SN/T 0869-2017.Determination of ascorbic acid in beverage for export.
1范围
SN/T 0869规定了高效液相色谱法、荧光法测定出口饮料中抗坏血酸的测定方法。
SN/T 0869第一法适用于出口饮料中的L(+)-抗坏血酸总量和D(+ )-抗坏血酸的测定。第二法适用于出口饮料中L(+)-抗坏血酸总量的测定。
2规范性引 用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1抗坏血酸ascorbic acid
一种含有 6个碳原子 的酸性多羟基化合物,分L型和D型。
3.2L(+ )-抗坏血酸 L( + ) ascorbic acid
左式右旋光抗坏血酸。具有强还原性,对人体具有生物活性。
3.3D(+ )-抗坏血酸D( + ) ascorbic acid
又称异抗坏血酸。具有强还原性,但对人体基本无生物活性。
3.4L(+ )-脱氢抗坏血酸Dehydro-L( + ) ascorbic acid
L(十)-抗坏血酸极易被氧化为L(+ )-脱氢抗坏血酸,L( +)-脱氢抗坏血酸亦可被还原为L(+)-抗坏血酸。
3.5L(+ )-抗坏血酸总量 total ascorbic acid
将试样中L( + )-脱氢抗坏血酸还原成L(+ )-抗坏血酸后测得的L(+)-抗坏血酸总量。
4方法提要
试样中的抗坏血酸用偏磷酸溶解超声提取后,L(+)-脱氢抗坏血酸经L半胱氨酸溶液进行还原后,以离子对试剂为流动相,经反相色谱柱分离液相色谱紫外检测器(波长245nm)测定L(+)-抗坏血酸总量和D(+)-抗坏血酸。以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T0869-2017
代替SN/T0869—2000
出口饮料中抗坏血酸的测定
Determination of ascorbic acid in beverage for export2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
出口饮料中抗坏血酸的测定
SN/T0869-—2017
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
2018年4月第一版
印张0.75
字数18千字
2018年4月第一次印刷
印数1—500
书号：1550662-32884
定价16.00元
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准代替SN/T0869—2000《进出口饮料中维生素C的测定方法》。本标准与SN/T0869—2000相比，主要变化如下：修改了标准名称；
增加了高效液相色谱法作为本标准的第高一法：原标准的荧光法作为第二法本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。SN/T0869—2017
本标准主要起草人：樊祥、王传现、陈迪、张润何、张弛、张秀芹、倪昕路、韩丽、王敏、邓晓军。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T0869—2000
1范围
出口饮料中抗坏血酸的测定
本标准规定了高效液相色谱法、荧光法测定出口饮料中抗坏血酸的测定方法SN/T0869-—2017
本标准第一法适用于出口饮料中的L（十）-抗坏血酸总量和D（十）-抗坏血酸的测定。第二法适用于出口饮料中L（十）-抗坏血酸总量的测定2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
抗坏血酸
ascorbic acid
种含有6个碳原子的酸性多羟基化合物分L型和D型3.2
L(+)-抗坏血酸L（+）ascorbicacid左式右旋光抗坏血酸。具有强还原性，对人体具有生物活性。3.3
D(+）ascorbicacid
D(+)-抗坏血酸
又称异抗坏血酸。具有强还原性，但对人体基本无生物活性。3.4
L（+）-脱氢抗坏血酸
Dehydro-L(+)ascorbic acid
L（+）-抗坏血酸极易被氧化为L（+）-脱氢抗坏血酸，L（十）-脱氢抗坏血酸亦可被还原为L（十）-抗坏血酸。
L(+）-抗坏血酸总量totalascorbicacid将试样中L（十)-脱氢抗坏血酸还原成L（+）-抗坏血酸后测得的L（+)-抗坏血酸总量。第一法高效液相色谱法
4方法提要
试样中的抗坏血酸用偏磷酸溶解超声提取后，L（十）-脱氢抗坏血酸经L-半胱氨酸溶液进行还原后，以离子对试剂为流动相，经反相色谱柱分离液相色谱紫外检测器（波长245nm）测定L（十）-抗坏血1
SN/T0869—2017
酸总量和D（十）-抗坏血酸。以色谱峰的保留时间定性，外标法定量5试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。偏磷酸（HPO3），：纯度≥38%。5.1
磷酸三钠（NasPO·12HzO)。
5.3磷酸二氢钾。
5.4磷酸：85%。
5.5L-半胱氨酸（C.H,NO2S)：优级纯。5.6十六烷基三甲基溴化铵（C1sHazBrN）：色谱纯。5.7甲醇：色谱纯
5.8偏磷酸溶液（200g/L）：称取200g（精确至0.1g）偏磷酸（5.1)，溶于水并稀释至1L，此溶液保存于4℃的环境下可保存一个月。
5.9偏磷酸溶液（20g/L）：吸取50mL200g/L偏磷酸溶液，用水稀释至500mL。5.10磷酸三钠溶液（100g/L）：称取100g（精确至0.1g）磷酸三钠，溶于水并稀释至1L。5.11L-半胱氨酸溶液（40g/L）：称取20gL-半胱氨酸，溶于水并稀释至500mL，临用时配制。5.12L（+）-抗坏血酸标准品（CAS号：50-81-7）：纯度≥99%。5.13D（+）-抗坏血酸标准品（CAS号：89-65-6）：纯度≥99%。5.14L（+）-抗坏血酸标准储备溶液（1.000mg/mL）：准确称取L（+）-抗坏血酸标准品0.01g（精确至0.01mg），用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL，该储备液在2℃～8℃避光条件下可保存一周。5.15D（+）-抗坏血酸标准储备溶液（1.000mg/mL）：准确称取D（+）-抗坏血酸标准品0.01g（精确至0.01mg），用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL，该储备液在2℃~8℃避光条件下可保存一周。5.16抗坏血酸混合标准系列工作液：分别吸取L（十）-抗坏血酸和D（十）抗坏血酸标准储备液0mL，0.05mL，0.50mL，1.0mL，2.5mL，5.0mL，用20g/L的偏磷酸溶液定容至100mL。标准系列工作液中L（十）-抗坏血酸和D（+）-抗坏血酸的浓度分别为0μg/mL.0.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL25.0μg/mL、50.0μg/mL，避光保存，保存时间为24h。6仪器和设备
高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。6.2pH计：精度为0.01。
6.3天平：感量为0.1g、1mg.0.01mg。6.4
超声波清洗器。
离心机：转速≥4000r/min。
6.6均质机。
6.7滤膜：0.45μm水相膜。
6.8振荡器。
7试样制备与保存
试样制备
固体或半固体样品用组织捣碎机粉碎混匀，液体样品混合均匀，混匀后样品置于密闭容器中，待称2
样处理，样品制备后应尽快完成试验。7.2试样保存
SN/T0869—2017
试验于0℃～4℃密闭保存；在制样的操作过程中及样品保存期间，应避免样品场时间与大量空气接触，防止样品中被测物质受到氧化导致被测物含量发生变化8分析步骤
8.1提取
称取约1g（精确至0.01g）固体试样，或量取5mL士0.05mL液体试样于50mL烧杯中，用偏磷酸溶液（5.9）将试样转移至50mL容量瓶中，振摇溶解并定容。摇勾，全部转移至50mL离心管中，超声提取5min后，于4000/min离心5min，准确吸取20mL上述离心后的上清液于50mL离心管中，加人10mLL-半胱氨酸溶液（5.11），用磷酸三钠溶液（5.10）调节pH至7.0~7.2，振荡5min。再用磷酸调节pH至2.52.8，将试液全部转移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。混勾后过0.45μm水相滤膜后，供HPLC测定。
注：整个检测过程尽可能在避光条件下进行。液相色谱测定
8.2.1色谱参考条件
8.2.1.1色谱柱：C18，250mmX4.6mm（内径）.5μm，或性能相当者。8.2.1.2柱温：室温。
8.2.1.3流动相：A：6.8g磷酸二氢钾和0.91g十六烷基三甲基溴化铵，用水溶解并定容至1L（用磷酸调pH至2.5~2.8）；B：100%甲醇。按A：B-98：2混合，过0.45μm滤膜，超声脱气。8.2.1.4流速：0.7mL/min。
8.2.1.5进样量：20μL。
8.2.1.6检测器：二极管阵列检测器或紫外检测器。8.2.1.7检测波长：245nm。
8.2.2标准曲线制作
分别对抗坏血酸混合标准系列工作溶液（5.16）进行测定，以标准溶液的质量浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。8.2.3定量测定
待测样液中L（十)-抗坏血酸总量[或D（十)-抗坏血酸］的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样检测。L(+）-抗坏血酸总量、D(+)-抗坏血酸标准色谱图参见附录A中图A.1。8.3
空白试验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。9结果计算和表述
试样中L（十）-抗坏血酸总量[或D（+）-抗坏血酸］的含量按式（1）计算获得，计算结果应保留3位3
SN/T0869-2017
有效数字：
式中：
(CI-Ce)XV
XFX100
mx1000
.（1）
试样中L（+）抗坏血酸总量[或D（+）抗坏血酸】的含量，单位为毫克每百克（mg/100g)；样液中L（+）-抗坏血酸总量[或D（+）-抗坏血酸】的测定值，单位为微克每毫升（μg/mL）；样品空白液中L（+)-抗坏血酸总量[或D（十)-抗坏血酸］的测定值，单位为微克每毫升(μg/mL);
-试样的最后定容体积，单位为毫升（mL）；实际检测试样质量，单位为克（g）：由pg/mL换算成mg/ml的换算因子；稀释倍数（2.5）；
由mg/g换算成mg/100g的换算因子。定量限和回收率
定量限
本方法L（+）-抗坏血酸总量和D(十）-抗坏血酸的定量限（LOQ)均为0.4mg/100g。10.2
回收率
回收率见表1。
表1回收率
浓缩果汁
含乳饮料
碳酸饮料
固体饮料
添加浓度/（mg/100g）
L(+)-抗坏血酸总量
回收率范围/%
88.0~98.5
D(+)-抗坏血酸回
收率范围/%
89.1~98.1
11方法提要
第二法荧光法
SN/T0869-2017
试样中L（十）-抗坏血酸经活性炭氧化为L（+）-脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成有荧光的喹唔啉（quinoxaline），其荧光强度与L（十）-抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定试样中L（十）-抗坏血酸总量。
注：L(+)-脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除试样中荧光杂质产生的干扰。12试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。12.1偏磷酸（HPO）：含量（以HPO计）≥38%。12.2冰乙酸（CH，COOH）：浓度约为30%。12.3硫酸（HzSO）：浓度约为98%。12.4乙酸钠（CH,COONa）。
硼酸（HBO,）。
12.6邻苯二胺（CH.Nz）。
12.7百里酚蓝（CzHgO.S）)。
12.8活性炭粉。
12.9偏磷酸-乙酸溶液：称取15g偏磷酸，加40mL冰乙酸及250ml水，加温，搅拌，使之逐渐溶解，冷却后加水至500mL。于4℃冰箱可保存7天～10天，12.10硫酸溶液（0.15mol/L）：取8.3mL硫酸，小心加人水中，再加水稀释至1000mL。12.11偏磷酸-乙酸-硫酸溶液：称取15g偏磷酸，加人40mL冰乙酸，滴加0.15mol/L硫酸溶液至溶解，并稀释至500mL。bzxz.net
12.12乙酸钠溶液（500g/L）：称取500g乙酸钠，加水至1000mL。12.13硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，用500g/L乙酸钠溶液溶解并稀释至100mL。临用时配制。12.14邻苯二胺溶液（200mg/L）：称取20mg邻苯二胺，用水溶解并稀释至100mL，临用时配制。12.15酸性活性炭：称取约200g活性炭粉（75μm~177μm），加人1L盐酸（1+9），加热回流1h~2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110℃～120℃烘箱中干燥10h，备用。12.16检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将20g/L亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。12.17百里酚蓝指示剂溶液（0.4mg/mL）：称取0.1g百里酚蓝，加人0.02mol/L氢氧化钠溶液约10.75mL，在玻璃研钵中研磨至溶解，用水稀释至250mL。（变色范围：pH等于1.2时呈红色：pH等于2.8时呈黄色：pH大于4时呈蓝色）12.18L（+）-抗坏血酸标准品（CHO）：纯度≥99%。12.19L（+）-抗坏血酸标准溶液（1.000mg/mL)：称取L（+）-抗坏血酸0.05g（精确至0.01mg），用偏磷酸-乙酸溶液溶解并稀释至50mL，该贮备液在2℃～8℃避光条件下可保存一周。12.20L（+）-抗坏血酸标准工作液（100.0uμg/mL）：吸取L（+）抗坏血酸标准液10.00mL，用偏磷酸乙酸溶液稀释至100mL，临用时配制。5
SN/T0869—2017
13仪器和设备
荧光分光光度计：具有激发波长338nm及发射波长420nm，配有1cm比色。14分析步骤
14.1提取
称取约100g（精确至0.1g）试样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒人捣碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂测试匀浆的酸碱度。如呈红色，即称取适量匀浆用偏磷酸-乙酸溶液稀释；若呈黄色或蓝色，则称取适量匀浆用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其pH为1.2。匀浆的取用量根据试样中抗坏血酸的含量而定。当试样液中抗坏血酸含量在40μg/mL~100μg/mL之间，一般称取20g（精确至0.01g）勾浆，用相应溶液稀释至100mL，过滤，滤液备用。14.2测定
14.2.1氧化处理：分别准确吸取50mL试样滤液及抗坏血酸标准工作液于200mL具塞锥形瓶中，加人2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即为试样氧化液和标准氧化液，待测定。
14.2.2分别准确吸取10mL试样氧化液于两个100mL容量瓶中，作为“试样液”和“试样空白液”。14.2.3分别准确吸取10mL标准氧化液于两个100mL容量瓶中，作为“标准液”和\标准空白液”。14.2.4于试样空白液”和“标准空白液”中各加5mL硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至100mL，在4℃冰箱中放置2h～3h，取出待测。14.2.5于“试样液”和“标准液”中各加5mL的500g/L乙酸钠溶液，用水稀释至100mL，待测。注：整个检测过程尽可能在避光条件下进行。14.3标准曲线的制备
准确吸取上述\标准液\[L（+）-抗坏血酸含量10μg/mLJ0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL，分别置于10mL具塞刻度试管中，用水补充至2.0mL。另准确吸取“标准空白液”2mL于10mL带盖刻度试管中。在暗室迅速向各管中加人5mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应35min，于激发波长338nm，发射波长420nm处测定荧光强度。以标准液”系列荧光强度分别减去“标准空白液荧光强度的差值为纵坐标，对应的L（十）-抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或计算直线回归方程。14.4试样测定
分别准确吸取2mL“试样液”和“试样空白液”于10mL具塞刻度试管中，在暗室迅速向各管中加人5mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反应35min，于激发波长338nm、发射波长420nm处测定荧光强度。以“试样液”荧光强度减去“试样空白液”的荧光强度的差值于标准曲线上查得或回归方程计算测定试样溶液中L（+)-抗坏血酸总量。15结果计算和表述
试样中L（+）-抗坏血酸总量，结果以毫克每百克表示，按式（2）计算获得，计算结果应保留3位有效数字：
式中：
试样中L（+）-抗坏血酸的总量，单位为毫克每百克（mg/100g）；SN/T0869—2017
由标准曲线查得或回归方程计算的进样液中L（十）-抗坏血酸的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
荧光反应所用试样体积，单位为毫升（mL）：m—实际检测试样质量，单位为克（g）：F试样溶液的稀释倍数。
16定量限
方法L(+)-抗坏血酸总量的定量限（LOQ)为0.7mg/100g。SN/T 0869--2017
附录A
（资料性附录）
L（+)-抗坏血酸总量、D(+)-抗坏血酸标准液相色谱图L（+）-抗坏血酸总量和D抗坏血酸标准液相色谱图（0.5μg/mL)见图A.1。mAU
16.9635-L-抗坏血酸
A7.485-D-抗坏血酸
图A.1L(+）-抗坏血酸总量和D-抗坏血酸标准液相色谱图(0.5μg/mL）10min
书号：1550662-32884
SN/T0869-2017
定价：
2102-680L/NS
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