SN/T 3306.8-2017
基本信息
标准号： SN/T 3306.8-2017
中文名称：国境口岸环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第8部分:基孔肯雅病毒
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 国境 口岸 介导 恒温 扩增 检测 方法 基孔 肯雅 病毒
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3306.8-2017.Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 8 :Chikungunya virus.
1范围
SN/T 3306.8规定了国境口岸入出境人员感染及口岸蚊媒携带基孔肯雅病毒环介导恒温扩增(LAMP)法核酸检验规程，包括样本采集、处理、检验程序、方法,结果判定及报告。
SN/T 3306.8适用于人出境口岸人员感染及蚊媒携带基孔肯雅病毒的实验室快速检验。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改版)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通 用要求
SN/T2300-2009国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法
SN/T 3560-2013国境口岸黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法
人间传染的病原微生物名录[卫科教发(2006)15号]
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1基孔肯雅病毒chikungunya virus
一种属于披膜病毒科甲病毒属,基因组为单股正链RNA的病毒,病毒颗粒呈球形,有包膜,平均直径42 nm,相对分子质量为4.3X10的八次方,沉降系数为46S。该病毒感染人可引起基孔肯雅热，主要临床表现为发热、关节疼痛、皮疹和轻度出血等。
3.2环介导恒温扩增检测方法loop-mediated isothermal amplification detection methocl
一种新的恒温核酸扩增方法,其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30 min~60 min,即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比,不需要模板的热变性.温度循环、电泳及紫外观察等过程。
1范围
SN/T 3306.8规定了国境口岸入出境人员感染及口岸蚊媒携带基孔肯雅病毒环介导恒温扩增(LAMP)法核酸检验规程，包括样本采集、处理、检验程序、方法,结果判定及报告。
SN/T 3306.8适用于人出境口岸人员感染及蚊媒携带基孔肯雅病毒的实验室快速检验。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改版)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通 用要求
SN/T2300-2009国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法
SN/T 3560-2013国境口岸黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法
人间传染的病原微生物名录[卫科教发(2006)15号]
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1基孔肯雅病毒chikungunya virus
一种属于披膜病毒科甲病毒属,基因组为单股正链RNA的病毒,病毒颗粒呈球形,有包膜,平均直径42 nm,相对分子质量为4.3X10的八次方,沉降系数为46S。该病毒感染人可引起基孔肯雅热，主要临床表现为发热、关节疼痛、皮疹和轻度出血等。
3.2环介导恒温扩增检测方法loop-mediated isothermal amplification detection methocl
一种新的恒温核酸扩增方法,其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30 min~60 min,即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比,不需要模板的热变性.温度循环、电泳及紫外观察等过程。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3306.8—2017
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第8部分：基孔肯雅病毒
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part8：Chikungunyavirus
2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》分为14个部分：第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌；
第3部分：志贺氏菌：
第4部分：嗜肺军团菌：
第5部分：布鲁氏菌；
第6部分：黄热病毒；
第7部分：猴痘病毒；
第8部分：基孔肯雅病毒：
第9部分：结核分枝杆菌；
第10部分：炭疽芽孢杆菌；
第11部分：副溶血性弧菌：
第12部分：空肠弯曲菌：
第13部分：症原虫；
第14部分：大肠杆菌0157：H7。本部分为SN/T3306的第8部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3306.8—2017
本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、广东国际旅行卫生保健中心中华人民共和国汕头出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：李小波、李燕、朱俊贤、张显光、郑、师永霞、黄吉城、戴俊、苏锦坤。1范围
SN/T3306.8—2017
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第8部分：基孔肯雅病毒
SN/T3306的本部分规定了国境口岸入出境人员感染及口岸蚊媒携带基孔肯雅病毒环介导恒温扩增（LAMP)法核酸检验规程，包括样本采集、处理、检验程序、方法，结果判定及报告。本部分适用于人出境口岸人员感染及蚊媒携带基孔背雅病毒的实验室快速检验。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2300一2009国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法SN/T3560一2013国境口岸黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法
人间传染的病原微生物名录卫科教发（2006）15号3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
基孔肯雅病毒chikungunyavirus一种属于披膜病毒科甲病毒属，基因组为单股正链RNA的病毒，病毒颗粒呈球形，有包膜，平均直径42nm，相对分子质量为4.3×10°，沉降系数为46S。该病毒感染人可引起基孔肯雅热，主要临床表现为发热、关节疼痛、皮疹和轻度出血等。3.2
环介导恒温扩增检测方法loop-mediated isothermalamplification detectionmethocl一种新的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（63℃左右）保温30min～60min，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
LAMP：环介导恒温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification）F3：LAMP反应正向外引物（Forwardouterprimer）B3：LAMP反应反向外引物（Backwardouterprimer）FIP：LAMP反应正向内引物（Forwardinnerprimer）BiP：LAMP反应反向内引物（Backwardinnerprimer）1
SN/T3306.8—2017
5仪器和设备
仪器和设备如下
生物安全柜；
高压灭菌器；
普通冰箱；
水浴锅或金属浴；
冷冻离心机（带密封的离心安全杯）。6试剂和引物
需要如下试剂：
市售商品化核酸提取试剂如QIAGEN公司的RNA提取试剂盒\；BstDNA聚合酶；
市售商品化LAMP专用反应试剂RM市售商品化逆转录试剂如PrimeSeriptTMRTreagentkit逆转录试剂盒；灭菌双蒸水。
6.2LAMP检测的引物
引物组合序列如下：
F3：5*-CGCCCTCTT
GGACATG-3此内容来自标准下载网
B3.5'-AATTCGGCGCTGGCTAAG-3
FIP.5*-TGCCTTTCTTGCT
TGGCTGCA
BIP.5-AGTGTGCGGT
7样本采集
A-TACCAGCCTGCACCCATT-3
GCATTCGATGA-TGCAGCTGAGAATTCCCTTC-3\7.1人血液样本采集按SNXT3560-2013相关内容进行蚊虫样本采集按SN/T2300-2009相关内容进行7.2
8样本处理
8.1血样样本处理按SN/T3560—2013相关内容进行。8.2蚊虫样本处理按SN/T2300—2009相关内容进行。8.3RNA提取按照试剂盒说明书进行。9LAMP检测
9.1cDNA模板制备
cDNA制备利用PrimeScriptTMRTreagentkit逆转录试剂盒进行，4OμLcDNA合成反应体系1),2)3）
由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本部分的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品，2
如下：
5Xbuffer
EnzymeMix
OligodTprimer
-Random6mers
9.2LAMP反应体系
构建25μL的LAMP反应体系：
反应液RM
引物混合物PM
BstDNA聚合酶
灭菌双蒸水
9.3One-stepRT-LAMP反应体系
8μL；
20μL。
12.5pL：
SN/T3306.8—2017
1μL（其中FIP反应终浓度1.6μmol/L.BIP1.6μmol/L，F3nol/L.B30.2μmol/L);
构建25μL的One-stepRT-LAMP反应体系反应液RM
引物混合物PM
BstDNA聚合酶
AMV逆转录酶
灭菌双蒸水
9.4反应程序
1μL(其中FIP反应终浓度1.6μmol/L，BIP1.6μmol/L，F30.2μniol/L,B30.2μmol/L)
上述组分加人后，轻柔混勾并短暂离心后加人10μL的凡士林（密封液），最后将1μL的SYBRGREENI(显色液）加入反应管顶盖。盖上管盖后，置于63℃的水浴锅或金属浴进行反应，反应60min。LAMP及One-stepRT-LAMP反应均应用该反应条件。10结果判断
取出反应管，短暂离心使反应管顶盖中的显色液进人反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化判断实验结果。若反应液呈绿色，则检测结果为阳性；若呈橙色，则为阴性。11结果报告
11.1检测结果为阳性则报告为标本LAMP检测阳性。11.2检测结果为阴性则报告为标本LAMP检测阴性。3
SN/T3306.8—2017
生物安全措施
实验室生物安全要求按照附录A执行。附录A
（规范性附录）
实验室生物安全要求
SN/T3306.8—2017
中华人民共和国卫计委发布的《人间传染的病原微生物名录》（2006）规定，基孔肯雅病毒危害程度分类为第二类，所有有关基孔肯雅病毒的实验室操作应按照以下规定执行：a）
基孔肯雅病毒培养和动物感染实验须在生物安全三级（BSL-3)实验室内进行b）
未经培养的基孔肯雅病毒感染性材料的操作须在生物安全二级（BSL-2)实验室内进行。c）
基孔肯雅病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1)实验室内进行。
基孔肯雅病毒感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。其他要求按GB19489进行。
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国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第8部分：基孔肯雅病毒
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part8：Chikungunyavirus
2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》分为14个部分：第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌；
第3部分：志贺氏菌：
第4部分：嗜肺军团菌：
第5部分：布鲁氏菌；
第6部分：黄热病毒；
第7部分：猴痘病毒；
第8部分：基孔肯雅病毒：
第9部分：结核分枝杆菌；
第10部分：炭疽芽孢杆菌；
第11部分：副溶血性弧菌：
第12部分：空肠弯曲菌：
第13部分：症原虫；
第14部分：大肠杆菌0157：H7。本部分为SN/T3306的第8部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3306.8—2017
本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、广东国际旅行卫生保健中心中华人民共和国汕头出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：李小波、李燕、朱俊贤、张显光、郑、师永霞、黄吉城、戴俊、苏锦坤。1范围
SN/T3306.8—2017
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第8部分：基孔肯雅病毒
SN/T3306的本部分规定了国境口岸入出境人员感染及口岸蚊媒携带基孔肯雅病毒环介导恒温扩增（LAMP)法核酸检验规程，包括样本采集、处理、检验程序、方法，结果判定及报告。本部分适用于人出境口岸人员感染及蚊媒携带基孔背雅病毒的实验室快速检验。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2300一2009国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法SN/T3560一2013国境口岸黄热病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法
人间传染的病原微生物名录卫科教发（2006）15号3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
基孔肯雅病毒chikungunyavirus一种属于披膜病毒科甲病毒属，基因组为单股正链RNA的病毒，病毒颗粒呈球形，有包膜，平均直径42nm，相对分子质量为4.3×10°，沉降系数为46S。该病毒感染人可引起基孔肯雅热，主要临床表现为发热、关节疼痛、皮疹和轻度出血等。3.2
环介导恒温扩增检测方法loop-mediated isothermalamplification detectionmethocl一种新的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（63℃左右）保温30min～60min，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
LAMP：环介导恒温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification）F3：LAMP反应正向外引物（Forwardouterprimer）B3：LAMP反应反向外引物（Backwardouterprimer）FIP：LAMP反应正向内引物（Forwardinnerprimer）BiP：LAMP反应反向内引物（Backwardinnerprimer）1
SN/T3306.8—2017
5仪器和设备
仪器和设备如下
生物安全柜；
高压灭菌器；
普通冰箱；
水浴锅或金属浴；
冷冻离心机（带密封的离心安全杯）。6试剂和引物
需要如下试剂：
市售商品化核酸提取试剂如QIAGEN公司的RNA提取试剂盒\；BstDNA聚合酶；
市售商品化LAMP专用反应试剂RM市售商品化逆转录试剂如PrimeSeriptTMRTreagentkit逆转录试剂盒；灭菌双蒸水。
6.2LAMP检测的引物
引物组合序列如下：
F3：5*-CGCCCTCTT
GGACATG-3此内容来自标准下载网
B3.5'-AATTCGGCGCTGGCTAAG-3
FIP.5*-TGCCTTTCTTGCT
TGGCTGCA
BIP.5-AGTGTGCGGT
7样本采集
A-TACCAGCCTGCACCCATT-3
GCATTCGATGA-TGCAGCTGAGAATTCCCTTC-3\7.1人血液样本采集按SNXT3560-2013相关内容进行蚊虫样本采集按SN/T2300-2009相关内容进行7.2
8样本处理
8.1血样样本处理按SN/T3560—2013相关内容进行。8.2蚊虫样本处理按SN/T2300—2009相关内容进行。8.3RNA提取按照试剂盒说明书进行。9LAMP检测
9.1cDNA模板制备
cDNA制备利用PrimeScriptTMRTreagentkit逆转录试剂盒进行，4OμLcDNA合成反应体系1),2)3）
由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本部分的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品，2
如下：
5Xbuffer
EnzymeMix
OligodTprimer
-Random6mers
9.2LAMP反应体系
构建25μL的LAMP反应体系：
反应液RM
引物混合物PM
BstDNA聚合酶
灭菌双蒸水
9.3One-stepRT-LAMP反应体系
8μL；
20μL。
12.5pL：
SN/T3306.8—2017
1μL（其中FIP反应终浓度1.6μmol/L.BIP1.6μmol/L，F3nol/L.B30.2μmol/L);
构建25μL的One-stepRT-LAMP反应体系反应液RM
引物混合物PM
BstDNA聚合酶
AMV逆转录酶
灭菌双蒸水
9.4反应程序
1μL(其中FIP反应终浓度1.6μmol/L，BIP1.6μmol/L，F30.2μniol/L,B30.2μmol/L)
上述组分加人后，轻柔混勾并短暂离心后加人10μL的凡士林（密封液），最后将1μL的SYBRGREENI(显色液）加入反应管顶盖。盖上管盖后，置于63℃的水浴锅或金属浴进行反应，反应60min。LAMP及One-stepRT-LAMP反应均应用该反应条件。10结果判断
取出反应管，短暂离心使反应管顶盖中的显色液进人反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化判断实验结果。若反应液呈绿色，则检测结果为阳性；若呈橙色，则为阴性。11结果报告
11.1检测结果为阳性则报告为标本LAMP检测阳性。11.2检测结果为阴性则报告为标本LAMP检测阴性。3
SN/T3306.8—2017
生物安全措施
实验室生物安全要求按照附录A执行。附录A
（规范性附录）
实验室生物安全要求
SN/T3306.8—2017
中华人民共和国卫计委发布的《人间传染的病原微生物名录》（2006）规定，基孔肯雅病毒危害程度分类为第二类，所有有关基孔肯雅病毒的实验室操作应按照以下规定执行：a）
基孔肯雅病毒培养和动物感染实验须在生物安全三级（BSL-3)实验室内进行b）
未经培养的基孔肯雅病毒感染性材料的操作须在生物安全二级（BSL-2)实验室内进行。c）
基孔肯雅病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1)实验室内进行。
基孔肯雅病毒感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。其他要求按GB19489进行。
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