SN/T 4875-2017.Detection and identification of Lime witches’broom phytoplasma.
1范围
SN/T 4875规定了来檬丛枝植原体的检疫和鉴定方法。
SN/T 4875适用于进境来檬苗木中来檬丛枝植原体的检疫和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1157进出境植物苗木检疫规程
3来檬丛枝植原体基本信息
英文名:Lime witches’broom pbytoplasma
分类地位:软壁菌门(Tenericutes)，柔膜菌纲( Mollicutes)，非固醇菌原体目(Acholeplasmatales),非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae),植原体属(Phytoplasma),16S+II植原体组。
来檬丛枝植原体的其他信息参见附录A.
4方法原理
来檬丛枝植原体生物学特性和基因特性作为本标准鉴定方法的主要依据。
以组织材料症状观察、DAPI染色的形态学为初步筛查方法;以植原本核糖体16SrDNA序列特征为主要的判定依据。
5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
定性PCR仪、超净工作台.高压灭菌锅、台式冷冻离心机、纯水仪、台式小型离心机、冰箱、旋涡震荡
器、微量进样器、电泳仪、水浴锅.凝胶成像系统等。
5.2 用具
移液器、研钵、离心管、PCR管、量简、烧杯、酒精灯、镊子等。
5.3主要试剂
除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR反应体系用双蒸水。其他试剂比如各种溶液、缓冲液和培养基都是检测方法特有的，都应按附录B要求准备。商品化试剂参见其使用说明。
植物DNA提取试剂盒、PCR Premix、超纯水、DNA marker及DNA提取试剂等。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4875—2017
来檬丛枝植原体检疫鉴定方法
Detection and identification of Lime witches'broom phytoplasma2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4875—2017
本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国四川出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：王有福、李鑫、张婧、曹冬梅、胡强、刘卉秋、王秀芬、徐风敏。1范围
来檬丛枝植原体检疫鉴定方法
本标准规定了来檬丛枝植原体的检疫和鉴定方法本标准适用于进境来檬苗木中来檬丛枝植原体的检疫和鉴定。2规范性引用文件
SN/T4875—2017
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1157进出境植物苗木检疫规程3来檬丛枝植原体基本信息
英文名：Limewitches'broomphytoplasma分类地位：软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales）非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae)，植原体属（Phytoptasma），16SrⅡ植原体组。来檬丛枝植原体的其他信息参见附录A。4方法原理
来檬丛枝植原体生物学特性和基因特性作为本标准鉴定方法的主要依据。以组织材料症状观察、DAPI染色的形态学为初步筛查方法：以植原体核糖体16SrDNA序列特征为主要的判定依据。
5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
定性PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、台式冷冻离心机、纯水仪、台式小型离心机、冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、水浴锅、凝胶成像系统等。5.2用具
移液器，研钵，离心管，PCR管，量简，烧杯，酒精灯，镊子等。5.3主要试剂
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR反应体系用双蒸水。其他试剂比如各种溶液、缓冲液和培养基都是检测方法特有的，都应按附录B要求准备。商品化试剂参见其使用说明。
植物DNA提取试剂盒、PCRPremix、超纯水，DNAmarker及DNA提取试剂等。1
SN/T4875—2017
核酸提取研磨液（100mL）：K，HPO3HzO,2.17g：KH,PO.0.41g；蔗糖，10g；BSA（FractionV），0.15g;PVP-10.2g。pH7.6高温灭菌，4℃保存。DNA提取液：Tris-HCl,100mmol/L，EDTA，100mmol/L，NaCl,250mmol/L，调pH至8.0。50XTAE.2.0mol/LTris,1.0mol/LNaAc,50mmol/LEDTA,pH8.0。DAPI：4，6-二基-2-苯基吲哚。6检测鉴定方法
6.1症状观察
6.1.1现场查验
现场对来檬苗木进行观察，症状描述参见附录A，选取可疑症状植株样品和随机样品（具体取样方法见SN/T1157)带回实验室检测。6.1.2DAPI染色
选取幼嫩组织（新叶叶梗枝梢、茎秆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mLDAPI溶液染色，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。6.2DNA提取
取所选新鲜材料的韧皮部及叶中脉0.3g，或干材料0.1g，取适量液氮研磨，再加人研磨液2mL充分研磨，4℃12000r/min离心20min，弃上清液。加人500μLDNA提取液，20μL蛋白酶K（5mg/mL），轻轻混匀，加人80μL10%十二烷肌氨酸钠，混匀，在55℃温育1h~2h，4℃6000r/min，10min，取上清液。加入2/3体积异丙醇到上清液中，轻混勾，一20℃保持至少30min，4℃12000r/min，15min，弃上清液。加人600μLTE缓冲液，30μLSDS，12μL蛋白酶K（5mg/mL），混勺，37℃温育30min~60min。加100μL5mol/LNaCI混勾，再加人84μLCTAB/NaCl溶液混勾，65℃温育10min。加人等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1）混勾，4℃12000r/min，5min，重复直至无中间白色层。上清液加人2/3体积异丙醇，混勾，一20℃保持至少3min，4℃12000r/min，10min，弃上清液。加人1mL70%乙醇洗涤，12000r/min，1min。洗涤2次。加入30μLTE混匀溶解。一20℃冰冻保存。
注：也可采用商品试剂盒提取，但通常上述方法提取的核酸质量更优。6.3通用引物PCR扩增及序列测定用2对引物进行巢式PCR反应及凝胶电泳检测，方法见附录B。6.4序列分析鉴定bzxz.net
将第二轮PCR产物（引物R16F2/R2，产物大小为1239bp）进行序列测定，在Genebank中进行序列比对。
7结果判定
7.1形态学鉴定
表现症状与A.1描述一致且6.1.2检测实验中DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为植2
原体。
7.2分子生物学鉴定
SN/T4875—2017
初步判定为植原体病害的植物材料，经6.3和6.4步骤后，出现1239bp特异性条带，且该条带测序结果与genebank中来檬丛枝植原体（Limewitchesbroomphytoplasma）的相似度达99%以上，即可判定为来檬丛枝植原体。
8样品保存与复核
样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出来檬丛枝植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满6个月后须经高压灭菌后方可处理。8.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳照片，并附DNA测序结果。3
SN/T4875—2017
A.1表现症状及危害
附录A
（资料性附录）
来檬丛枝植原体资料
来檬丛枝植原体可感染整株植株，造成小叶、褪绿、小枝干死亡，直至没有正常的叶片和芽存在。感染该病的植株不能产生花和果实，且树木显症后4年～5年死亡。感染来檬丛枝植原体症状见图A.1。A.2寄主范围
来檬丛枝植原体唯一自然寄主是生长在阿拉伯半岛的来檬（Citrusaurantiifolia），可通过嫁接侵染长春花属（Catharanthus）植物、积橙（Citrange）等。A.3传播途径
可通过嫁接侵染长春花属植物、积橙等。据报道，范丝子，叶蝉均可作为该病害的传播介体。A.4地理分布
1975年左右，由来檬丛枝植原体引发的丛枝病在阿曼首次发现，在此之前，并无相似症状描述。从世界范围来看，病菌的突然出现，很可能是由其他地方引进的苗木携带而来。目前该有害生物在印度，伊朗、阿受、阿联首、墨西哥均有危害的报道。注：引自http：//invasive.org/browse/detail.cfm?imgnum=0746032。图A.1感染来檬丛枝植原体症状
引物序列
引物序列见表B.1。
第一轮PCR
第二轮PCR
引物名称
R16mF1
R16mR1
PCR反应体系及参数
PCR反应体系
PCR反应体系见表B.2。
试剂名称
附录B
（规范性附录）
PCR凝胶电泳检测
表B.1引物序列
引物序列5°-3
CAT GCAAGTC
GAACGGA
CTTAACCO
AATCATCC
TGCTGCT
TGA CGGGCG GTO
10XPCR缓冲液
2.5mmol/LdNTP
10μmol/L上游引物
10μmol/L下游引物
5U/μLTaqDNA聚合酶
10ng/μL模板DNA
双蒸水
总体积
AGACTGG
PCR 反应体系
加样量/μL
SN/T4875—2017
扩增产物长度
1416bp
1239bp
注：DNA模板的取量应根据DNA的提取浓度、纯度而调节：第一轮与第二轮PCR均采用此体系。B.2.2阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以健康的叶片DNA为模板。阳性对照：以携带有来檬从枝植原体16SrDNA序列的质粒或总DNA为模板。PCR反应的空白对照：以灭菌去离子水代替DNA模板。5
SN/T4875—2017
3PCR的反应条件
用引物R16mF1/R16mR1进行第一轮PCR。反应条件为：95℃/8min；95℃/60s，55℃/60s，72℃/90s，35个循环；72℃/10min。第一轮PCR产物用灭菌双蒸水1：50（体积比）稀释，取1μL为模板利用通用引物R16F2/R2进行第二轮PCR反应，反应体系见表B.2。反应条件同上。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。B.3测序
将上述第二轮PCR产物进行序列测定，并与Genebank中已知序列进行比对。B.4琼脂糖凝胶电泳
制备2%的琼脂糖凝胶，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪观察并记录结果。B.5结果判断
序列比对后，同源性达99%以上为阳性结果。
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