有6mLPBS（0.05mol/L，pH7.4）的离心管中，振荡混勾5min~10min后，500g离心5min，收集上清，此步骤重复3次。然后上清液4000g离心10min，收集沉淀，沉淀重悬于1mL双蒸水（ddH2O）中，7000g离心5min，收集沉淀。将沉淀溶于200μL（一20℃）预冷的无水乙醇中，振荡混匀后，7000g离心2min，弃上清，此步骤重复3次，最终保留沉淀备用。水样便无需前处理，可直接用于后续DNA提取。
9.2.2食物标本的前处理
取可疑食物约25g放入盛有225mLmEC十n肉汤的有滤网的无菌勾质袋中，用拍击式匀质器勾质约1min~2min，将滤液在于36℃士1℃培养18h~24h，之后取该增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，7000g离心2min保存沉淀备用。3
SN/T3306.14—2017
9.2.3可疑菌落的前处理
分离培养后得到的可疑菌落直接用于提取DNA模板，无需前处理。模板DNA的提取
加热煮沸法
向前处理后得到的沉淀中加人100μLDNA提取液：水样便直接取100μL加人100μLDNA提取液：直接挑取1个～2个可疑菌落加人80μLDNA提取液。将上述提取混合液其置于沸水浴10min，7000g离心2min，收集上清作为扩增模板，于一20℃保存备用。9.3.2
试剂盒提取
按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作9.4环介导恒温核酸扩增
反应体系
大肠杆菌0157：H7的环介导引物恒温扩增反应体系见表1。亦可选用市售商品化检测试剂盒。表1大肠杆菌0157：H7环介导引物恒温扩增反应体系试剂名称
10xThermoPol缓冲液
F3引物
B3引物
FIP引物
BIP引物
LF引物
LB引物
甜菜碱
硫酸镁溶液
BstDNA聚合酶
反应过程
储备液浓度
10pmol/
40μmol
00μmg
100mol/L
10mmol/L
5mol/l
150mmol/L
8U/μL
体系加样量
按照表1所述配制反应体系，上述组分加人后，轻柔混勾并短暂离心后加人10L的凡士林（密封液），最后将1L的显色液加人反应管顶端。盖上管盖后，置于65℃恒温扩增60min，观察结果。9.4.3空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置空白对照，阴性对照和阳性对照4
空白对照则采用无菌水作为扩增模板阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。阳性对照以含检测序列的质粒DNA作为扩增模板。结果观察
SN/T3306.14—2017
取出反应管，短暂离心使反应管盖中显色液进人反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化，判断结果。
9.6结果判定
在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，则该样品检验结果报告为LAMP检测阳性。如需对a
上述结果进行确认，则需进行分离培养鉴定，可按GB4789.36、WS271执行。b)
阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色则该样品检验结果报告为LAMP检测阴性。S
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国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第14部分：大肠杆菌0157：H7
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part14.Escherichiacoli0157.H72017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》分为14个部分：第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌；
第3部分：志贺氏菌；
第4部分：嗜肺军团菌：
第5部分：布鲁氏菌；
第6部分：黄热病毒；
第7部分：猴痘病毒；
第8部分：基孔肯雅病毒；
第9部分：结核分枝杆菌；
第10部分：炭疽芽孢杆菌；
第11部分：副溶血性弧菌；
第12部分：空肠弯曲菌；
第13部分：原虫；
第14部分：大肠杆菌O157：H7。本部分为SN/T3306的第14部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T3306.14—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本部分主要起草人：祁军、詹曦菁、滑娜、赵欣、左锋。I
1范围
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第14部分：大肠杆菌0157：H7
SN/T3306.14—2017
SN/T3306的本部分规定了在国境口岸利用环介导恒温核酸扩增（LAMP）法检测大肠杆菌0157H7的检测对象检测程序及检测结果的报告。本部分适用于国境口岸大肠杆菌O157：H7菌株的筛选检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB4789.36食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用WS/T230
WS271感染性腹泻诊断标准
人间传染的病原微生物名录（卫科教发（2006）15号）3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetieacid)）LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚4生物安全及防污染措施
实验生物安全要求、操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定执行，由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行。防止污染措施应符合WS/T230的规定。5技术概要
根据大肠杆菌O157：H7rfbE基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对，共三对引物，特异性识别靶序列上的rfbE基因，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在SN/T3306.14—2017
同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物：从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可通过加人显色液，通过颜色变化观察判定结果。6试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。6.1引物。
根据大肠杆菌O157：H7特有的rf6E序列靶序列基因（JQ907522.1)设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1，环状引物2。外引物1（F35-3\）：AACAGTCTTGTACAAGTCCA外引物2（B3，5-3）：GGTGCTTTTGATATTTTTCCG内引物1（FIP，5-3）：CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT内引物2(BIP,5'-3)：TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT环状引物1(LF，5*-3）：CCAGAGTTAAGATTGAT环状引物2（LB，5-3\）：CGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC6.2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-1006.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。6.4BstDNA聚合酶：8U/μL。
6.510×ThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.8）、100mmol/L（NH,）zSO4100mmol/LKCl,20mmol/LMgSO4、1%TritonX-100。6.6MgSO.溶液：25mmol/L。
6.7甜菜碱：5mol/L。
6.8显色液：浓度为1000×SYBRGreenI6.9阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。6.10mEC+n肉汤
0.2mL、1.5mL10mL塑料离心管。6.11
吸头，配套移液器使用。
无菌匀质袋（带滤网）。
仪器和设备
7.1移液器：量程0.1μL~2μ，0.5μL~10μL，量程10μL~100μL，量程100μL~1000μL。7.2高速台式离心机：≥7000g。7.3水浴锅或加热模块：65℃土1℃和100℃士1℃。7.4恒温培养箱：36℃±1℃。
7.5拍打式匀质器。此内容来自标准下载网
7.6计时器。
8检测程序
天肠杆菌O157：H7检测程序见图1g2
9操作步骤
样本采集
样本的增菌及分离培养
样本前处理
模板DNA提取
LAMP反应
结果报告
经分离培养鉴定确认
图1大肠杆菌0157：H7LAMP检测程序9.1样本采集、细菌增菌及分离培养按照GB4789.36、WS271执行。
9.2样本前处理
9.2.1粪便样本的前处理
SN/T3306.14—2017
选取黄豆大小的成型便，每份标本湿重约4g，收集在无菌塑料袋中，4℃冰箱保存。预处理时每份粪便标本放置于装有6mLPBS（0.05mol/L，pH7.4）的离心管中，振荡混勾5min~10min后，500g离心5min，收集上清，此步骤重复3次。然后上清液4000g离心10min，收集沉淀，沉淀重悬于1mL双蒸水（ddH2O）中，7000g离心5min，收集沉淀。将沉淀溶于200μL（一20℃）预冷的无水乙醇中，振荡混匀后，7000g离心2min，弃上清，此步骤重复3次，最终保留沉淀备用。水样便无需前处理，可直接用于后续DNA提取。
9.2.2食物标本的前处理
取可疑食物约25g放入盛有225mLmEC十n肉汤的有滤网的无菌勾质袋中，用拍击式匀质器勾质约1min~2min，将滤液在于36℃士1℃培养18h~24h，之后取该增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，7000g离心2min保存沉淀备用。3
SN/T3306.14—2017
9.2.3可疑菌落的前处理
分离培养后得到的可疑菌落直接用于提取DNA模板，无需前处理。模板DNA的提取
加热煮沸法
向前处理后得到的沉淀中加人100μLDNA提取液：水样便直接取100μL加人100μLDNA提取液：直接挑取1个～2个可疑菌落加人80μLDNA提取液。将上述提取混合液其置于沸水浴10min，7000g离心2min，收集上清作为扩增模板，于一20℃保存备用。9.3.2
试剂盒提取
按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作9.4环介导恒温核酸扩增
反应体系
大肠杆菌0157：H7的环介导引物恒温扩增反应体系见表1。亦可选用市售商品化检测试剂盒。表1大肠杆菌0157：H7环介导引物恒温扩增反应体系试剂名称
10xThermoPol缓冲液
F3引物
B3引物
FIP引物
BIP引物
LF引物
LB引物
甜菜碱
硫酸镁溶液
BstDNA聚合酶
反应过程
储备液浓度
10pmol/
40μmol
00μmg
100mol/L
10mmol/L
5mol/l
150mmol/L
8U/μL
体系加样量
按照表1所述配制反应体系，上述组分加人后，轻柔混勾并短暂离心后加人10L的凡士林（密封液），最后将1L的显色液加人反应管顶端。盖上管盖后，置于65℃恒温扩增60min，观察结果。9.4.3空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置空白对照，阴性对照和阳性对照4
空白对照则采用无菌水作为扩增模板阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。阳性对照以含检测序列的质粒DNA作为扩增模板。结果观察
SN/T3306.14—2017
取出反应管，短暂离心使反应管盖中显色液进人反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化，判断结果。
9.6结果判定
在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，则该样品检验结果报告为LAMP检测阳性。如需对a
上述结果进行确认，则需进行分离培养鉴定，可按GB4789.36、WS271执行。b)
阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色则该样品检验结果报告为LAMP检测阴性。S
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