SN/T 1135.10-2013
基本信息
标准号： SN/T 1135.10-2013
中文名称：马铃薯V病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1135.10-2013.Detection and identification of potato virus V.
1范围
SN/T 1135.10规定了马铃薯V病毒检疫鉴定的基本原则和方法。
SN/T 1135.10适用于所有进出境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质和番茄等茄科作物中可能带有马铃薯V病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1840植物病毒 免疫电镜检测方法
3.原理
3.1 马铃薯V病毒学名与分类地位
学名:Potato virus V
缩写:PVV
分类地位:马铃薯Y病毒科(Poyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyurus)。
3.2检疫鉴定依据
马铃薯V病毒的血清学特性分子生物学特性和病菲粒体形态是检交鉴定的主要依据。
该病毒的相关资料参见附录人
4仪器设备、用具及试剂
4.1 主要仪器设备
酶联检测仪、洗板机、高速冷冻台式离心机、PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪,水平电泳槽，凝胶成像仪、水浴槽、透射电子显微镜、天平(感量:0.001g)等。
4.2主要试剂
主要酶联测定试剂见附录B,反转录聚合酶链式反应(RTPCR)检测试剂见附录C,实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D,生物学测定试剂参见附录E.
5样品制备
将马铃薯块茎种植在隔离温室中,于25℃生长并进行症状观察。待长出3~4片叶后将表现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。对采集的叶片进行酶联免疫吸附测定、RT-PCR检测、实时荧光反转录PCR检测、免疫电镜观察或生物学测定。也可以对马铃薯块茎或其他植物材料直接进行检测。
1范围
SN/T 1135.10规定了马铃薯V病毒检疫鉴定的基本原则和方法。
SN/T 1135.10适用于所有进出境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质和番茄等茄科作物中可能带有马铃薯V病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1840植物病毒 免疫电镜检测方法
3.原理
3.1 马铃薯V病毒学名与分类地位
学名:Potato virus V
缩写:PVV
分类地位:马铃薯Y病毒科(Poyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyurus)。
3.2检疫鉴定依据
马铃薯V病毒的血清学特性分子生物学特性和病菲粒体形态是检交鉴定的主要依据。
该病毒的相关资料参见附录人
4仪器设备、用具及试剂
4.1 主要仪器设备
酶联检测仪、洗板机、高速冷冻台式离心机、PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪,水平电泳槽，凝胶成像仪、水浴槽、透射电子显微镜、天平(感量:0.001g)等。
4.2主要试剂
主要酶联测定试剂见附录B,反转录聚合酶链式反应(RTPCR)检测试剂见附录C,实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D,生物学测定试剂参见附录E.
5样品制备
将马铃薯块茎种植在隔离温室中,于25℃生长并进行症状观察。待长出3~4片叶后将表现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。对采集的叶片进行酶联免疫吸附测定、RT-PCR检测、实时荧光反转录PCR检测、免疫电镜观察或生物学测定。也可以对马铃薯块茎或其他植物材料直接进行检测。
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标准内容
ICS65.020.99
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1135.10—2013
马铃薯V病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of potato virus V2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
SN/T1135共分为10部分：
第1部分，马铃薯癌肿病检疫鉴定方法：第2部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法：第3部分：马铃薯顶病毒检疫鉴定方法；第4部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法；第5部分：马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法；第6部分：马铃薯腐病菌检疫鉴定方法；第7部分：马铃薯A病毒检疫鉴定方法：第8部分：马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法：第9部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法：第10部分：马铃薯V病毒检疫鉴定方法。本部分为SN/T1135的第10部分。本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1135.10—2013
本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李彬、闻伟刚、粟智平、田永蕾、吴翠萍、粟寒、刘洪义、王秀芬、李明福。1范围
马铃薯V病毒检疫鉴定方法
本标准规定了马铃薯V病毒检疫鉴定的基本原则和方法。SN/T1135.10—2013
本标准适用于所有进出境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质和番茄等茄科作物中可能带有马铃薯V病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡[用文件，仅注日期的版本适用于本文注日期的引！
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3原理
马铃薯V病毒学名与分类地位
学名：PotatovirusV
缩写：PVV
分类地位：马铃薯Y病毒科（Po
3.2检疫鉴定依据
）马铃薯Y病毒属（Polyuirus）。物学特性和病毒粒体形态是检疫鉴定的主要依据。马铃薯V病毒的血清学特性
分子生
该病毒的相关资料参见附录A
仪器设备、用具及试剂
4.1主要仪器设备
酶联检测仪、洗板机、高速冷冻台式离心机、PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像仪、水浴槽、透射电子显微镜、天平（感量：0.001g）等。4.2主要用具
研钵和研棒、各种量程的可调移液器（2L，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）、各种吸头(10μL，200μL，1000μL）、96孔酶标板、离心管（0.2mL，0.6mL，1.5mL)等。4.3主要试剂
主要酶联测定试剂见附录B，反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)检测试剂见附录C，实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D,生物学测定试剂参见附录E。1
SN/T1135.10—2013
5样品制备
将马铃薯块茎种植在隔离温室中，于25℃生长并进行症状观察。待长出3～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。对采集的叶片进行酶联免疫吸附测定、RTPCR检测、实时荧光反转录PCR检测、免疫电镜观察或生物学测定。也可以对马铃薯块茎或其他植物材料直接进行检测。
6检测与鉴定
6.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）将制备的样品上清液加人已包被PVV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。设置阳性对照、阴性对照和空白对照，其中以样品提取缓冲液为空白对照，阴性对照（如叶片或块茎等）为健康的植物组织，阳性对照为含有PVV的植物组织。检测中，每个样品和对照均需设置两次重复。具体操作见附录B
6.2RT-PCR检测
分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。设置阳性对照、阴性对照和空白对照，其中以超纯水为空白对照，阴性对照和阳性对照的设置见6.1。具体操作见附录C。实时荧光RT-PCR检测
样品总RNA提取后，采用一步法进行实时荧光RT-PCR扩增，即反转录过程和实时荧光PCR在同一个PCR管中进行。阳性对照、阴性对照和空白对照的设置见6.2。具体操作见附录D。6.4免疫电子显微镜观察
见SN/T1840。
6.5生物学测定
具体操作参见附录E。
结果判定
DAS-ELISA检测结果为阳性，RT-PCR检测结果或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性，可判定待检样品带有马铃薯V病毒。必要时，可采用免疫电子显微镜观察方法或生物学测定方法进行辅助鉴定。
8样品与结果记录保存
8.1样品保存
经鉴定确定携带马铃薯V病毒的检测样品应在合适的条件下保存，病株在一20℃或者超低温冰箱中保存，做好标记和登记工作，以备复核。2
结果记录保存
SN/T1135.10—2013
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳照片，实时荧光反转录PCR检测需有扩增曲线图谱，电镜观察需有病毒粒体照片，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片。3
SN/T1135.10—2013
分布地区
附录A
（资料性附录）
马铃薯V病毒相关资料
PVV目前在欧洲的法国、荷兰、爱尔兰、英国以及南美洲的秘鲁均有分布。A.2
寄主范围
马铃薯√病毒寄主范围较窄.仅限于茄科和一些藜科的植物.在自然界主要侵染马铃薯（Solanumtuberosum)。
病害症状
马铃薯√病毒自然侵染马铃薯后，有些品种表现为无症侵染，嫩叶变小和轻微的叶片扭曲；也有些品种表现为花叶症状，下部叶片出现坏死斑点。人工接种马铃薯，多数品种会产生过敏反应，出现局部坏死斑和严重的系统坏死症状，但这些症状在田间很少发生。该病毒在马铃薯上为系统侵染，病毒能够传到薯块上，使薯块带毒。
传播途径
马铃薯V病毒侵染种薯后可随种薯引进和调运进行远距离传播。
在田间，PVV可以通过介体蚜
马铃薯长管蚜（Macrosiphumeu
虫，如桃蚜（Myeuspersicae）、香圆尾（Brachycaudushelic)arysi
phorbiae）和马铃薯囊管蚜（Rhopaios液接种传播和嫁接传播，在田间扩散A.5
血清学特性
性方式传播。PVV很容易经过汁
phoninus latysa
phon）以
非持久
但未见有种子传播的报道。
马铃薯V病毒具有中等免疫原性，与马铃薯A病毒和些野生的马铃薯花叶病毒在血清学上具有相关性，与马铃薯Y病毒（株系O、N和C)血清学关系较远：但是，PVV抗体在酶联免疫吸附测定中反应良好。
分子生物学特性
病毒基因组为正义单链RNA，全长约10kb；病毒基因组5含有一段非编码区（5°-NTR），3端具有poly(A）结构。
病毒粒体形态
马铃薯V病毒粒体为线条状，长度约为760nm，宽为11nm~15nm。PVV在寄主细胞中可形成风轮状内含体
B.1试材
酶联板的要求
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附法测定使用质量有保证厂商生产的酶联板。包被抗体
特异性的马铃薯V病毒抗体。
酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的马铃薯V病毒抗体。B.1.4底物
对硝基苯磷酸二钠(-NPP-Na
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NazCO.）
碳酸氢钠（NaHCOs）
叠氮化钠（NaN）
SN/T1135.10—2013
调节pH值到9.6，然后加蒸馏水至1L，4℃储存。加人900mL蒸馏水溶解，用HCI
6磷酸盐缓冲液（PBSTpHZ
氯化钠（NaCI)）
磷酸氢二钠（NazHPO，·12H,O)磷酸二氢钾（KH,PO)
氯化钾（KCI)
吐温（Tween-20）
加人900mL蒸馏水溶解，调节pH值到7.4，加蒸馏水定容至1L。B.1.7
样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸钠（Na SO.）
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW24000~40000）叠氮化钠（NaN）
4℃储存。
SN/T1135.10—2013
酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）
牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉PVP(MW24000~40000)
叠氮化钠（NaNg）
4℃储存。
底物（p-NPP-Na2）缓冲液（pH9.8）氯化镁（MgClz）
叠氮化钠（NaN.）
二乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用HCI调pH值至9.8，蒸馏水定容至1L4℃储存。B.2
操作流程
包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加酶联板的孔中，100μL/孔，加盖，室温孵育4h或4℃冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4~6次，1min/次。2样品制备
待测样品按1：10（重量体积）加人抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000r/min，离心10min，上清即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B.2.3加样
加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，100μL/孔，加盖，室温孵育2h或4℃冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4～6次，1min/次。B.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加人到酶联板中，100uL/孔，加盖，室温孵育2h，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4~6次，1min/次。B.2.5
加底物
将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），按100μL/孔，加人到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.6读数
在不同的时间内如30min，1h或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值，或用肉眼观察显色情况。
注：也可以按试剂盒说明进行操作。B.3
结果判断
SN/T-1135.10—2013
对照孔的OD4os值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：B.3.1
缓冲液孔和阴性对照孔的OD4os值小于0.15，当阴性对照孔的OD4as值小于0.05时，按0.05计算；阳性对照OD40s值/阴性对照OD405值大于5～10；同一样品的重复性基本一致B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：样品ODA0s5值/阴性对照OD405值<2，判为阴性。样品OD40s值/阴性对照OD4os值2，判为阳性样品OD45值/阴性对照OD4o5值在阈值附近，判为可疑样品，任选6.2和6.3之一的方法加以验证。B.3.3若满足不了B.3.1质量控制要求，则不能进行结果判断7
SN/T1135.10—2013
C.1主要试剂
C.1.1RNA提取的主要试剂
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
TRIzol裂解液、三氯甲烷（氯仿）、异内醇、75%的乙醇。50XTAE
冰醋酸
Na.EDTA·2HO
加去离子水至1L，使用时加水稀释至1×TAIC.1.36×加样缓冲液
溴酚蓝
燕糖水溶液
实验步骤bZxz.net
总RNA提取
40%（质量浓度）
称取0.5g样品加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人灭菌的1.5mL离心管中，加人1mL的TrizoL
试剂，剧烈振荡摇匀3min4℃12000g离心10min，取上清液：加人氯仿，200μL，上下颠倒混匀，室异丙醇，颠倒混匀：4℃，12000g离温静止3min，4℃，12000g离心10min，取上层水相；加等体积的心10min，弃上清液；加1mL75%的乙醇洗涤沉淀，4℃，500
离心5min，弃乙醇：沉淀于室温下充分干燥后，溶于经焦碳酸二乙酯（DEPC)处理过的30μLddHO，一20℃保存备用。注：也可以采用试剂盒提取总RNA。C.2.2RT-PCR反应
引物序列
根据已报道的PVV基因组序列，设计一对扩增部分外壳蛋白基因的寡核苷酸引物。正向引物PVV-434F：5-CTAACGCAAGGGCAACTCAG-3”反向引物PVV-434R：5*-CAGTGCTGCTGCCTTCATCT-3*RT-PCR产物大小434bp。
CDNA合成
SN/T1135.10—2013
反转录总体系为20μL。在PCR管中依次加人总RNA、PVV-434R引物（20Pmol/μL)0.5μLdNTP(10mmol/L)1μL，补水至10μL，65℃温浴5min，冰上急冷，瞬离，再向PCR管中加入下列试剂：反转录酶（200U/μL)1μL、5×反转录缓冲液4μL、RNasin(40U/μL)0.5μL、ddHzO4.5μL。在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃60min，70℃15min，一20℃冰箱保存备用。注：也可以采用试剂盒进行合成eDNA。PCR扩增
PCR反应体系见表C.1，反应参数：94℃5min94℃30s58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
R反应体系
试剂名称
10XPCR缓冲液（无镁离子
氧化镁（20mmol/L
dNTP(10mmol/L
PVV-434F(20μmol/L)
PVV-434R(20μmol/L)
TaqDNA聚合酶（5U）
CDNA模板
C.2.3琼脂糖电泳
C.2.3.1制备凝胶
加样量（μL）
将TAE和电泳级琼脂糖按1.2%（质量浓度）配好，在微波炉中熔化混勾，冷却至55℃左右。加人溴化乙锭（EB）浓度为0.5μg/mL，混匀，倒人已封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加入足够量的TAE（缓冲液没过凝胶表面约1mm）。C.2.3.2加样
取1μL6×加样缓冲液与5μL样品混合，加人到凝胶样品孔中，并设置合适的DNA标准分子量物质。
C.2.3.3电泳
接通电源使DNA向阳极移动。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统上观察、拍照并保留结果。
SN/T1135.10—2013
结果判断
阳性对照在434bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，如果样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定RT-PCR检测结果为阴性；如果样品出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定RT-PCR检测结果为阳性。
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1135.10—2013
马铃薯V病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of potato virus V2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
SN/T1135共分为10部分：
第1部分，马铃薯癌肿病检疫鉴定方法：第2部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法：第3部分：马铃薯顶病毒检疫鉴定方法；第4部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法；第5部分：马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法；第6部分：马铃薯腐病菌检疫鉴定方法；第7部分：马铃薯A病毒检疫鉴定方法：第8部分：马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法：第9部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法：第10部分：马铃薯V病毒检疫鉴定方法。本部分为SN/T1135的第10部分。本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1135.10—2013
本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李彬、闻伟刚、粟智平、田永蕾、吴翠萍、粟寒、刘洪义、王秀芬、李明福。1范围
马铃薯V病毒检疫鉴定方法
本标准规定了马铃薯V病毒检疫鉴定的基本原则和方法。SN/T1135.10—2013
本标准适用于所有进出境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质和番茄等茄科作物中可能带有马铃薯V病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡[用文件，仅注日期的版本适用于本文注日期的引！
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3原理
马铃薯V病毒学名与分类地位
学名：PotatovirusV
缩写：PVV
分类地位：马铃薯Y病毒科（Po
3.2检疫鉴定依据
）马铃薯Y病毒属（Polyuirus）。物学特性和病毒粒体形态是检疫鉴定的主要依据。马铃薯V病毒的血清学特性
分子生
该病毒的相关资料参见附录A
仪器设备、用具及试剂
4.1主要仪器设备
酶联检测仪、洗板机、高速冷冻台式离心机、PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像仪、水浴槽、透射电子显微镜、天平（感量：0.001g）等。4.2主要用具
研钵和研棒、各种量程的可调移液器（2L，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）、各种吸头(10μL，200μL，1000μL）、96孔酶标板、离心管（0.2mL，0.6mL，1.5mL)等。4.3主要试剂
主要酶联测定试剂见附录B，反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)检测试剂见附录C，实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D,生物学测定试剂参见附录E。1
SN/T1135.10—2013
5样品制备
将马铃薯块茎种植在隔离温室中，于25℃生长并进行症状观察。待长出3～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。对采集的叶片进行酶联免疫吸附测定、RTPCR检测、实时荧光反转录PCR检测、免疫电镜观察或生物学测定。也可以对马铃薯块茎或其他植物材料直接进行检测。
6检测与鉴定
6.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）将制备的样品上清液加人已包被PVV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。设置阳性对照、阴性对照和空白对照，其中以样品提取缓冲液为空白对照，阴性对照（如叶片或块茎等）为健康的植物组织，阳性对照为含有PVV的植物组织。检测中，每个样品和对照均需设置两次重复。具体操作见附录B
6.2RT-PCR检测
分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。设置阳性对照、阴性对照和空白对照，其中以超纯水为空白对照，阴性对照和阳性对照的设置见6.1。具体操作见附录C。实时荧光RT-PCR检测
样品总RNA提取后，采用一步法进行实时荧光RT-PCR扩增，即反转录过程和实时荧光PCR在同一个PCR管中进行。阳性对照、阴性对照和空白对照的设置见6.2。具体操作见附录D。6.4免疫电子显微镜观察
见SN/T1840。
6.5生物学测定
具体操作参见附录E。
结果判定
DAS-ELISA检测结果为阳性，RT-PCR检测结果或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性，可判定待检样品带有马铃薯V病毒。必要时，可采用免疫电子显微镜观察方法或生物学测定方法进行辅助鉴定。
8样品与结果记录保存
8.1样品保存
经鉴定确定携带马铃薯V病毒的检测样品应在合适的条件下保存，病株在一20℃或者超低温冰箱中保存，做好标记和登记工作，以备复核。2
结果记录保存
SN/T1135.10—2013
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳照片，实时荧光反转录PCR检测需有扩增曲线图谱，电镜观察需有病毒粒体照片，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片。3
SN/T1135.10—2013
分布地区
附录A
（资料性附录）
马铃薯V病毒相关资料
PVV目前在欧洲的法国、荷兰、爱尔兰、英国以及南美洲的秘鲁均有分布。A.2
寄主范围
马铃薯√病毒寄主范围较窄.仅限于茄科和一些藜科的植物.在自然界主要侵染马铃薯（Solanumtuberosum)。
病害症状
马铃薯√病毒自然侵染马铃薯后，有些品种表现为无症侵染，嫩叶变小和轻微的叶片扭曲；也有些品种表现为花叶症状，下部叶片出现坏死斑点。人工接种马铃薯，多数品种会产生过敏反应，出现局部坏死斑和严重的系统坏死症状，但这些症状在田间很少发生。该病毒在马铃薯上为系统侵染，病毒能够传到薯块上，使薯块带毒。
传播途径
马铃薯V病毒侵染种薯后可随种薯引进和调运进行远距离传播。
在田间，PVV可以通过介体蚜
马铃薯长管蚜（Macrosiphumeu
虫，如桃蚜（Myeuspersicae）、香圆尾（Brachycaudushelic)arysi
phorbiae）和马铃薯囊管蚜（Rhopaios液接种传播和嫁接传播，在田间扩散A.5
血清学特性
性方式传播。PVV很容易经过汁
phoninus latysa
phon）以
非持久
但未见有种子传播的报道。
马铃薯V病毒具有中等免疫原性，与马铃薯A病毒和些野生的马铃薯花叶病毒在血清学上具有相关性，与马铃薯Y病毒（株系O、N和C)血清学关系较远：但是，PVV抗体在酶联免疫吸附测定中反应良好。
分子生物学特性
病毒基因组为正义单链RNA，全长约10kb；病毒基因组5含有一段非编码区（5°-NTR），3端具有poly(A）结构。
病毒粒体形态
马铃薯V病毒粒体为线条状，长度约为760nm，宽为11nm~15nm。PVV在寄主细胞中可形成风轮状内含体
B.1试材
酶联板的要求
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附法测定使用质量有保证厂商生产的酶联板。包被抗体
特异性的马铃薯V病毒抗体。
酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的马铃薯V病毒抗体。B.1.4底物
对硝基苯磷酸二钠(-NPP-Na
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NazCO.）
碳酸氢钠（NaHCOs）
叠氮化钠（NaN）
SN/T1135.10—2013
调节pH值到9.6，然后加蒸馏水至1L，4℃储存。加人900mL蒸馏水溶解，用HCI
6磷酸盐缓冲液（PBSTpHZ
氯化钠（NaCI)）
磷酸氢二钠（NazHPO，·12H,O)磷酸二氢钾（KH,PO)
氯化钾（KCI)
吐温（Tween-20）
加人900mL蒸馏水溶解，调节pH值到7.4，加蒸馏水定容至1L。B.1.7
样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸钠（Na SO.）
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW24000~40000）叠氮化钠（NaN）
4℃储存。
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酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）
牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉PVP(MW24000~40000)
叠氮化钠（NaNg）
4℃储存。
底物（p-NPP-Na2）缓冲液（pH9.8）氯化镁（MgClz）
叠氮化钠（NaN.）
二乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用HCI调pH值至9.8，蒸馏水定容至1L4℃储存。B.2
操作流程
包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加酶联板的孔中，100μL/孔，加盖，室温孵育4h或4℃冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4~6次，1min/次。2样品制备
待测样品按1：10（重量体积）加人抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000r/min，离心10min，上清即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B.2.3加样
加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，100μL/孔，加盖，室温孵育2h或4℃冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4～6次，1min/次。B.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加人到酶联板中，100uL/孔，加盖，室温孵育2h，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4~6次，1min/次。B.2.5
加底物
将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），按100μL/孔，加人到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.6读数
在不同的时间内如30min，1h或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值，或用肉眼观察显色情况。
注：也可以按试剂盒说明进行操作。B.3
结果判断
SN/T-1135.10—2013
对照孔的OD4os值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：B.3.1
缓冲液孔和阴性对照孔的OD4os值小于0.15，当阴性对照孔的OD4as值小于0.05时，按0.05计算；阳性对照OD40s值/阴性对照OD405值大于5～10；同一样品的重复性基本一致B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：样品ODA0s5值/阴性对照OD405值<2，判为阴性。样品OD40s值/阴性对照OD4os值2，判为阳性样品OD45值/阴性对照OD4o5值在阈值附近，判为可疑样品，任选6.2和6.3之一的方法加以验证。B.3.3若满足不了B.3.1质量控制要求，则不能进行结果判断7
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C.1主要试剂
C.1.1RNA提取的主要试剂
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
TRIzol裂解液、三氯甲烷（氯仿）、异内醇、75%的乙醇。50XTAE
冰醋酸
Na.EDTA·2HO
加去离子水至1L，使用时加水稀释至1×TAIC.1.36×加样缓冲液
溴酚蓝
燕糖水溶液
实验步骤bZxz.net
总RNA提取
40%（质量浓度）
称取0.5g样品加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人灭菌的1.5mL离心管中，加人1mL的TrizoL
试剂，剧烈振荡摇匀3min4℃12000g离心10min，取上清液：加人氯仿，200μL，上下颠倒混匀，室异丙醇，颠倒混匀：4℃，12000g离温静止3min，4℃，12000g离心10min，取上层水相；加等体积的心10min，弃上清液；加1mL75%的乙醇洗涤沉淀，4℃，500
离心5min，弃乙醇：沉淀于室温下充分干燥后，溶于经焦碳酸二乙酯（DEPC)处理过的30μLddHO，一20℃保存备用。注：也可以采用试剂盒提取总RNA。C.2.2RT-PCR反应
引物序列
根据已报道的PVV基因组序列，设计一对扩增部分外壳蛋白基因的寡核苷酸引物。正向引物PVV-434F：5-CTAACGCAAGGGCAACTCAG-3”反向引物PVV-434R：5*-CAGTGCTGCTGCCTTCATCT-3*RT-PCR产物大小434bp。
CDNA合成
SN/T1135.10—2013
反转录总体系为20μL。在PCR管中依次加人总RNA、PVV-434R引物（20Pmol/μL)0.5μLdNTP(10mmol/L)1μL，补水至10μL，65℃温浴5min，冰上急冷，瞬离，再向PCR管中加入下列试剂：反转录酶（200U/μL)1μL、5×反转录缓冲液4μL、RNasin(40U/μL)0.5μL、ddHzO4.5μL。在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃60min，70℃15min，一20℃冰箱保存备用。注：也可以采用试剂盒进行合成eDNA。PCR扩增
PCR反应体系见表C.1，反应参数：94℃5min94℃30s58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
R反应体系
试剂名称
10XPCR缓冲液（无镁离子
氧化镁（20mmol/L
dNTP(10mmol/L
PVV-434F(20μmol/L)
PVV-434R(20μmol/L)
TaqDNA聚合酶（5U）
CDNA模板
C.2.3琼脂糖电泳
C.2.3.1制备凝胶
加样量（μL）
将TAE和电泳级琼脂糖按1.2%（质量浓度）配好，在微波炉中熔化混勾，冷却至55℃左右。加人溴化乙锭（EB）浓度为0.5μg/mL，混匀，倒人已封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加入足够量的TAE（缓冲液没过凝胶表面约1mm）。C.2.3.2加样
取1μL6×加样缓冲液与5μL样品混合，加人到凝胶样品孔中，并设置合适的DNA标准分子量物质。
C.2.3.3电泳
接通电源使DNA向阳极移动。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统上观察、拍照并保留结果。
SN/T1135.10—2013
结果判断
阳性对照在434bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，如果样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定RT-PCR检测结果为阴性；如果样品出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定RT-PCR检测结果为阳性。
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