SN/T 3306.9-2017
基本信息
标准号： SN/T 3306.9-2017
中文名称：国境口岸环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第9部分:结核分枝杆菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 国境 口岸 介导 恒温 扩增 检测 方法 结核 分枝杆菌
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3306.9-2017.Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 9 :Mycobacterium tuberculosis.
1范围
SN/T 3306.9规定了国境口崇检测疑似传染病的疾样本中结核分枝杆菌的环介导恒温核酸扩增(LAMP)法。
SN/T 3306.9适用于国境口岸结核分枝杆菌的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规程和试验方法
GB 19489实验室生物安全通用要求
WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
WS 288肺结核诊断标准
(卫科教发(2006)15号)《人间传染的病原微生物名录》
4生物安全措施及防污染措施
实验操作及处理按照GB 19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定,由具备相关资质的工作人员进行。
防止污染措施应符合WS/T 230的规定。
5技术概要
根据结核分枝杆菌的特异性毒力基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对,共6条引物,特异性识别靶序列上的gurB基因,利用Bst酶启动循环链置换反应,在特异性基因序列启动互补链合成,在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产生副产物(焦磷酸镁)形成乳白色沉淀,即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可通过加入显色液,通过颜色变化观察判定结果。
1范围
SN/T 3306.9规定了国境口崇检测疑似传染病的疾样本中结核分枝杆菌的环介导恒温核酸扩增(LAMP)法。
SN/T 3306.9适用于国境口岸结核分枝杆菌的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规程和试验方法
GB 19489实验室生物安全通用要求
WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
WS 288肺结核诊断标准
(卫科教发(2006)15号)《人间传染的病原微生物名录》
4生物安全措施及防污染措施
实验操作及处理按照GB 19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定,由具备相关资质的工作人员进行。
防止污染措施应符合WS/T 230的规定。
5技术概要
根据结核分枝杆菌的特异性毒力基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对,共6条引物,特异性识别靶序列上的gurB基因,利用Bst酶启动循环链置换反应,在特异性基因序列启动互补链合成,在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产生副产物(焦磷酸镁)形成乳白色沉淀,即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可通过加入显色液,通过颜色变化观察判定结果。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3306.9—2017
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第9部分：结核分枝杆菌
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part9.Mycobacterium tuberculosis2017-05-12发布
中华人民共和国
宝国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》分为14个部分：第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌：
第3部分：志贺氏菌；
第4部分：嗜肺军团菌；
第5部分：布鲁氏菌；
第6部分：黄热病毒；
第7部分：猴痘病毒；
第8部分：基孔肯雅病毒；
第9部分：结核分枝杆菌：
第10部分：炭疽芽孢杆菌：
第11部分：副溶血性弧菌；
第12部分：空肠弯曲菌：
第13部分：症原虫：
第14部分：大肠杆菌0157：H7。本部分为SN/T3306的第9部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T3306.9—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分起草单位：天津国际旅行卫生保健中心，河北国际旅行卫生保健中心唐山分中心、黑龙江国际旅行卫生保健中心、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本部分主要起草人：左锋，滑娜，翰文东，邵柏赵辉，潘娟祁军1
1范围
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第9部分：结核分枝杆菌
SN/T3306的本部分规定了国境口酸扩增（LAMP)法。
本部分适用于国境口岸结核分枝杆菌的筛选检测2规范性引用文件
SN/T3306.9—2017
吉核分枝杆菌的环介导恒温核
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规程和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求WS/T230—2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）WS288肺结核诊断标准
（卫科教发（2006)15号）《人间传染的病原微生物名录3缩略语
下列缩略语适用于本文件，
Betaine：甜菜碱。
Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）BstDNApolymerase（largefragment）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediamineteteticacid)
LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚4生物安全措施及防污染措施
实验操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定，由具备相关资质的工作人员进行。
防止污染措施应符合WS/T230的规定。5技术概要
根据结核分枝杆菌的特异性毒力基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对，共6条引物，特一
SN/T3306.9—2017
异性识别靶序列上的gurB基因，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可通过加人显色液，通过颜色变化观察判定结果。6试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。6.1引物。
根据结核分枝杆菌特有的靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1,环状引物2。外引物1(F3，5-3）：GCCTGACCATCAACCTCAC外引物2(B3.5-3）.CAGTGGTTTCGAAAACAGC内引物1（FIP，5-3）：AGACCACTCGTACCCGTCGCCGGTGGTTAACGCGCTAT内引物2(BIP，5-3）：ATGAGAAGTCGGAACCCCTGGGACCGTTGACCCCGTCTTC环状引物1(LF，5-3）：TTGATCTCGACTTCGAGCC环状引物2（LB，5-3\）：CCTCAAGCAAGGGGCG6.2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl(pH8.0）、2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-100。6.3dNTP:10mmol/L。
6.4BstDNA聚合酶：8U/μL。
10×ThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.8）、100mmol/L（NH),SO4100mmol/LKCl、20mmol/LMgSO..1%Tritonx-100。6.6
5MgClz:25mmol/L
甜菜碱：5mol/L。
显色液：浓度为1000XSYBRGreen1。阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。仪器和设备
7.1移液器：量程0.1μL～2μ，量程10μ~100μL，量程100μ~1000μ。7.2高速台式离心机：≥7000g。7.3水浴锅或加热模块：65℃±1℃和100℃土1℃。7.4计时器。
8检测程序
结核分枝杆菌LAMP检测程序见图1。2
9操作步骤
9.1样本前处理
特测样品
样品前处理
模板DNA提取
LAMP反应
结果报告
图1结核分枝杆菌LAMP检测程序
9.1.1痰液样本的收集制备按照附录A（痰液标本采集、保存及送样要求）。SN/T3306.9—2017
9.1.2痰液样本液化：取约5ml痰液中加人1倍~2倍体积的4%NaOH溶液，涡旋振荡器振荡混匀，室温下放置20min30min，使其充分液化（无明显固状物且吸出时无拖丝现象，若未达到完全液化可适当加入少量4%的NaOH溶液直至液化完全）。9.1.3痰液样本洗涤：取1mL液化后痰液至1.5mL离心管，14000g离心10min，尽可能完全倾倒上清液，倾倒后剩余的少量液体需要用移液器吸净（注意不要碰触到沉淀物）；沉淀用1mL生理盐水（0.9%w/vNaCI）悬浮，同上离心条件洗涤2次。保留沉淀物，备用。9.2模板DNA的制备
9.2.1参照WS/T230一2002中5.3样本处理中的原则制备检测模板。可采用下述方法，也可使用等效的商品化DNA提取试剂盒，按照其说明提取制备模板。9.2.2阳性对照制备：合成结核分枝杆菌目的序列，制备克隆质粒。9.2.3前处理样本模板DNA的制备：将9.1处理后的样本离心管中加人40μLDNA提取液，震荡混匀或移液器吹打混匀。沸水浴10min，冷却至室温，7000g离心5min，上清液做模板备用。避免将DNA提取液中的颗粒物质吸出。
9.3环介导恒温扩增
9.3.1反应体系
结核分枝杆菌LAMP反应体系见表1。SN/T3306.9—2017
10×ThermoPol缓冲液
外侧上游引物（F3）
外侧下游引物（B3）
内侧上游引物（FIP）
内侧下游引物（BIP）
环状上游引物（LF)
环状下游引物（LB）
甜菜碱
BstDNA聚合酶
DNA模板
去离子水
反应过程
表1结核分枝杆菌LAMP反应体系
工作液浓度
20μmol/L
20μmol/L
100μmol/L
100μmol/L
100umol/
1bopmol/L
lommol/L
25mmol/L
5mol/L
8U/μl
加样量/μL
反应体系终浓度
0.2μmol/L
0.2μmol/L
1.6μmol/L
1.6μmol/L
0.8μmol/L
0.8μmol/L
1.4mmol/L
6.0mmol/L
0.16U/μL
按照表1所述配制反应体系，上述组分加人后，轻柔混匀并短暂离心后加人10的凡士林（密封液），最后将1L的显色液加人反应管顶端。
空白对照、阴性对照、阳性对照设置应包括以下儿项：
盖上管
F盖后.置于65℃恒温扩增60min，观察结果。每次反应应设置阴性对照、空白对日性对照
照和阳
空白对照以无菌水代替DNA模板
阴性对照以DNA提取液代替DNA模板c）
9.4结果观察
取出反应管，短暂离心使反应管盖中显色液进人反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化，判断结果。
结果判定
在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，报告为LAMP检测阳性。如需对阳性结果做进一步a
确认，按照WS288执行。
阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，报告为LAMP检测阴性。A.1bzxZ.net
采集要求
取样容器
附录A
（规范性附录）
痰液标本采集、保存及送样要求SN/T3306.9—2017
塑料盒收集痰标本。痰容器应标明可采用世界卫生组织推荐的国际通用螺旋盖痰瓶或可用密封患者姓名，编号，检查项目和容器序号A.1.2样本类型
深呼吸后咳出的痰液。
A.1.3样本采集
深吸气2次～3次，每次用力呼出，从肺部深处咳出痰，将打开盖的痰盒靠近嘴边收集痰液，打紧盒盖。
A.2送样要求
1h内把标本送到实验室
本应有明显标记，并附有相应的送检单。杯
A.3标本的采集、保存、运送
储藏要求
分别把采集的标本放人洁净无
如果刚吃过食物，应先用清
应注意以下几点：
首的合适容器内，
，密封，做好标记。
水漱口再留取痰标本；
标本内不得加人任何有碍细菌生长的物质；送检标本应一4℃冷藏保存：
冷冻标本应在一20℃以下保存，可长期保存待5
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国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第9部分：结核分枝杆菌
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part9.Mycobacterium tuberculosis2017-05-12发布
中华人民共和国
宝国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》分为14个部分：第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌：
第3部分：志贺氏菌；
第4部分：嗜肺军团菌；
第5部分：布鲁氏菌；
第6部分：黄热病毒；
第7部分：猴痘病毒；
第8部分：基孔肯雅病毒；
第9部分：结核分枝杆菌：
第10部分：炭疽芽孢杆菌：
第11部分：副溶血性弧菌；
第12部分：空肠弯曲菌：
第13部分：症原虫：
第14部分：大肠杆菌0157：H7。本部分为SN/T3306的第9部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T3306.9—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分起草单位：天津国际旅行卫生保健中心，河北国际旅行卫生保健中心唐山分中心、黑龙江国际旅行卫生保健中心、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本部分主要起草人：左锋，滑娜，翰文东，邵柏赵辉，潘娟祁军1
1范围
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法
第9部分：结核分枝杆菌
SN/T3306的本部分规定了国境口酸扩增（LAMP)法。
本部分适用于国境口岸结核分枝杆菌的筛选检测2规范性引用文件
SN/T3306.9—2017
吉核分枝杆菌的环介导恒温核
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规程和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求WS/T230—2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）WS288肺结核诊断标准
（卫科教发（2006)15号）《人间传染的病原微生物名录3缩略语
下列缩略语适用于本文件，
Betaine：甜菜碱。
Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）BstDNApolymerase（largefragment）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediamineteteticacid)
LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚4生物安全措施及防污染措施
实验操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定，由具备相关资质的工作人员进行。
防止污染措施应符合WS/T230的规定。5技术概要
根据结核分枝杆菌的特异性毒力基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对，共6条引物，特一
SN/T3306.9—2017
异性识别靶序列上的gurB基因，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，即可通过反应液中的浑浊程度判定结果。亦可通过加人显色液，通过颜色变化观察判定结果。6试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。6.1引物。
根据结核分枝杆菌特有的靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1,环状引物2。外引物1(F3，5-3）：GCCTGACCATCAACCTCAC外引物2(B3.5-3）.CAGTGGTTTCGAAAACAGC内引物1（FIP，5-3）：AGACCACTCGTACCCGTCGCCGGTGGTTAACGCGCTAT内引物2(BIP，5-3）：ATGAGAAGTCGGAACCCCTGGGACCGTTGACCCCGTCTTC环状引物1(LF，5-3）：TTGATCTCGACTTCGAGCC环状引物2（LB，5-3\）：CCTCAAGCAAGGGGCG6.2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl(pH8.0）、2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-100。6.3dNTP:10mmol/L。
6.4BstDNA聚合酶：8U/μL。
10×ThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.8）、100mmol/L（NH),SO4100mmol/LKCl、20mmol/LMgSO..1%Tritonx-100。6.6
5MgClz:25mmol/L
甜菜碱：5mol/L。
显色液：浓度为1000XSYBRGreen1。阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。仪器和设备
7.1移液器：量程0.1μL～2μ，量程10μ~100μL，量程100μ~1000μ。7.2高速台式离心机：≥7000g。7.3水浴锅或加热模块：65℃±1℃和100℃土1℃。7.4计时器。
8检测程序
结核分枝杆菌LAMP检测程序见图1。2
9操作步骤
9.1样本前处理
特测样品
样品前处理
模板DNA提取
LAMP反应
结果报告
图1结核分枝杆菌LAMP检测程序
9.1.1痰液样本的收集制备按照附录A（痰液标本采集、保存及送样要求）。SN/T3306.9—2017
9.1.2痰液样本液化：取约5ml痰液中加人1倍~2倍体积的4%NaOH溶液，涡旋振荡器振荡混匀，室温下放置20min30min，使其充分液化（无明显固状物且吸出时无拖丝现象，若未达到完全液化可适当加入少量4%的NaOH溶液直至液化完全）。9.1.3痰液样本洗涤：取1mL液化后痰液至1.5mL离心管，14000g离心10min，尽可能完全倾倒上清液，倾倒后剩余的少量液体需要用移液器吸净（注意不要碰触到沉淀物）；沉淀用1mL生理盐水（0.9%w/vNaCI）悬浮，同上离心条件洗涤2次。保留沉淀物，备用。9.2模板DNA的制备
9.2.1参照WS/T230一2002中5.3样本处理中的原则制备检测模板。可采用下述方法，也可使用等效的商品化DNA提取试剂盒，按照其说明提取制备模板。9.2.2阳性对照制备：合成结核分枝杆菌目的序列，制备克隆质粒。9.2.3前处理样本模板DNA的制备：将9.1处理后的样本离心管中加人40μLDNA提取液，震荡混匀或移液器吹打混匀。沸水浴10min，冷却至室温，7000g离心5min，上清液做模板备用。避免将DNA提取液中的颗粒物质吸出。
9.3环介导恒温扩增
9.3.1反应体系
结核分枝杆菌LAMP反应体系见表1。SN/T3306.9—2017
10×ThermoPol缓冲液
外侧上游引物（F3）
外侧下游引物（B3）
内侧上游引物（FIP）
内侧下游引物（BIP）
环状上游引物（LF)
环状下游引物（LB）
甜菜碱
BstDNA聚合酶
DNA模板
去离子水
反应过程
表1结核分枝杆菌LAMP反应体系
工作液浓度
20μmol/L
20μmol/L
100μmol/L
100μmol/L
100umol/
1bopmol/L
lommol/L
25mmol/L
5mol/L
8U/μl
加样量/μL
反应体系终浓度
0.2μmol/L
0.2μmol/L
1.6μmol/L
1.6μmol/L
0.8μmol/L
0.8μmol/L
1.4mmol/L
6.0mmol/L
0.16U/μL
按照表1所述配制反应体系，上述组分加人后，轻柔混匀并短暂离心后加人10的凡士林（密封液），最后将1L的显色液加人反应管顶端。
空白对照、阴性对照、阳性对照设置应包括以下儿项：
盖上管
F盖后.置于65℃恒温扩增60min，观察结果。每次反应应设置阴性对照、空白对日性对照
照和阳
空白对照以无菌水代替DNA模板
阴性对照以DNA提取液代替DNA模板c）
9.4结果观察
取出反应管，短暂离心使反应管盖中显色液进人反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化，判断结果。
结果判定
在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，报告为LAMP检测阳性。如需对阳性结果做进一步a
确认，按照WS288执行。
阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，报告为LAMP检测阴性。A.1bzxZ.net
采集要求
取样容器
附录A
（规范性附录）
痰液标本采集、保存及送样要求SN/T3306.9—2017
塑料盒收集痰标本。痰容器应标明可采用世界卫生组织推荐的国际通用螺旋盖痰瓶或可用密封患者姓名，编号，检查项目和容器序号A.1.2样本类型
深呼吸后咳出的痰液。
A.1.3样本采集
深吸气2次～3次，每次用力呼出，从肺部深处咳出痰，将打开盖的痰盒靠近嘴边收集痰液，打紧盒盖。
A.2送样要求
1h内把标本送到实验室
本应有明显标记，并附有相应的送检单。杯
A.3标本的采集、保存、运送
储藏要求
分别把采集的标本放人洁净无
如果刚吃过食物，应先用清
应注意以下几点：
首的合适容器内，
，密封，做好标记。
水漱口再留取痰标本；
标本内不得加人任何有碍细菌生长的物质；送检标本应一4℃冷藏保存：
冷冻标本应在一20℃以下保存，可长期保存待5
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