SN/T 1129-2015.Quarantine protocol for bovine viral diarrhea/ mucosal disease.
1范围
SN/T 1129规定了牛病毒性腹泻/黏膜病的临床诊断、病毒分离鉴定、荧光抗体试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验、微量血清中和试验、抗原捕获酶联免疫吸附试验、反转录聚合酶链反应操作规程。
SN/T 1129适用于进出口动物及其产品中牛病毒性腹泻/黏膜病的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产品检测 实验室技术要求
3符号和缩略语
BVD:牛病毒性腹泻/黏膜病
BVDV:牛病毒性腹泻/黏膜病病毒
PBS:磷酸缓冲盐溶液
MEM:最低基础培养基
MDBK:牛肾传代细胞
DEPC:焦碳酸乙二酯
4临床诊断
4.1临床症状
BVD潜伏期为7 d~14 d。急性病牛主要表现为突然发病,体温升高,重度腹泻,白细胞减少,大量流涎,口腔黏膜糜烂和溃疡,可在发病后几天死亡。慢性病例临床症状不明显或逐渐发病,生长发育受阻，消瘦,体重逐渐下降,比较特殊的症状是鼻镜上的糜烂,糜烂可在鼻镜上连成一片,表现为间歇性腹泻,病程较长,可在发病数周或数月后死亡。
4.2病理变化
消化道黏膜充血、出血、水肿和糜烂。特征性病变是食道黏膜糜烂,呈大小和形态不-的直线排列。瘤胃黏膜出血、糜烂,第四胃炎性水肿、糜烂。小肠呈急性卡他性炎症,肠壁水肿增厚,大肠呈卡他性、出血性、溃疡性以至坏死性炎症。在流产胎儿的口腔、食道、真胃及气管内可见出血斑和溃疡。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1129—2015
代替SN/T1129-2007，SN/T1905—2007牛病毒性腹泻/黏膜病检疫技术规范Quarantine protocol for bovine viral diarrhea/mucosal disease2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-04-01实施
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
牛病毒性腹泻/黏膜病检疫技术规范SN/T1129—2015免费标准下载网bzxz
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
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中国标准出版社泰皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张1字数26千字2016年3月第一版2016年3月第一次印刷印数1-1100
书号：155066：2-29873
定价18.00元
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1129—2015
本标准代替SN/T1129—2007《牛病毒性腹泻/粘膜病检疫规范》和SN/T1905—2007《牛病毒性腹/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程》。本标准与所代替标准的主要技术差异如下：整合了SN/T1129—2007和SN/T1905—2007内容；按OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2008版）修改了试验方法。本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（ManualofDiagnostic Tests and Vaccines forTerrestrial Animals)(2008版)中2.4.8。本标准与OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2.4.8相比，主要技术异同如下：本标准采用了OIE规定的病毒分离与鉴定、荧光抗体试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验、微量血清中和试验及酶联免疫吸附试验方法；本标准增加了OIE中提及但没有详细操作规程的反转录聚合酶链式反应具体试验方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国四川出入境检验检疫局。本标准主要起草人：白泉阳、孙颖杰、王伟利、王武军、孟庆峰、张体银、石建平、孟日增、张伯强、刘金华。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T1129.1--2002
-SN/T1129.2—2002；
SN/T1129—2007;
-SN/T1905—2007。
1范围
牛病毒性腹泻/黏膜病检疫技术规范SN/T1129—2015
本标准规定了牛病毒性腹泻/黏膜病的临床诊断、病毒分离鉴定、荧光抗体试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验、微量血清中和试验、抗原捕获酶联免疫吸附试验、反转录-聚合酶链反应操作规程。本标准适用于进出口动物及其产品中牛病毒性腹泻/黏膜病的检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3符号和缩略语
BVD:牛病毒性腹泻/黏膜病
BVDV:牛病毒性腹泻/黏膜病病毒PBS：磷酸缓冲盐溶液
MEM：最低基础培养基
MDBK：牛肾传代细胞
DEPC：焦碳酸乙二酯
TCIDso：半数组织培养感染量
RNA：核糖核酸
Tag酶：TagDNA聚合酶
RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应4临床诊断
临床症状
BVD潜伏期为7d～14d。急性病牛主要表现为突然发病，体温升高，重度腹泻，白细胞减少，大量流涎，口腔黏膜糜烂和溃疡，可在发病后几天死亡。慢性病例临床症状不明显或逐渐发病，生长发育受阻，消瘦，体重逐渐下降，比较特殊的症状是鼻镜上的糜烂，糜烂可在鼻镜上连成一片，表现为间歇性腹泻，病程较长，可在发病数周或数月后死亡。4.2病理变化
消化道黏膜充血、出血、水肿和糜烂。特征性病变是食道黏膜糜烂，呈大小和形态不一的直线排列。瘤胃黏膜出血、糜烂，第四胃炎性水肿、糜烂。小肠呈急性卡他性炎症，肠壁水肿增厚，大肠呈卡他性、出1
SN/T1129-—2015
血性、溃疡性以至坏死性炎症。在流产胎儿的口腔、食道、真胃及气管内可见出血斑和溃疡。5病毒分离与鉴定
5.1主要仪器设备
倒置显微镜。
恒温培养箱。
单道可调移液器。
5.2试剂和材料
本标准所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682要求。5.2.1
12.5cm细胞培养瓶。
无BVDV抗体胎牛血清。
培养液：MEM营养液、生长液、维持液，配制方法见附录A中A.1A.3。5.2.5
PBS：磷酸盐缓冲液（0.01mol/L、pH7.2,PBS)，配制方法见A.4。5.2.6
细胞分散液：0.25%胰蛋白酶，配制方法见A.5。无BVDV感染的新生特牛原代肾细胞或原代睾丸细胞，按常规胰酶消化方法制备。5.3
样品的采集
5.3.1对于牛群、种公牛的检疫，无菌采血液或精液。2对怀疑为急性感染期或持续感染的牛，采取血液或鼻腔分泌物。5.3.2
3对流产、死胎，采取胎儿组织。5.3.3
5.3.4对怀疑死于黏膜病的牛，可采集血块和各组织，尤其是肠道集合淋巴组织。如果肠道样品已经发生自溶，可采集扁桃体或淋巴结。5.4样品的处理
5.4.1血液按常规方法分离血清。2精液冻融3次后，PBS作1：10稀释，3000r/min离心10min，取上清液。5.4.2
3动物组织加10倍体积含有青霉素1000IU/mL，链霉素1000ug/mL的PBS研磨，3000r/min5.4.3
离心10min，取上清液。
5.5样品的接种培养
5.5.1取生长良好，形成80%以上单层的原代细胞培养瓶，弃去生长液，用PBS洗涤1次，接种处理好的样品，每瓶接种1mL，每个样品接种3个细胞瓶，同时以PBS作为阴性对照，置37℃吸附1h。5.5.2弃去培养瓶内液体，加人维持液，置37℃培养，逐日观察CPE，待50%以上细胞出现CPE时收获培养物，如不出现CPE，第6天收获培养物。5.5.3将收获的培养物冻融3次，同一样品3瓶混合即为样品病毒分离培养物，冷冻保存，用于病毒鉴定。
5.6病毒鉴定
病毒鉴定选择本标准中提供的竞争法荧光抗体试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）、抗原捕获酶联免疫吸附试验（ELISA)或反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行鉴定。2
6竞争法荧光抗体试验
6.1主要仪器设备
倒置荧光显微镜。
二氧化碳培养箱。
单道可调移液器、多道可调移液器。6.2
试剂和材料
96孔平底细胞培养板，带盖湿盒。6.2.2
病毒：BVDV标准毒株（OregonC24V）。6.2.3
标准BVDV阳性血清：置一20℃保存，工作浓度按说明书稀释6.2.41
BVDV荧光抗体：置4℃保存，工作浓度按说明书稀释。6.2.5
无水乙醇，一20℃预冷。
其他试剂和材料见5.2.3~5.2.7。6.3操作程序
SN/T1129—2015
将生长良好的牛肾原代细胞，用细胞分散液处理后，以生长液配制成1.5×105个/mL的细胞悬6.3.1
液，加入96孔细胞培养板内，每孔100μL，置37℃培养。6.3.2待细胞生长成80%的单层，吸出孔内生长液，用100pLMEM营养液洗涤1次，接种样品病毒分离培养物，每孔50μL，每个样品接种4个孔。同时设阳性（标准毒株）、阴性（空白细胞）对照各2孔，置37℃二氧化碳培养箱吸附1h。
6.3.3吸出各板孔内所加的样品病毒培养物以及阳性、阴性对照液体，加入维持液，每孔100μL，置37℃二氧化碳培养箱培养3d。
6.3.4吸出各板孔内的维持液，用PBS洗1次，加一20℃预冷无水乙醇100μL，固定20min以上，弃去无水乙醇，自然于燥备用。
6.3.5取固定、自然干燥的96孔培养板，每个待检样品选择2个孔（样品组半数）分别加入BVDV阳性血清各50μL，剩余2个待检样品孔以及阳性、阴性对照孔内加入PBS50μL，放入带盖湿盒，置37℃作用1h。
6.3.6弃去板孔内液体，用PBS洗涤3次，每次1min3min，倾去液体，在所有板孔内加入工作浓度的BVDV荧光抗体50μL，放人带盖湿盒，37℃作用1h。6.3.7用PBS洗涤3次，每次1min~3min，倾去液体，荧光显微镜检查。6.4结果判定
6.4.1在荧光显微镜下阳性对照孔的细胞呈黄绿色荧光，见黄绿色荧光的细小颗粒散布于细胞浆内，阴性对照孔细胞无荧光。如果阳性对照、阴性对照不成立，则试验无效，重新检测。6.4.2未经阳性血清抑制的样品孔细胞呈较亮荧光，形态清晰，而经过阳性血清抑制的同一样品无荧光，则判为阳性。
6.4.3未经阳性血清抑制的样品孔细胞呈微弱荧光，而经过阳性血清抑制的同一样品孔细胞无荧光：则为可疑，应重新检测，仍然呈微弱荧光，则判为阳性，重检后无荧光则判为阴性3
SN/T1129-2015
免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）7.1
主要仪器设备
倒置显微镜。
单道可调移液器、多道可调移液器。7.2试剂和材料
BVDV酶标抗体：置4℃保存，工作浓度按说明书稀释。显色底物溶液：二氨基联苯胺盐酸盐（DAB)显色底物溶液，配制方法见A.6。7.3操作程序
7.3.1取6.3.5经过BVDV阳性血清或PBS作用的96孔培养板，弃去板孔内液体，用含有1%吐温-80的PBS（PBST）洗涤3次，每次1min～3min，弃去板孔内液体，在所有板孔内加人工作浓度的BVDV酶标抗体50μL，放人带盖湿盒，37℃作用1h。7.3.2弃去板孔内液体，用PBST洗涤3次，每次1min3min，轻轻拍干。7.3.3每孔加入显色底物溶液100μL，封板于室温（20℃～25℃）作用30min。弃去板孔内液体，用PBS洗涤1次，用三级水洗涤2次，拍干液体，在显微镜下判读。7.4结果判定
7.4.1在显微镜下阳性对照孔的细胞（可能仅见于部分细胞）出现弥漫状或团块状棕红色，阴性对照孔的细胞无棕红色。如果阳性对照、阴性对照不成立，则试验无效，重新检测。7.4.2未经阳性血清抑制的细胞出现棕红色，而经过阳性血清抑制的同一样品无棕红色，则判为阳性。8微量血清中和试验
主要仪器设备
倒置显微镜。
二氧化碳培养箱。
单道可调移液器、多道可调移液器。8.2试剂和材料
12.5cm2细胞培养瓶，96孔平底细胞培养板培养液：MEM营养液、生长液、维持液的配制见A.1～A.3。细胞：MDBK或新生特牛肾细胞、睾丸细胞。BVDV标准毒株（OregonC24V)。
无BVDV抗体胎牛血清。
细胞分散液：0.25%胰蛋白酶，配制见A，5。标准BVDV阳性血清、阴性血清，使用前经56℃30min灭活处理。被检血清：无菌静脉采血，分离血清，经56℃30min灭活处理后备用。8.3种毒的制备
将BVDV标准毒株用MEM营养液作10倍稀释，取生长良好单层细胞的培养瓶，用MEM营养液4
SN/T1129—2015
洗一次后，按培养液1：10的量接种病毒，置37℃作用1h，加人维持液，37℃培养至80%细胞出现病变，收获病毒冻融3次，3000r/min离心10min，取上清液即为标准病毒悬液，分装小瓶，置一70℃保存备用。
8.4病毒的毒力测定
将制备的标准病毒悬液，用维持液将其作10倍递增稀释至10-8，每个滴度加人细胞培养板4个孔，每孔50aL。将生长良好单层的细胞用细胞分散液消化后，用生长液配制成3×10°/mL的细胞悬液加到细胞板各孔内，每孔100uL。同时每板设4孔细胞对照。置37℃二氧化碳培养箱中培养，逐日观察至6d，记录细胞病变，按Reed-muench或Karber方法计算细胞半数感染量（TCIDso/5oμL）。8.5操作程序
8.5.1阴性血清对照：每孔加阴性血清50μl、100TCIDsa/50μL的病毒悬液50uL，设4孔。阳性血清对照：每孔加阳性血清50μL、100TCIDse/50μL的病毒悬液50pL，设4孔。8.5.2
8.5.3被检样品：在定量试验中，先将被检血清用PBS作1：2、1：4连续倍比稀释至2-后加入96孔板中，每一稀释度4孔，每孔50μL，每孔再加100TCIDse/50μL的病毒悬液50μL。在定性试验中，被检血清按1：5稀释，其他步骤与定量试验相同。8.5.4被检样品毒性对照：每孔加被检血清原样50μL、维持液50μL，设4孔。8.5.5细胞对照：每孔加100μL维持液，设4孔。8.5.6病毒回归对照：将标准病毒液用PBS稀释成100TCIDsa/50μL、10TCIDs/50μL、1TCIDs/50μL、0.1TCIDsc/50μL的悬液，每个稀释度4孔，每孔加病毒悬液50μL，维持液50μL。8.5.7将处理好对照和被检样品培养板，置37℃二氧化碳培养箱中作用1h，每孔加入用生长液配制成3×10/mL的细胞悬液100μL，置37℃二氧化碳培养箱中培养5d。8.6结果判定
在37℃二氧化碳培养箱中培养72h后连续观察3d判定结果。当病毒回归100TCIDss/50μL和10TCIDs/50μL对照完全出现CPE，1TCIDs/50pL对照半数出现CPE，0.1TCIDs/50μL对照不出现CPE；阴性血清对照出现典型CPE；阳性血清对照无CPE；被检血清对细胞无毒性：细胞对照正常时证明试验成立，可以进行结果判定。8.7判定标准
8.7.1在定量试验中，按Reed-muench或Karber方法计算半数保护量（PDso），即为该血清的中和效价。
8.7.2在定性试验中，被检血清在1：5稀释度有2个或2个以上孔的细胞完全被保护，该血清即为阳性。
8.7.3在双份血清测定中，当间隔21d的第二份来源于同一动物的血清中和效价高于第一份血清中和效价两个或两个以上滴度，则证明该动物正在发病过程中。9抗原捕获酶联免疫吸附试验（ELISA）9.1试验试剂
9.1.1牛病毒性腹泻/黏膜病病毒多克隆抗体包被板。9.1.2抗BVDV单克隆检测抗体。
SN/T1129—2015
BVDV阳性对照血清、BVDV阴性对照血清。9.1.4辣根过氧化物酶（HRP)标记的牛抗鼠抗体。510×样品稀释液、10×浓缩洗液。9.1.5
9.1.6TMB底物溶液、终止液。
注：上述试剂各组分为IDEXX公司生产的牛病毒性腹泻/黏膜病抗原检测试剂盒，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效商品试剂盒具有相同的效果，则可使用这些商品试剂盒，试剂盒在2℃~8℃保存，试剂各组分使用前恢复至室温（20℃~25℃）。9.2
仪器与设备
酶标仪。
高速台式离心机。
涡旋振荡器。
冰箱、温箱。
9.2.5单道可调移液器、多道可调移液器。9.3样品的准备
组织样品
使用尽可能新鲜的组织样品，组织可在2℃～8℃保存1个月或长期冷冻保存，样品一般采取扁桃体、脾脏、小肠及肺脏，用剪刀将1g~2g样品剪碎（2mm~5mm），将剪碎的样品置于10mL离心管中，加入5mL样品稀释液（1×）混匀，置室温1h2h，1500r/min离心10min，上清液为检测样品备用。
9.3.2外周血液白细胞
将肝素或EDTA抗凝血样10mL，2000r/min离心15min~20min，分离白细胞。如果样品量较少，取全血加入等体积2℃8℃预冷的0.17mol/L的NH,Cl溶液，置室温10min，2500r/min离心5min，弃上清液，沉淀即为白细胞。将白细胞重悬于等体积的样品稀释液（1×）中，置室温1h，期间涡漩振荡数次，2500r/min离心5min，上清液为检测样品备用。9.3.3鼻拭子
将拭子放人底部有小孔的微型离心管中，并将微型离心管放人另一个1.5mL离心管中，2500/min离心5min。弃去底部有小孔的微型管，并在1.5mL离心管中加人与获得样品等体积的样品稀释液（1×），混匀，置室温1h，期间振荡数次。2500r/min离心5min，上清液为检测样品备用。9.3.4细胞培养物
将细胞培养物加人等体积的样品稀释液（1×），振荡混，置于室温1h，2500r/min离心5min，上清液为检测样品备用。
9.4·操作程序
加50μL阴性对照血清至酶标板A1、B1孔；加50μL阳性对照血清至A2、B2孔。9.4.1
9.4.2在酶标板被检样品孔内分别加入50μL抗BVDV单克隆检测抗体。9.4.3在酶标板的相应孔内分别加入50μL已稀释好的被检样品。9.4.4将酶标板封板后振荡混合，置2℃～8℃下作用过夜（14h～18h）或37℃下作用3h。9.4.5弃去板孔内液体，每孔加人300μL已稀释好的洗涤液，轻轻震动后弃去洗涤液，重复洗涤5次。6
最后一次洗涤后，在吸水纸上轻拍，除去酶标板内的剩余液体。SN/T11292015
9.4.6每孔加人100μL辣根过氧化物酶（HRP)标记的牛抗鼠抗体，将酶标板封板后，置室温（20℃～25℃）下作用30min。重复9.4.5洗涤。9.4.7每孔加入100μLTMB底物溶液，将酶标板置室温下避光作用10min，从加完第一孔开始计时。9.4.8每孔加100μL终止液，终止颜色反应。9.4.9测定吸光值（OD），酶标仪以空气作为空白对照，于15min内，在450nm波长下测量和记录样品和对照孔的OD值。
9.5有效性检测
在阳性对照孔所得OD值的平均值减去阴性对照孔所得OD值的平均值大于0.15，且阴性对照孔所得OD值的平均值小于0.2时，测定结果有效。5结果计算
按式(1)～式(3)进行计算：
式中：
式中：
式中，
ODAI+ODI
阴性对照血清孔OD值的平均值；A1孔阴性对照血清的OD值；
B1孔阴性对照血清的OD值。
ODA2+ODg2
阳性对照血清孔OD值的平均值；A2孔阳性对照血清的OD值；
B2孔阳性对照血清的OD值。
样品孔的OD值。
9.7结果判定
OD,-NCX
PCX-NCX
（2）
如果S/P值<0.20，样品判为牛病毒性腹泻/黏膜病阴性；如果S/P值介于0.20和0.30之间，样品判为牛病毒性腹泻/黏膜病可疑，应重新检测，如果S/P值≥0.30，样品判为牛病毒性腹泻/黏膜病阳性。
反转录聚合酶链反应（RT-PCR）10.1
主要仪器设备
PCR扩增仪
低温高速离心机。
.可调微量移液器。
组织匀浆器。
SN/T1129—2015
电泳仪、电泳槽。
凝胶成像分析系统。
10.2试剂
DEPC水：配制方法见A.7。
裂解液Trizol：4℃保存。
三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇：一20℃预冷。10X×RT-PCR缓冲液、MgClz（25mmol/L）、dNTP（每种浓度均为10mmol/L）。AMV反转录酶（5U/uL）、RNA酶抑制剂（40U/μL）、TaqDNA聚合酶（5U/μL）：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化10.2.6
50XTris-冰乙酸（TAE）电泳缓冲液，配制方法见A.8。DNA相对分子质量标准物MarkerDL2ooo。10.2.810mg/mL溴化乙锭溶液，配制方法见A.9。10.2.9
1%琼脂糖凝胶，配制方法见A.10。10.2.10上样缓冲液（6×），配制方法见A.11引物：根据BVDV国际标准株基因序列，在其最保守的5端非编码区序列设计合成一对特异10.2.11
性引物，上游引物5-AGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3'，下游引物5'-TCTGCAGCACCCTATCAGG-3，配制成20μmol/L，-20℃保存。10.2.12阳性对照、阴性对照样品：由指定单位提供或阳性对照样品按8.3方法制备，阴性对照样品取生长良好的MDCK细胞，冻融2次～3次，5000r/min离心10min，取上清液备用。10.3试验方法
10.3.1折
检测环境要求
检测过程中防止交叉污染措施按照GB/T19495.2中的规定执行10.3.2
样品的处理
10.3.2.1组织样品：取2g~5g切成小块，加5mL~15mL预冷的PBS匀浆2min制成悬液，4℃5000r/min离心10min，取上清液备用。10.3.2.2液体样品：包括血清、血液、客种拭子悬液（鼻腔、眼或肛拭子）、精液等振荡混匀备用。10.3.3样本RNA的提取
10.3.3.1取1.5mL灭菌离心管，以待检样品数量分别进行编号标记，并设立阳性对照、阴性对照各1管。每管加人600μL裂解液，分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200uL，一份样品换用一个吸头。加人200μL三氯甲烷，振荡混匀20s，室温静置10min。于4℃条件下12000r/min离心15min。
10.3.3.2取与10.3.3.1中相同数量的1.5mL灭菌离心管，加人500μL异丙醇（一20℃预冷），对每个管进行编号。吸取10.3.3.1离心后各管中的上清液转移至相应的管中，将上清液尽量吸取500L，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。10.3.3.3于4℃条件下，12000r/min离心15min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入600μL75%乙醇，颠倒洗涤。10.3.3.4于4℃条件下，12000r/min离心10min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。8
SN/T1129—2015
10.3.3.54000r/min离心10s（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥约3min，不宜过于干燥，以免RNA不溶。10.3.3.6加人20uLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或保存于70℃冰箱。10.3.3.7RT-PCR扩增：反应体系25μL，在0.2mLPCR反应管中进行，反应管编号并设立阳性、阴性对照，按表1进行反应液配制。
表1反应液配方
10×RT-PCR缓冲液
MgCl,(25mmol/L)
dNTP（各10mmol/L)
RNasin(40 U/μL)
AMV反转录酶（5U/μL）
TaqDNA聚合酶（5U/μL)
上游引物（20μmol/L）
下游引物（20μmol/L）
DEPCddHo
用量/μL
10.3.3.8扩增程序及反应条件：将加样后的PCR管瞬间离心后放入PCR扩增仪内，记录样本顺序。反应参数设置：42℃30min92℃3min：92℃15s58℃30s72℃1min，40循环；72℃10min最后4℃保温。
PCR产物的电泳检测
用TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板（含溴化乙锭终浓度0.5μg/mL）。将平板放人水平电泳槽中，加人1×TAE电泳缓冲液高出凝胶表面，将PCR扩增产物10μL与2μL上样缓冲液混合，分别加人样品孔内，同时设定DNA分子量标准物对照。5V/cm恒压电泳30min～45min。10.4结果判定
阴性样品无条带，阳性样品有一条带，大小约为244bp，在阴性和阳性对照成立情况下，如被检样品无条带，则结果为阴性。如被检样品有条带，大小与阳性样品相同为244bp，即可判定为阳性。必要时取PCR扩增产物进行测序，将测序结果与附录B中参考序列比较，序列相似性在95%以上，可进步确认待测样品为阳性。如果出现与设计长度不同的条带，为非特异性反应，应重复试验，两次试验都为非特异性反应时，可判为阴性。a
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