SN/T 3306.13-2017.Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 13: Plasmodium.
1范围
SN/T 3306.13规定了国境口岸检测疑似传染病的血样本及蚊虫样本中疟原虫的环介导恒温核酸扩增(LAMP)法。
SN/T 3306.13适用于国境口岸对疟原虫的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件,凡是不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修政单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
WS/T 230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
WS 259疟疾 的诊断
SN/T 3562国境口岸疟原虫 PCR检测方法
人间传染的病原微生物名录卫生部(卫科教发[2006745号)
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA:脱氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid)
dNTP:脱氧核苷三磷酸( deoxyribonucleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetracetic acid)
LAMP:环介导恒温扩增(loop mediated isothermal amplification)
Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚
4生物安全措施及防污染措施
实验操作及处理按照GB 19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定,由具备相关资质的工作人员进行。
防止污染措施应符合WS/T 230的规定。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3306.13—2017
国境口岸环介导恒温扩增（LAMIP）检测方法第13部分：疮原虫
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part13.Plasmodium
2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》分为14个部分：一第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌；
第3部分：志贺氏菌：
第4部分：嗜肺军团菌：
第5部分：布鲁氏菌；
第6部分：黄热病毒；
第7部分：猴痘病毒；
一第8部分：基孔肯雅病毒；
第9部分：结核分枝杆菌；
第10部分：炭疽芽孢杆菌；
第11部分：副溶血性弧菌；
第12部分：空肠弯曲菌；
第13部分：原虫：
第14部分：大肠杆菌0157：H7。本部分为SN/T3306的第13部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T3306.13—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：天津国际旅行卫生保健中心、河北国际旅行卫生保健中心、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。
本部分主要起草人：左锋、史玲莉、詹曦菁、邵柏、赵欣、祁军。I
1范围
SN/T3306.13—2017
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第13部分：原虫
SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测疑似传染病的血样本及蚊虫样本中症原虫的环介导恒温核酸扩增（LAMP）法
本部分适用于国境口岸对症原虫的筛选检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文（包括所有的修改单）适用于本文件。件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用WS259症疾的诊断
SN/T3562国境口岸症原虫PCR检测方法人间传染的病原微生物名录卫生部（卫科教发【2006715号）3缩略语
下列缩略语适用于本文件
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicdNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenedianine tetraacetic acid)Lamplification
LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalTritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚4生物安全措施及防污染措施
实验操作及处理按照GB19489和人间传染的病原微生物名录》的规定，由具备相关资质的工作人员进行。www.bzxz.net
防止污染措施应符合WS/T230的规定5技术概要
根据症原虫的特异性毒力基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对，共三对引物，特异性识别靶序列上的SSUrRNA基因，利用BstDNA聚合酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互1
SN/T3306.13-2017
补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可通过加人显色液，通过颜色变化观察判定结果。试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求6.1引物。
根据症原虫特有的SSUrRNA靶序列基因（X13926.1)设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2.内引物1.内引物2和环状引物1，环状引物2。外引物1(F3，5'-3）：GGAATGATGGGAATTTAAAACCT外物2(B3.53）：ACGAAGTATCAGTTATGTGGAT内引物1(FIP，5-3\）：CTATTGGAGCTGGAATTACCGCTCCCAAAACTCAATTGGAGG内引物2(BIP,5-3）：AATTGTTGCAGTTAAAACGCTCGTAAGCTAGAAGCGTTGCT环状引物1（LF，5-3）：GCTGCTGGCACCAGACTT环状引物2(LB.5.-3）：AGTTGAATTTCAAAGAATCG6.2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl(pH8.0）.2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-100。6.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L6.4BstDNA聚合酶：8U/μL。
6.510XThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.8）、100mmol/L（NH）.SOa、100mmol/L.KCl.20mmol/LMgSO4.1%TritonX-100。6.6MgSO溶液：25mmol/L。
甜菜碱：5mol/L。
显色液：浓度为1000×SYBRGreenI。6.8
阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。0.2mL和1.5mL塑料离心管
吸头，配套移液器使用。
仪器和设备
移液器：量程0.1μL2μL，量程0.5μL~10μL，量程10μL~100μL，量程100μL~1000μL7.1
7.2高速台式离心机：≥7000g。7.3水浴锅或加热模块：65℃土1℃和100℃±1℃。7.4
组织研磨器。
5计时器。
3检测程序
疤原虫检测程序见图1。
9操作步骤
样本的采集、保存和运输
特测样品
样品前处理
模板DNA提取
LAMP反应
结果报告
经涂片显微镜检/抗原检测确认
图1原虫LAMP检测程序
样本采集、保存和运输按照SN/T3562执行。9.2蚊虫样本前处理
SN/T3306.13—2017
将待见蚊虫标本每组分别用含青霉素（1000U/mL）、链霉素（1000U/mL）的无菌生理盐水清洗三次，每组蚊样加入2.0mLHanks液，在组织研磨器中研磨或电动匀浆机中匀浆20s~30s，使样本匀浆成糊状，12000r/min离心3min，取上清液作为样本。9.3模板DNA提取
从血样本和蚊虫样本中提取DNA按照SN/T3562执行。9.4环介导恒温扩增
反应体系
症原虫的环介导引物恒温扩增反应体系见表1。SN/T3306.13—2017
试剂名称
10xThermoPol缓冲液
F3引物
B3引物
FIP引物
BIP引物
LF引物
LB引物
甜菜碱
硫酸镁溶液
BstDNA聚合酶
反应过程
表1症原虫环介导引物恒温扩增反应体系储备液浓度
10μmol/L
10μmol/L
doμmol/1
40pmol/L
100μmol/L
100pum
mmol/L
5mol/L
150mmol/L
8U/μL
按照表1所述配制反应体系，上
述组分
体系加样量
勾并短暂离心后加人10μL的凡士林（密封轻柔混
液），最后将1μL的显色液加人反应管顶端。盖上管盖后，置于F65℃恒温扩增60min，观察结果。空白对照、阴性对照、阳性对照设置9.4.3
每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照空白对照则采用无菌水作为扩增模板。阴性对照以DNA提取液代替DNA模板阳性对照以含检测序列的质粒DNA作为扩增模板。9.5
5结果观察
取出反应管，短暂离心使反应管盖中显色液进入反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化，判断结果。
结果判定
SN/T3306.132017
在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：a
阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，则报告为LAMP检测阳性。如需通过涂片显微镜检及抗原检测对上述检测结果进行确认，则按WS259执行。阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，则报告为LAMP检测阴性。5
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