SN/T 4849.3-2017.Identification of the ingredients of common small berry fruits in food and juice for export Real-time PCR method- Part 3 : Blackcurrant.
1范围
SN/T 4849.3规定了出口食品及饮料中黑加仑成分的检测方法实时荧光PCR法。
SN/T 4849.3适用于鲜果、冷冻果蜜饯、鲜榨果汁、果肉型果汁、果干、果酱等以黑加仑为原辅料的初加工食品及饮料中黑加仑成分的定性检测(清汁及果酒除外)。本部分所规定方法的最低检出限(LOD)为1%(体积比)。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。儿是注目期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403- 2008 实 验室质量控制规范食 品分子生物学检测
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1小浆果small berry fruits
浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果,由一个或几个心皮形成。小浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果。
3.1.2黑加仑blackcurrant
虎耳草目醋栗科醋栗属植物黑色果实，小浆果，果实近圆形，熟时黑色。拉丁文名: Ribes nigrum L..
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)。
PCR:聚合酶链式反应( polymerase chain reaction)。
Ct值:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
dNTP:脱氧核苷酸三磷酸( deoxyribonuleoside triphosphate)。
dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)。
dCTP:脱氧胞苷三磷酸( deoxycytidine triphosphate)。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4849.3—2017
出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法
实时荧光PCR法
第3部分：黑加仑
Identification of the ingredients of common small berryfruits in food and juice for export Real-timePCRmethod-Part3:Blackcurrant2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T4849《出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法6个部分：
第1部分：蓝莓；
第2部分：树莓；
第3部分：黑加仑；
第4部分：桑甚：
第5部分：蔓越莓和蓝莓；
第6部分：猕猴桃。
本部分为SN/T4849的第3部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4849.3—2017
实时荧光PCR法》系列标准共分为请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国伊型出人境检验检疫局本部分主要起草人：陈颖、黄文胜、邓婷婷、吴亚君、杨艳歌、乾义柯、韩建勋、张九凯、刘鸣畅1范围
出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法
第3部分：黑加仑
SN/T4849.3—2017
SN/T4849的本部分规定了出口食品及饮料中黑加仑成分的检测方法实时荧光PCR法。本部分适用于鲜果、冷冻果、
蜜钱鲜榨果汁、果肉型果汁、果干果酱等以黑加仑为原辅料的初加工食品及饮料中黑加仑成分的定性检测（清汁及果酒除外）。本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为1%（体积比）。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
small berry fruit
小浆果
浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成。小浆果则泛指果实较小、多汁的
黑加仑blackcurrant
美浆果
虎耳草目醋栗科醋栗属植物黑色果实，小浆果，果实近圆形，熟时黑色。拉丁文名：Ribesnigrum L..
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）。PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）。Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）。dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）。dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）。SN/T4849.3—2017
dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）。dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）。UNG：尿嘧啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase）。CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（cetyltrithylammoniumbromide）。Tris：三羟甲基氨基甲烷［Tris(Hydroxymethyl)aminomethane]。EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid)。Tag：水生栖热菌（Thermusaquaticus）。OD：光度密度（opticaldensity）。方法提要
果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA，果干、果酱、蜜饯先用蒸馏水清洗再提取DNA。以黑加仑果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。使用特异性引物探针进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在黑加仑成分。5试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
5.1检测用引物和探针：黑加仑成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1。黑加仑引物扩增的靶标序列参见附录A。黑加仑序列引物探针
物种名称
内参照
黑加仑
引物/探针序列（5'-3'）
F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACAR：AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCAP:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1F:TGCCCAAGCAGAGCTTCTG
R:CAACCAGGTAGCATTCCTTTGC
P:FAM-TTGGCTCATGCGACGCCCG-BHQI三氯甲烷（氯仿）。
异丙醇。
扩增片
段长度
靶基因
NADH dehydrogenase
subunit B(ndhB)gene
18SribosomalRNA(18S
rRNA)gene
CTAB提取缓冲液：20g/LCTAB1.4mol/LNaCl.0.1mol/LTris-HCl.0.02mol/LNazEDTA，pH8.0。
5.5CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。5.670%乙醇（体积分数）。
5.7蛋白酶K（20mg/mL）。
5.8实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U~2U（Unit，酶学单位）的Taq酶、1×PCRbuffer2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg2+、0.2U~1U的UNG酶，0.2mmol/L的d(A，CG）TPs.0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROx染料。2
SN/T4849.3—2017
5.910XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4).200mmol/LKCl,15mmol/LMgClz。6仪器设备Www.bzxZ.net
实时荧光PCR仪。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3
恒温水浴锅。
离心机：最大离心力不小干12000g。微量移液器：0.5μ10μ，10μ~100μ，20μ200μ，200μ~1000μ。粉碎装置。
涡旋震荡器。
pH计。
量筒：容量50mL。
烘箱。
7检测步骤
7.1样品前处理
鲜果、冷冻果样品直接粉碎，6000r/min离心，取沉淀物部分。果干、果酱、蜜饯类样品先用蒸馏水清洗3次，再粉碎。果汁样品取适量15000r/min离心30min，取沉淀部分。7.2DNA提取
取粉碎后的样品50mg~200mg，加人1mLCTAB提取缓冲液，同时加人0.01倍体积的20mg/mL蛋白酶K，65℃温育1h2h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加人适量CTAB提取缓冲液：取出后12000r/min离心10min，转移上清至2mL离心管中，加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混勾，12000r/min转速下离心10min；转移上清至另一灭菌的离心管中，再加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混勾，室温下12000r/min离心10min；转移上清至干净离心管中，加人等体积的CTAB沉淀液混勾，室温沉淀1h，弃上清，加人350μL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀；加入0.8倍体积的异丙醇或2倍体积一20℃冰箱中预冷的无水乙醇混勾，一20℃放置30min，12000r/min4℃离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。加人50μL～100μL双蒸水，室温10min，混匀，一20℃保存。上述模板DNA均可用等效DNA提取试剂盒提取。7.3DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按照式（1)计算：
C=AXNX50/1000
式中：
c—DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）：A——260nm处的吸光值；
N—核酸稀释倍数。
SN/T4849.3—2017
当A260/A280比值在1.7～2.0之间时，适宜于PCR扩增。7.4实时荧光PCR扩增
每个试样PCR反应应设置3个重复。7.4.1
2实时荧光PCR反应体系见表2。
表2实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应混合液
正向引物（10μmol
反向引物（10μmol/L）
探针（10μmol/L）
DNA模板（5ng/uL)
灭菌ddH0
7.4.3实时荧光PCR反应程月
E10min:95C15s.60℃1min.40
50℃2min；95℃预变性
7.5对照反应
7.5.1所有试样均应同时设置平行分及反应条件均与7.4一致。
7.5.2在试样PCR反应的同
个循环。
内参照检测与桑其特异性检测，各体系中除引物探针外，其余组置阴性对照、阳性对照和空
出应设量
外，其余组分及反应条件应与
8质量控制
以下条件有一条不满足时
，实验视为无效！
空白对照：无荧光对数增长，相应的C值>40.0
阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>40白对照，各对照反应体系中，除模板阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值≤30.0。9结果判断与表述
结果判定
在符合第8章的情况下，结果判定如下：Ct值<35.则判定为阳性。
b）35Ct值≥40，则判定为阴性。
结果表述
内参照阴性，目标成分阴性，表述为“未提到植物DNA组分”。内参照阳性，目标成分阳性，表述为“检出黑加仑成分”。9.2.2
内参照阳性，目标成分阴性，表述为“未检出黑加仑成分”。检测过程中防止交叉污染的措施SN/T4849.3—2017
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403一2008中附录D的规定执行。5
SN/T4849.3—2017
附录A
（资料性附录）
黑加仑18SrRNA基因扩增靶标参考序列（Genebank：AY138019.1)黑加仑18SrRNA基因扩增靶标参考序列（Genebank：AY138019.1)为：TGCCCAAGCAGAGCTTCTGTTGCTCAGCAAGAACGACAGTCGTGCTCGTGTTGACCTCTCCAGCATGCATATGCTTGGTTTGGCTCATGCGACGCCCGACTTCGCAAAGGAATGCTACCTGGTTG。
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