SN/T 1486-2016
基本信息
标准号： SN/T 1486-2016
中文名称：输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：6099353
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1486-2016.Detection of yellow fever virus in imported mosquitoes.
1范围
SN/T 1486规定了国境口岸输人性蚊类携带黄热病毒的检测对象、生物安全措施、仪器和设备、主要试剂、检验程序阳性结果处置和废弃物的处理。
SN/T 1486适用于输人性蚊类体内携带黄热病毒的实验室检验。口崖发现的蚊类携带黄热病毒检测可参考本标准执行。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通用要求
WS233微生物和生物医学 实验室生物安全通用准则
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1输入性蚊类imported mosquitoes
通过入境交通工具、集装箱、货物、行李及邮包等携带人境的蚊类
3.2黄热病毒yellow fever vires
属于黄病毒科(Flaviviridae黄病毒属(Flavivirus)单股正链RNA病毒,与同属的登革热病毒等有交叉免疫反应。病毒颗粒为直径37 nm~50 nm的球形外有脂蛋白包膜,包膜表面有刺突。基因组大小约为11 kb,只含有一个长的开放阅读框架。
3.3逆转录聚合酶链式反应reverse transcription polymerase chain reaction( RT-PCR)
将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。本标准采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。在RT-PCR中，首先以RNA为模板,利用下游特异性引物，在依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)的作用下转录合成互补DNA(eDNA),该步称作“逆转录";随后，再以cDNA 为模板，利用上游和下游特异性引物,在DNA聚合酶的作用下进行PCR循环扩增;最终使RNA分子的某个特定区域(目的片段)被扩增达几百万倍。
1范围
SN/T 1486规定了国境口岸输人性蚊类携带黄热病毒的检测对象、生物安全措施、仪器和设备、主要试剂、检验程序阳性结果处置和废弃物的处理。
SN/T 1486适用于输人性蚊类体内携带黄热病毒的实验室检验。口崖发现的蚊类携带黄热病毒检测可参考本标准执行。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通用要求
WS233微生物和生物医学 实验室生物安全通用准则
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1输入性蚊类imported mosquitoes
通过入境交通工具、集装箱、货物、行李及邮包等携带人境的蚊类
3.2黄热病毒yellow fever vires
属于黄病毒科(Flaviviridae黄病毒属(Flavivirus)单股正链RNA病毒,与同属的登革热病毒等有交叉免疫反应。病毒颗粒为直径37 nm~50 nm的球形外有脂蛋白包膜,包膜表面有刺突。基因组大小约为11 kb,只含有一个长的开放阅读框架。
3.3逆转录聚合酶链式反应reverse transcription polymerase chain reaction( RT-PCR)
将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。本标准采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。在RT-PCR中，首先以RNA为模板,利用下游特异性引物，在依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)的作用下转录合成互补DNA(eDNA),该步称作“逆转录";随后，再以cDNA 为模板，利用上游和下游特异性引物,在DNA聚合酶的作用下进行PCR循环扩增;最终使RNA分子的某个特定区域(目的片段)被扩增达几百万倍。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1486—2016
代替SN/T1486—2004
输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法Detection of yellow fever virus in imported mosquitoes2016-03-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-10-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1486—2004《输人性蚊类携带的黄热病毒检测方法》。本标准与SN/T1486—2004相比主要技术变化如下：修改了“1标准的范围”；
修改和增加了“2规范性引用文件”；增加了术语和定义“RT-PCR反应”、“荧光RT-PCR反应”；增加了“4缩略语”，
SN/T1486—2016
修改和增加了“5实验室生物安全要求”；将“5实验室生物安全要求”调整为“6生物安全措施”，并修改了表述内容；
修改了结构和表述：划分了层次，分为“主要仪器和设备”、“主要试剂”“检验程序”；将“6.1.1器材”调整为“7仪器和设备”，并修改了表述方式和内容；将“6.1.2常用试剂”调整为“8主要试剂”，并修改了表述方式和内容；修改了内容和方法：将“6.2操作方法”调整为“9检验程序”，并修改了表述；增加9.3“荧光RT-PCR检测方法”；删除“病毒分离与酶联免疫吸附试验检测方法”；修改并增加了结果判定的细节：修改了“RT-PCR方法结果的判定”的表述；增加了“荧光RTPCR方法结果的判定”；
增加了废弃物处理；
删除了附录A。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张升，周冬根、吴薇、郑剑宁，杨天赐，崔科军，胡群。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1486—2004。
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输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法SN/T1486—2016
本标准规定了国境口岸输人性蚊类携带黄热病毒的检测对象、生物安全措施、仪器和设备、主要试剂、检验程序、阳性结果处置和废弃物的处理。本标准适用于输人性蚊类体内携参考本标准执行。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所GB19489实验室生物安全
通用要求
岸发现的蚊类携带黄热病毒检测可日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文的修改单）适用于本文件。
微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
输入性蚊类importedmosquitoes通过人境交通工具、集装箱
黄热病毒yellowfevervir
行李及邮包等携带人境的蚊类
属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flaui有交叉免疫反应。病毒颗粒为直径nm50
大小约为11kb，只含有一个长的开放阅读3.3
rus)单股正链RNA病毒，与同属的登革热病毒等的球形
外有脂蛋白包膜，包膜表面有刺突。基因组逆转录聚合酶链式反应
reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR)相结合的技术。本标准采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。在RT-PCR中，首先以RNA为模板，利用下游特异性引物，在依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成互补DNA（cDNA），该步称作“逆转录”：随后，再以cDNA为模板，利用上游和下游特异性引物，在DNA聚合酶的作用下进行PCR循环扩增；最终使RNA分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。3.4
荧光RT-PCR反应fluorescenceRT-PCR实时荧光RT-PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法，其原理是在常规RT-PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个率灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，利用Taq酶的5'→1
SN/T1486—2016
3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bpbasepair：碱基对。
FAM6-carboxy-fluorescein：6-羧基-荧光素，一种荧光报告基团。BHQlBlackHoleQuencher-l：一种荧光淬灭基团。5检测对象
主要检测的输人性对象包括：伊蚊属埃及伊蚊（Aedesaegypti）和非洲伊蚊（Aedesafricanus），及可能携带黄热病毒的外来输人性蚊种等。6
生物安全措施
6.1检测工作中的个人防护参照GB19489。6.2实验室应符合GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2）实验室的生物安全要求使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。6.3
仪器和设备
本方法使用的主要仪器如下：
超净工作台；
Ⅱ级生物安全柜；
全自动核酸提取仪；
实时荧光定量PCR仪；
PCR热循环仪；
恒温孵育仪；
普通台式离心机；
高速冷冻离心机（离心力可达20000×g）；电泳仪；
凝胶成像分析系统；
体视显微镜；
高压灭菌锅；
冰箱：4℃、-20℃和-70℃；
可调式微量加样器（10μL、100μL、1000μL)及配套带滤芯吸头。8主要试剂
本方法使用的主要试剂如下：
-RT-PCR通用试剂：QIAGENOneStepRT-PCRKit试剂盒\，荧光RT-PCR通用试剂：QuantiTectProbeRT-PCRKit试剂盒；病毒RNA提取试剂：QIAampViralRNAkit试剂盒\；10XTBE电泳缓冲液；
无RNA酶的DEPC水；
GoldenView核酸染料：使用浓度为5μL/100mL；SN/T1486—2016
引物和探针：针对黄热病毒核苷酸高度保守区进行设计，引物和探针序列见表1。表1黄热病毒RT-PCR/荧光RT-PCR检测的引物和探针引物/探针名称
YFV-FP1
YFV-RP1
YFV-FP2
YFV-RP2
YFV-probe
9检验程序
CAATAAATGCTGTTGC
TTCTCCATCTCCTGAA
序列（5'→+3'）
TACAACATGATGGGAAAGCGAGAGAAAAAGTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC
FAM-TCAGAGACCTGGCTGCAATGGATGGT-BHQ19.1样品收集与处理
9.1.1样品收集
靶标基因
扩增片
段大小
通过勺法、光诱捕法以及人工摘除法等方法，重点检测人境交通工具、集装箱、货物、行李及邮包等是否携带有黄热病重要传播媒介蚊幼、成蚊、卵粒，然后将采集好的标本放人专门的采样包中，尽可能快地送至有检验资质的实验室中。9.1.2样品处理
首先通过体视显微镜完成有关截获的标本分类鉴定，按30只～50只一份，装人2mL螺口塑料血清管内，旋紧管盖，分类编号；如果蚊虫数量不足30只，则可将采自同一地点的蚊虫或卵粒等作为一份。整个操作过程尽可能让标本处于低温状态，然后将标本置于一70℃以下超低温冰箱保存待检。9.1.3病毒核酸提取方法
将一70℃冰箱中保存好的蚊虫标本，按不同的分类编号倒人研磨器或1.5mLEppendorf离心管中，加人适量的液氮，用塑料研磨棒反复研磨至组织碎片基本消失，或用组织细胞破碎仪进行处理。然后加人600μLβ-巯基乙醇裂解缓冲液进行充分反应，根据QIAampViralRNAkit病毒RNA提取试剂盒进行或其他等效方法提取核酸，实际操作时按试剂盒说明书进行。提取好的RNA核酸液置于一70℃冰箱中保存，以备RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测所需。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3
SN/T1486—2016
9.1.4阳性对照、阴性对照和空白对照设置检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为根据黄热病毒核苷酸序列通过基因合成、载体构建和体外转录合成的RNA，阴性对照可选择其他种类病毒的核酸样本，空白对照用无菌水作为RT-PCR和荧光RT-PCR反应的模板。9.2RT-PCR检测方法
9.2.1反应液的准备
RT-PCR反应体系采用以下参数：5XonestepRT-PCRBuffer8μL；引物YFV-FP1（40μmol/L）和YFV-RPl(40μmol/L)各o.5μL，RNaseimhibitor0.5μL.dNTP混合物2μL：one-stepRT-PCR
EnzymeMix（含逆转录酶和TagDNA聚合酶）1.0μL，RNA模板5.0μL；加水补足至40μL。
9.2.2反应条件
RT-PCR反应条件：50℃反转录30min：95℃预变性15min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环72℃延伸10min：4℃保温。日因不同PCR仪器的性能差异，可根据条件优化适当调整PCR退火温度和时间
9.2.3琼脂糖凝胶电泳
用0.5XTBE电泳缓冲液配制2.0%
（质量分数）的琼脂糖凝胶（含GoldenView或其他等效核酸染料）。将琼脂糖凝胶放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚没胶面。取9μLRT-PCR扩增产物和1μL在电泳时设立DNA分子量标准作对照，使用100bpDNA分上样缓冲液混勾后加人糖凝胶的样品孔。子量标准。按8V/cm的电压条件电泳约30mim~40min。采用
凝胶成像系统观察核酸条带并判断结果。
9.3荧光RT-PCR检测方法
9.3.1反应液的准备
荧光RT-PCR反应体系采用以下参数：2×QuantiTectProbeMg+等）12.5μL：引物YFV-FP2（12.5μmol/Probe(20μmol/L)0.25μL;QuantiTectRT5.0μL，加水补足至25μL。
9.3.2反应条件
和YFV-RP2
Mx（含逆转
RT-PCRMasterMix（含dNTP和
2.5μmol/L）各0.5μL；探针YFV-酶和TaqDNA聚合酶）O.5μLRNA模板荧光RT-PCR反应条件：50℃反转录30min：95℃预变性15min；94℃变性15s，60℃退火延伸60s40个循环，在60℃收集荧光。因不同PCR仪器的性能差异，可根据条件优化适当调整PCR退火温度和时间。
9.4检测结果判定
9.4.1RT-PCR方法结果的判定
当阳性对照出现目的片段条带，而阴性对照和空白对照没有任何核酸条带出现时才可对样本进行结果判定及报告，否则视为实验失败，需重新实验。本方法检验结果判定及报告如下：4
检测样品出现349bp条带时，报告“检出黄热病毒（RT-PCR法）”。检测样品未出现349bp条带时，报告未检出黄热病毒（RT-PCR法）”。9.4.2荧光RT-PCR方法结果的判定SN/T1486—2016
在荧光RT-PCR实验中，若阳性对照有明显的荧光增幅现象，且Ct值在预期的范围之内（32）；阴性对照和空白对照无荧光增幅现象，则表明反应体系运行正常，可以进行结果判定，否则，实验视为无效，需重新实验。
当同时进行的阳性、阴性和空白对照实验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下：检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值35时，判为阳性，报告检出黄热病毒（荧光RTPCR法）”。
检测样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时.应重新送行荧光RT-PCR检测。若重新检测的Ct值仍介于35和
40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告检出黄热
病毒（荧光RT-PCR法）”：否则判为阴未检出黄热病毒（荧光RT-PCR法）”。检测样品无荧光增幅现象，判为阴性，报告““未检出黄热病毒（荧光RT-PCR法）”。10阳性结果处置
采用RT-PCR法或荧光RT-PCR法进行检测，出现阳性结果的相应机标本应送有资质的实验室做复
检或鉴定。确定阳性结果后应立即向送检或送样单位报告废弃物的处理
检验过程中的废弃物，收集后进行高压蒸汽灭菌处理或采用0.5%
的次氯酸钠溶液浸泡30min以
上等其他等效的处理方法。
SN/T1486—2016
参考文献
[1］方美玉等.虫媒传染病.北京：科学出版社，2005：158-165.[2] Chao,D.Y.et al.Development of multiplex real-time reverse transcriptase PCR assays for detecting eight medically important flaviviruses in mosquitoes.J.Clin Microbiol,2007.584-589.6
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代替SN/T1486—2004
输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法Detection of yellow fever virus in imported mosquitoes2016-03-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-10-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1486—2004《输人性蚊类携带的黄热病毒检测方法》。本标准与SN/T1486—2004相比主要技术变化如下：修改了“1标准的范围”；
修改和增加了“2规范性引用文件”；增加了术语和定义“RT-PCR反应”、“荧光RT-PCR反应”；增加了“4缩略语”，
SN/T1486—2016
修改和增加了“5实验室生物安全要求”；将“5实验室生物安全要求”调整为“6生物安全措施”，并修改了表述内容；
修改了结构和表述：划分了层次，分为“主要仪器和设备”、“主要试剂”“检验程序”；将“6.1.1器材”调整为“7仪器和设备”，并修改了表述方式和内容；将“6.1.2常用试剂”调整为“8主要试剂”，并修改了表述方式和内容；修改了内容和方法：将“6.2操作方法”调整为“9检验程序”，并修改了表述；增加9.3“荧光RT-PCR检测方法”；删除“病毒分离与酶联免疫吸附试验检测方法”；修改并增加了结果判定的细节：修改了“RT-PCR方法结果的判定”的表述；增加了“荧光RTPCR方法结果的判定”；
增加了废弃物处理；
删除了附录A。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张升，周冬根、吴薇、郑剑宁，杨天赐，崔科军，胡群。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1486—2004。
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输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法SN/T1486—2016
本标准规定了国境口岸输人性蚊类携带黄热病毒的检测对象、生物安全措施、仪器和设备、主要试剂、检验程序、阳性结果处置和废弃物的处理。本标准适用于输人性蚊类体内携参考本标准执行。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所GB19489实验室生物安全
通用要求
岸发现的蚊类携带黄热病毒检测可日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文的修改单）适用于本文件。
微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
输入性蚊类importedmosquitoes通过人境交通工具、集装箱
黄热病毒yellowfevervir
行李及邮包等携带人境的蚊类
属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flaui有交叉免疫反应。病毒颗粒为直径nm50
大小约为11kb，只含有一个长的开放阅读3.3
rus)单股正链RNA病毒，与同属的登革热病毒等的球形
外有脂蛋白包膜，包膜表面有刺突。基因组逆转录聚合酶链式反应
reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR)相结合的技术。本标准采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。在RT-PCR中，首先以RNA为模板，利用下游特异性引物，在依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成互补DNA（cDNA），该步称作“逆转录”：随后，再以cDNA为模板，利用上游和下游特异性引物，在DNA聚合酶的作用下进行PCR循环扩增；最终使RNA分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。3.4
荧光RT-PCR反应fluorescenceRT-PCR实时荧光RT-PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法，其原理是在常规RT-PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个率灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，利用Taq酶的5'→1
SN/T1486—2016
3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bpbasepair：碱基对。
FAM6-carboxy-fluorescein：6-羧基-荧光素，一种荧光报告基团。BHQlBlackHoleQuencher-l：一种荧光淬灭基团。5检测对象
主要检测的输人性对象包括：伊蚊属埃及伊蚊（Aedesaegypti）和非洲伊蚊（Aedesafricanus），及可能携带黄热病毒的外来输人性蚊种等。6
生物安全措施
6.1检测工作中的个人防护参照GB19489。6.2实验室应符合GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2）实验室的生物安全要求使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。6.3
仪器和设备
本方法使用的主要仪器如下：
超净工作台；
Ⅱ级生物安全柜；
全自动核酸提取仪；
实时荧光定量PCR仪；
PCR热循环仪；
恒温孵育仪；
普通台式离心机；
高速冷冻离心机（离心力可达20000×g）；电泳仪；
凝胶成像分析系统；
体视显微镜；
高压灭菌锅；
冰箱：4℃、-20℃和-70℃；
可调式微量加样器（10μL、100μL、1000μL)及配套带滤芯吸头。8主要试剂
本方法使用的主要试剂如下：
-RT-PCR通用试剂：QIAGENOneStepRT-PCRKit试剂盒\，荧光RT-PCR通用试剂：QuantiTectProbeRT-PCRKit试剂盒；病毒RNA提取试剂：QIAampViralRNAkit试剂盒\；10XTBE电泳缓冲液；
无RNA酶的DEPC水；
GoldenView核酸染料：使用浓度为5μL/100mL；SN/T1486—2016
引物和探针：针对黄热病毒核苷酸高度保守区进行设计，引物和探针序列见表1。表1黄热病毒RT-PCR/荧光RT-PCR检测的引物和探针引物/探针名称
YFV-FP1
YFV-RP1
YFV-FP2
YFV-RP2
YFV-probe
9检验程序
CAATAAATGCTGTTGC
TTCTCCATCTCCTGAA
序列（5'→+3'）
TACAACATGATGGGAAAGCGAGAGAAAAAGTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC
FAM-TCAGAGACCTGGCTGCAATGGATGGT-BHQ19.1样品收集与处理
9.1.1样品收集
靶标基因
扩增片
段大小
通过勺法、光诱捕法以及人工摘除法等方法，重点检测人境交通工具、集装箱、货物、行李及邮包等是否携带有黄热病重要传播媒介蚊幼、成蚊、卵粒，然后将采集好的标本放人专门的采样包中，尽可能快地送至有检验资质的实验室中。9.1.2样品处理
首先通过体视显微镜完成有关截获的标本分类鉴定，按30只～50只一份，装人2mL螺口塑料血清管内，旋紧管盖，分类编号；如果蚊虫数量不足30只，则可将采自同一地点的蚊虫或卵粒等作为一份。整个操作过程尽可能让标本处于低温状态，然后将标本置于一70℃以下超低温冰箱保存待检。9.1.3病毒核酸提取方法
将一70℃冰箱中保存好的蚊虫标本，按不同的分类编号倒人研磨器或1.5mLEppendorf离心管中，加人适量的液氮，用塑料研磨棒反复研磨至组织碎片基本消失，或用组织细胞破碎仪进行处理。然后加人600μLβ-巯基乙醇裂解缓冲液进行充分反应，根据QIAampViralRNAkit病毒RNA提取试剂盒进行或其他等效方法提取核酸，实际操作时按试剂盒说明书进行。提取好的RNA核酸液置于一70℃冰箱中保存，以备RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测所需。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3
SN/T1486—2016
9.1.4阳性对照、阴性对照和空白对照设置检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为根据黄热病毒核苷酸序列通过基因合成、载体构建和体外转录合成的RNA，阴性对照可选择其他种类病毒的核酸样本，空白对照用无菌水作为RT-PCR和荧光RT-PCR反应的模板。9.2RT-PCR检测方法
9.2.1反应液的准备
RT-PCR反应体系采用以下参数：5XonestepRT-PCRBuffer8μL；引物YFV-FP1（40μmol/L）和YFV-RPl(40μmol/L)各o.5μL，RNaseimhibitor0.5μL.dNTP混合物2μL：one-stepRT-PCR
EnzymeMix（含逆转录酶和TagDNA聚合酶）1.0μL，RNA模板5.0μL；加水补足至40μL。
9.2.2反应条件
RT-PCR反应条件：50℃反转录30min：95℃预变性15min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环72℃延伸10min：4℃保温。日因不同PCR仪器的性能差异，可根据条件优化适当调整PCR退火温度和时间
9.2.3琼脂糖凝胶电泳
用0.5XTBE电泳缓冲液配制2.0%
（质量分数）的琼脂糖凝胶（含GoldenView或其他等效核酸染料）。将琼脂糖凝胶放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚没胶面。取9μLRT-PCR扩增产物和1μL在电泳时设立DNA分子量标准作对照，使用100bpDNA分上样缓冲液混勾后加人糖凝胶的样品孔。子量标准。按8V/cm的电压条件电泳约30mim~40min。采用
凝胶成像系统观察核酸条带并判断结果。
9.3荧光RT-PCR检测方法
9.3.1反应液的准备
荧光RT-PCR反应体系采用以下参数：2×QuantiTectProbeMg+等）12.5μL：引物YFV-FP2（12.5μmol/Probe(20μmol/L)0.25μL;QuantiTectRT5.0μL，加水补足至25μL。
9.3.2反应条件
和YFV-RP2
Mx（含逆转
RT-PCRMasterMix（含dNTP和
2.5μmol/L）各0.5μL；探针YFV-酶和TaqDNA聚合酶）O.5μLRNA模板荧光RT-PCR反应条件：50℃反转录30min：95℃预变性15min；94℃变性15s，60℃退火延伸60s40个循环，在60℃收集荧光。因不同PCR仪器的性能差异，可根据条件优化适当调整PCR退火温度和时间。
9.4检测结果判定
9.4.1RT-PCR方法结果的判定
当阳性对照出现目的片段条带，而阴性对照和空白对照没有任何核酸条带出现时才可对样本进行结果判定及报告，否则视为实验失败，需重新实验。本方法检验结果判定及报告如下：4
检测样品出现349bp条带时，报告“检出黄热病毒（RT-PCR法）”。检测样品未出现349bp条带时，报告未检出黄热病毒（RT-PCR法）”。9.4.2荧光RT-PCR方法结果的判定SN/T1486—2016
在荧光RT-PCR实验中，若阳性对照有明显的荧光增幅现象，且Ct值在预期的范围之内（32）；阴性对照和空白对照无荧光增幅现象，则表明反应体系运行正常，可以进行结果判定，否则，实验视为无效，需重新实验。
当同时进行的阳性、阴性和空白对照实验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下：检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值35时，判为阳性，报告检出黄热病毒（荧光RTPCR法）”。
检测样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时.应重新送行荧光RT-PCR检测。若重新检测的Ct值仍介于35和
40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告检出黄热
病毒（荧光RT-PCR法）”：否则判为阴未检出黄热病毒（荧光RT-PCR法）”。检测样品无荧光增幅现象，判为阴性，报告““未检出黄热病毒（荧光RT-PCR法）”。10阳性结果处置
采用RT-PCR法或荧光RT-PCR法进行检测，出现阳性结果的相应机标本应送有资质的实验室做复
检或鉴定。确定阳性结果后应立即向送检或送样单位报告废弃物的处理
检验过程中的废弃物，收集后进行高压蒸汽灭菌处理或采用0.5%
的次氯酸钠溶液浸泡30min以
上等其他等效的处理方法。
SN/T1486—2016
参考文献
[1］方美玉等.虫媒传染病.北京：科学出版社，2005：158-165.[2] Chao,D.Y.et al.Development of multiplex real-time reverse transcriptase PCR assays for detecting eight medically important flaviviruses in mosquitoes.J.Clin Microbiol,2007.584-589.6
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