SN/T 1673-2013.Quarantine protocol for infectious hypodermal and haematopoietic necrosis.
1范围
SN/T 1673规定了进出口对虾中传染性皮下和造血器官坏死的现场检疫和聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光PCR方法、原位杂交方法和斑点杂交方法实验室检验方法。
SN/T 1673适用于进出口对虾中传染性皮下和造血器官坏死的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
IHHN:传染性皮下和造血器官坏死
IHHNV:传染性皮下和造血器官坏死病毒
PCR:聚合酶链式反应
Real-Time PCR :实时荧光PCR
4概述
传染性皮下和造血器官坏死(IHHN)是由传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)引起的，IHHN的流行病学、病原特性等参见附录A。
5实验室诊断
5.1 仪器和设备
5.1.1 PCR扩增仪。
5.1.2紫外观察灯或凝胶成像仪。
5.1.3 荧光定量PCR仪。
5.1.4高速冷冻离心机。
5.1.5玻璃研磨棒或塑料研磨棒。
5.2临床症状
患有急性IHHN的细角滨对虾(Litapenaeus stslirostris)摄食明显减少,外观及行为表现异常,患病对虾在养殖池中缓缓上升到水面，静止后翻转继而又缓慢沉到水底,腹部向上，出现这种行为的对虾在几小时内不断重复这个过程,直到体力不支或被其他健康对虾攻击和吞食。感染期的细角滨对虾表皮，上皮,特别是腹部背板接合处经常出现白色或浅黄色的斑点(该斑点的形状及出现部位与对虾白斑综合征的特征性白斑不同),使对虾看上去体色斑驳。继而这种斑点会逐渐消褪。同时，感染了IHHNV的细角滨对虾和斑节对虾(Penaeusmonodon)在濒死时体色常偏蓝，腹部肌肉不透明。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1673—2013
代替SN/T1673—2005
传染性皮下和造血器官坏死
检疫技术规范
Quarantine protocol for infectious hypodermal and haematopoietic necrosis2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。SN/T1673—2013
本标准代替SN/T1673一2005《对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒聚合酶链反应操作规程》。本标准与SN/T1673—2005相比.除编辑性修改外主要技术性变化如下：增加了临床诊断；
增加了实时荧光PCR方法；
增加了斑点杂交方法；
增加了原位杂交方法；
增加了综合评定。
本标准主要参考OIE标准《水生动物疾病诊断手册》（2009年版）第2.2.2章中介绍的方法，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国海南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张娜、何俊强、黄纪徽、卓金焕、郑枢、史秀杰、庄广儒、曾建红。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1673—2005
1范围
传染性皮下和造血器官坏死
检疫技术规范
SN/T1673—2013
本标准规定了进出口对虾中传染性皮下和造血器官坏死的现场检疫和聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光PCR方法、原位杂交方法和斑点杂交方法实验室检验方法。本标准适用于进出口对虾中传染性皮下和造血器官坏死的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
IHHN：传染性皮下和造血器官坏死IHHNV：传染性皮下和造血器官坏死病毒PCR：聚合酶链式反应
Real-TimePCR：实时荧光PCR
RDS：慢性矮小残缺综合症
4概述
传染性皮下和造血器官坏死（IHHN)是由传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）引起的，IHHN的流行病学、病原特性等参见附录A。5实验室诊断
仪器和设备
5.1.1PCR扩增仪。
紫外观察灯或凝胶成像仪。
荧光定量PCR仪。
高速冷冻离心机。
5.1.5玻璃研磨棒或塑料研磨棒。水浴锅：室温至100℃。
塑料封口机：可满足5cm以上杂交袋热塑封口，溶液溢出到电阻丝或外壳上时不会发出漏电。1
SN/T1673—2013
暗盒：可用任何能避免强光直射的盒子或袋子代替。硝酸纤维素膜。
杂交袋。
电炉或其他加热设备：可满足200mL~2000mL水在口容器中沸腾10min。程控组织脱水机或常规手工脱水。程控组织包埋机或常规手工包埋。展片水浴锅：室温~50℃。
切片烘干机：室温～100℃。
切片染色缸。
切片保湿孵育箱。
试剂和材料
所用水若非注明，应符合GB/T6682中一级水的规格若非注明，本标准使用试剂为分析纯。聚合酶链式反应（PCR）扩增反应引物PCR扩增引物：
389F.5*-CGG-AAC-ACA-ACC-CGA-CTT-TA-3389R：5*-GGC-CAA-GAC-CAA-AAT-ACG-AA-3389bp的基因片段（参见附录B）浓度为40μmol/L，扩增长度为
b）PCR扩增引物：
77012F.5'-ATC-GGT-GCA-CTA-CTC-GGA-3\77353R:5*-TCG-TAC-TGG-CTG-TTCATC-3
浓度为40μmol/L，扩增长度为356bp自的基因片
c）PCR扩增引物：
392F:5\-GGG-CGA-ACC-AGAATC-ACT-TA-32392R.5'-ATC-CGG-AGG-AAT-CTGATG-TG-3浓度为40μmol/L，扩增长度为392d）PCR扩增引物：
pp的基因片段
TCA-AAA-CCA
309F:5*-TCC-AAC-ACT-TAG
TGA-TTA-TCC-A-3\
309R:5-TGT-CTG-CTA-CGA
浓度为40μmol/L，扩增长度为309bp的基因片段。e）PCR扩增引物：
MG831F.5'-TTG-GGG-ATG-CAG-CAA-TAT-CT-3MG831R:5\-GTC-CAT-CCA-CTG-ATC-GGA-CT-3浓度为40μmol/L扩增长度为831bp的基因片段。5.2.4实时荧光PCR扩增引物和Taqman探针a）实时荧光PCR引物：
上游引物（IHHNV1608F)5*-TACTCC-GGA-CAC-CCA-ACC-A-3下游引物（IHHNV1688R)5'-GGC-TCT-GGC-AGC-AAA-GGT-AA-3引物浓度为7.5umol/L
b）Taqman探针：探针浓度为7.5μmol/L5\FAm-ACC-AGA-CAT-AGA-GCT-ACA-ATC-CTC-GCC-TAT-TTG-TAMRA 3\探针浓度为7.5μmol/L
5.2.5对照设立
SN/T1673—2013
阳性对照：取含有已知IHHNV的对虾组织作为阳性对照，或由国家质量监督检验检疫总局a）
指定单位提供。
阴性对照：取已知未含IHHNV的对虾组织抽提核酸作为阴性对照。b)
空白对照：取等体积的水代替模板作为空百对照。5.2.6
抽提液I饱和过的重蒸酚：三氯甲烷：异皮醇按25：241的比例混合。5.2.7抽提液Ⅱ：三氯甲烷和异戊醇按24：1的比例混合。5.2.8
dNTP.含dATP，dTTP.dGTP，dCTP客iommol/L：6X上样缓冲液。9Taq酶：5U/μL；MgCl2：25.0mmol/L；一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。5.2.9
EB（核酸染色剂）。
DNA标准分子量。
5.2.12荧光PCR反应混合液：TagManUniversalPCRMasterMix（美国应用生物系统公司产品或等效产品），包含AmpliTaqGoldDNApolymerase，AmpEraseUNG、dNTPs、dUTP以及优化的PCR反应成分。bZxz.net
Mannheim公司产品或等效产品）。5.2.13DIG标记的核酸探针（德国Boehringer碱性磷酸酶标记的DIG抗体（RocheDiagnostics1-O93-274或等效产品）。5.2.14
核酸探针斑点杂交阳性对照：已知受IHHNV感染、组织病理学上有明显IHHN病灶且核酸5.2.15
探针斑点杂交检测呈明显阳性结果的对虾样品组织匀浆上清液或血淋巴。5.2.16核酸探针斑点杂交阴性对照：已知未受IHHNV感染且核酸探针斑点杂交检测呈明显阴性结果的对虾样品组织匀浆上清液或血淋巴。5.3临床症状
患有急性IHHN的细角滨对虾（Litopenaeusstylirostris）摄食明显减少，外观及行为表现异常，患病对虾在养殖池中缓缓上升到水面.静止后翻转继而又缓慢沉到水底，腹部向上，出现这种行为的对虾在几小时内不断重复这个过程，直到体力不支或被其他健康对虾攻击和吞食。感染期的细角滨对虾表皮上皮，特别是腹部背板接合处经常出现白色或浅黄色的斑点（该斑点的形状及出现部位与对虾白斑综合征的特征性白斑不同），使对虾看上去体色斑驳。继而这种斑点会逐渐消褪。同时，感染了IHHNV的细角滨对虾和斑节对虾（Penaeus monodon）在死时体色常偏蓝，腹部肌肉不透明。凡纳滨对虾（Litopenaeus
Jannam
）感染IHHNV后表现为RDS，主要影响是患病对虾生长缓慢，节对虾也会患RDS。稚虾或大一些的凡纳滨对虾惠表皮畸形，但死亡率很低。养殖的细角滨对虾和斑慢性矮小残缺综合症的严重程度及流行与幼体或虾阶段的早期感染有关。患病稚虾表现额角弯曲、变形，触角鞭毛皱起，表皮粗糙或残缺。患RDS的稚虾大小差异很大，且一般比正常的对虾短小。5.4聚合酶链式反应（PCR）
5.4.1取样和制样
5.4.1.1取活虾或死的对虾组织作为样品，死亡2h后不可采用。处理前要将样品放在冰上。如果2h以后才能处理，应将样品保存在10倍以上体积的95%乙醇中，放置在室温下可保存1个月。5.4.1.2仔虾或稚虾：取整只虾或虾头作样品。取虾头时，用灭菌剪刀和镊子去除眼晴、头胸甲、所有的胸部附器和头部以后的腹部。5.4.1.3成虾取鳃丝、上皮、肝胰腺或肠或取附肢或血淋巴作为样品：取附肢时，用灭菌剪刀剪去头部和腹部两面三刀侧的附肢，如触角、颚足、步足和游泳足，用小剪刀剪碎。样品保存在一20℃。取血淋巴时，先用1mL针管吸取500μL10%的柠檬酸盐（见附录C的C.1）溶液，然后在针管前插上一个26号的针头。抓住对虾，使腹部朝上。将针头水平地插人第一和第二对游泳足之间，并一直插到最后一对胸部附器的凹陷处。缓慢吸取血淋巴。血淋巴样品需保存在一70℃。3
SN/T1673—2013
5.4.2病毒DNA抽提
取样品50mg~100mg，加人100μL~200μL的蛋白酶K（见C.2）溶液，混勺后用于55℃作用直至组织完全消化，再加CTAB溶液（见C.3）至900μL，混勾后于25℃作用2h加人600μL提取液I，充分混合至少30s。12000r/min离心5min，取上层水相：加人700μL提取液IⅡ，充分混合至少30s。12000r/min离心5min，取上层水相：加人1.5倍体积的一20℃无水乙醇，混匀后，一20℃放置6h以上，15000r/min离心30min，弃上清，立即用滤纸吸干，37℃干燥30min：最后加12μL水溶解后，作为PCR模板。也可以使用其他等效试剂盒和其他方法抽提病毒DNA。5.4.3设立对照
样品核酸抽提过程按5.2.5设立阳性对照、阴性对照和空白对照。5.4.4配备反应混合物
反应体系为100μL：10×PCR缓冲液10μLMg2+（25.0mmol/L）10μL，引物（40μmol/L)上下游引物各2.5μL，dNTP(10mmol/L)2μL，Tag酶1μL，模板10μL，然后加水至总体积到100μL，振荡混匀后稍离心，使液体集中在底部，再将反应管至于PCR仪器中5.4.5PCR扩增
按照以下程序进行扩增：94℃4min预变性；然后进行32次循环（94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min），72℃延伸10min；4℃保温。5.4.6琼脂糖电泳
用TBE缓冲液（见C.4)配制成1.5%的琼脂糖（含0.5μg/mLEB），胶厚0.5cm。将平板放入水平电泳槽，电泳缓冲液刚好淹没胶面。将8μL样品和2μL样品缓冲液，混匀后加人样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。20mA~30mA电泳约0.5h，溴酚蓝到达底部时停止。紫外灯下观察核酸带。
5.4.7结果判定
5.4.7.1在紫外观察灯上或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。如果阳性对照在相应位置上出现扩增带，而阴性对照和空白对照无扩增带，实验成立。5.4.7.2
5.4.7.3首先使用引物389F和389R进行扩增，如果出现389bp条带时，可用其他两对引物77012F和77353R，392R和392F进行PCR复核，如果同样出现356bp、392bp条带时，将PCR产物进行序列测定。序列测定的结果同GenBank中参考序列进行比较（序列参见附录B），如果序列同源性在95%以上，可进一步确认待测样品结果为阳性。5.4.7.4·在样品检测结果是阳性时，用引物309F/R和引物MG831F/R进行IHHNV分型检测。如果用引物309F/R扩增出现309bp条带时，认定样品是IHHNVI型和ⅡI型：如果用引物MG831F/R扩增出现831bp条带时，认定样品是IHHNVⅢ型。5.4.7.5无扩增带或扩增带的大小与预计的大小不一致为阴性。结果可疑时，可补充组织病理学诊断或实时荧光PCR技术诊断或原位杂交技术进行诊断确认。5.5实时荧光PCR
5.5.1取样和制样
具体见5.4.1。
5.5.2DNA模板准备
具体见5.4.2。
5.5.3实时荧光PCR反应体系配制SN/T1673—2013
在o.2mLPCR薄壁管或八联管中，按每个样品ioXTagManUniversalPCRMasterMix2.5μL、上游引物（IHHNV1608F)1μL、下游引物（IHHNV1688R）1μL、探针0.5μL、DNA模板2μL、水（无DNase）18μL配制成总体积为25μL的Real-timePCR检测体系。同时设置不含DNA模板的空白对照，IHHNV阳性对照和阴性对照。5.4.4实时荧光PCR反应
将加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置：第一阶段，预变性95℃10min；第二阶段，95℃15s，60℃1min，40个循环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。5.5.5结果判定
阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。阴性对照和空白对照应无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应<40，并出现特定的扩增曲线。否则实验无效。
待检样品的Ct值≤40个循环并且出现特定的扩增曲线，结果判定为样品阳性：待检样品Ct值40个循环，结果判定为阴性。待检样品Ct值介于35和40之间时，应重新进行实时荧光PCR检测。若重新检测的Ct值≥40时，则判断样品阴性。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，则判断样品阳性。
5.6斑点杂交
5.6.1取样与制样
5.6.1.1取对虾的个体（适用于3cm以下幼虾、仔虾、幼体或受精卵）或对虾的附肢，胃、血淋巴或鳃丝组织（适用于活体或冷冻的成虾）样品5.6.1.2整虾、虾头或附肢样品约0.1g，置于1.5mL微型离心管中，加人0.3mLTN研磨液（见C.5），用研磨棒将样品充分研磨后，8000r/min~10000r/min离心2min，取上清液备用。5.6.1.3在1.5mL的微量离心管中，1μL样品加9μLTE缓冲液（见C.6）（含50μg/mL鲑鱼精子DNA）稀释待测样品。
5.6.1.4样品在沸水中煮沸10min，快速放在冰上粹冷5min。在冷却状态下短时离心使所有的液体集中在底部，并使凝集的蛋白沉淀。点样前要把样品一直放在冰上。5.6.2操作方法
5.6.2.1根据待检样品数量以及阴性对照和阳性对照总数量，隔着衬纸在硝酸纤维素膜上用软铅笔划格，每样为5mm×5mm小格，沿框线将所需大小的杂交膜剪下，一式两张。左上角剪角的一张为测试膜，左上角用软铅笔点点标记的为对照膜。5.6.2.2将测试膜和对照膜飘浮于双蒸水表面，使其沉人水中吸水10min.然后浸泡于20×SSC（见C.7)中5min，取出膜置于滤纸上晾干。5.6.2.3每个样品分别取1L点到测试膜和对照膜的相应位置上，自然晾干，将测试膜和对照膜夹于5
SN/T1673—2013
两张滤纸中间，放于80℃烘烤30min或紫外线照射3min固定样品。5.6.2.4把水浴锅温度调整到68℃，根据测试膜和对照膜的面积大小准备所需的预杂交液（见C.8）（每片10cm×15cm的膜需要8mL溶液）。把电热搅拌器的振荡频率调到低”，搅拌、加热30min，直到块状的试剂溶解。
5.6.2.5从烘箱或紫外灯下中取出测试膜和对照膜分别放于两只杂交袋中，加人5.6.2.4准备好的预杂交液，封口后，放在68℃水浴0.5h~1h。将地高辛标记的探针煮沸10min，放在冰上冷却。低温下稍离心，使液体集中在底部，放回5.6.2.6
冰上。从杂交袋中吸掉原有杂交液，每张膜中加入2mL新配制的预杂交液，在测试膜中再加人40ng的地高辛标记的探针，边加边充分混合，而对照膜不加探针。封口后放回68℃水浴锅中反应8h～12h。
室温下，在平血中用2×SSC/0.1%5.6.2.7完全剪开杂交袋，取出5.6.2.6中的测试膜和对照膜，SDS（见C.9）洗涤测试膜和对照膜两次，每次5min，间歇摇晃。X8SC/0.1%SDS(见C.10)(0.5mL/
根据测试膜和对照膜的面积大小准备所需的0.15.6.2.8
cm2）；取出5.6.2.7中的测试膜和对照膜，分别置于两只新的杂交袋中，用微量移液液器加入0.1×5min，洗涤3次，每次洗后换一新的杂交袋。SSC/0.1%SDS.68℃水浴中孵育155.6.2.9取出杂交袋中的测试膜和对照膜，室温下，在平血中用BufferI（见C.11)洗涤测试膜和对照膜一次，5min.间歇摇晃。
5.6.2.10将测试膜和对照膜分别装于两只新的杂交袋中，加人BufferIⅡl（见C.12）室温放置30min。然后再将膜分别装于两只新的杂交袋中，加人BufferI，室温放置min
5.6.2.11测试膜和对照膜的袋子中每张膜加3mL用BufferI稀释到1/5000的碱性磷酸酶标记的DIG抗体，放在振荡器上，室温下振荡30min~45min。5.6.2.12完全剪开杂交袋，取出测试膜和对照膜，在平血中用BufferI室温下洗涤测试膜和对照膜再用BufferⅢl见C.13）室温下洗涤测试膜和对照膜5min，间摇晃。2次，每次15min.间歇摇晃
5.6.2.13将测试膜和对照膜分别装于两只新的杂交液中分别加人3mL临用前配好的显色液I（见h一2h，在显色过程中.可短时间取出膜进行观察，勿搅动，观察后立即C.14)室温下在暗处反应1h
放回。
5.6.2.14在测试膜上阳性对照样品明显出现颜色且测试膜和对照膜有所变色时，立即剪开杂交袋，取出膜，用BufferIV（见C.15）终止反应，把膜放在滤纸上晾干。对光观察，记录结果。5.6.3结果判定
5.6.3.1检测结果的判定要将测试膜与对照膜对照进行。测试膜上阳性对照样品的显色应为淡蓝褐色，阴性对照样品应为无色。参照膜上阳性对照和阴性对照均无色或膜上出现黄色、红色等颜色都不是病毒存在导致的显色结果。
5.6.3.2测试膜上斑点显蓝褐色，而对照膜对应斑点不显色或颜色比测试膜上浅得多时，该样品判断为阳性，该结果提示活虾和敏感宿主已被IHHNV感染，或对虾产品及其他产品曾被IHHNV感染；测试膜斑点不显色，该样品判断为阴性；测试膜与对照膜均有明显的颜色，则该样品由于样品处理的问题存在明显的非特异性反应干扰，测试结果无法判断，应重新检测。5.7原位杂交
5.7.1操作方法
5.7.1.1将活的对虾个体（适用于仔虾、幼体或受精卵）置于DavidsonsAFA固定液（见C.16）中固定：对于活幼虾或成虾，则用洁净锋利的刀片将其头胸部切为两半，将其中一半置于Davidson'sAFA6
固定液中固定，24h后置于70%乙醇中。每次实验都要设立阳性对照和阴性对照。SN/T1673—2013
5.7.1.2将样品置于程控组织脱水机中进行脱水、透明、浸蜡，在程控石蜡包埋机上进行包埋（也可使用手工脱水和包埋步骤），用石蜡切片机进行切片，厚度5μm，用毛笔将切片移入展片水浴锅内展片，用已预包被500μg/mL多聚赖氨酸（见C.17）载玻片捞出，放在玻片架上，置于切片烘片机60℃烘烤45min。
5.7.1.3将组织切片（包括阳性对照和阴性对照）在切片染色缸中依次通过二甲苯（3次，5min）、无水酒精（2次，1min/次）、95%酒精（2次，10s/次）80%酒精（2次，10s/次）50%酒精（1次，10s/次）蒸馏水漂洗6次（不要让切片干燥）。5.7.1.4用磷酸盐缓冲液（PBS）（见C.18）漂洗载玻片5min。将载玻片置于湿盒内，每张切片加人1mL用PBS制备的100μg/mL新鲜蛋白K（见C.19）.37C孵育15min后，用吸水纸吸干。5.7.1.5把玻片放回玻片架，室温下用0.4%冷甲醛固定切片5min。5.7.1.6将切片放在2×SSC的切片染色缸中室温下培养5min。5.7.1.7把玻片放平，加0.5mL~
30min。
ImL预茶
交缓冲液（见C20），37℃在湿盒中培养15min~把地高辛标记的探针煮沸10n，放在冰上冷却，在冷却状态下稍振荡后放回冰上。用预杂5.7.1.8
交液将探针稀释到25ng/mL，取25gmL加到切片上，42℃反应2h～4h或放在湿盒中37℃过夜。用吸水纸吸干。在反应时把漂洗缓冲液置于37℃顶热5.7.1.9把玻片放在玻片架上，按下列程序漂洗：2×SSC（2次，5min/次，37℃）、1×SSC（2次，5min/次，37℃）.0.5×SSC2次5min/次，37℃）。5.7.1.10把玻片放在缓冲液I中室温闭.37C下培养15min，用吸水纸吸干置湿盒中放平，每个玻片加0.5mLBufferⅡ封记的DIG抗体，稀释1000倍。每个组织切片加500μL，置湿5.7.1.11用缓冲液Ⅱ将碱性磷酸酶标话盒内37℃反应30min。
5.7.1.12把玻片放在玻片架上，室温下用缓冲液I漂洗2次，每次5min，用吸水纸吸干。再用缓冲液Ⅲ漂洗1次，每次5min~1omin
每个玻片中加人500μL显色液Ⅱ，置湿盒中，室温下在暗环境里5.7.1.13制备显色液Ⅱ（见
反应2h～3h。在显色过程中，可短时间取出组织切片在显微镜下观察，当阳性对照明显显色时可终止反应。
5.7.1.14用微量移液器吸去组织切片上的显色液Ⅱ，把玻片放回玻片架，室温下置于1×缓冲液IV中15min，终止显色反应。
5.7.1.15在切片染色缸中，依次用蒸馏水（10s）、0.5%俾斯麦棕-Y（BismarckbrownY）（见C.22）（5min）、95%酒精（3次，10s/次）、纯酒精（3次，10s/次），二甲苯（4次，10s/次）漫洗组织切片（勿让切片干燥，可以使切片始终放在二甲苯中，直到封片）。5.7.1.16往每一组织切片上滴加两滴中性树胶，封片。5.7.2结果判定
5.7.2.1受IHHNV感染的细胞显示阳性反应，即细胞核内有较深的蓝黑色沉淀，而阴性对照的细胞核着色为浅棕色。感染程度越深，则着色越明显5.7.2.2阳性对照样品不出现蓝黑色到黑色细胞沉淀物，或阳性对照样品和阴性对照样品均出现显色反应相当的明显非特异性反应，判断检测结果无效，应重新取样检测。7
SN/T1673—2013
综合评定
6.1临床诊断符合5.3描述的症状的样品，使用斑点杂交、原位杂交，PCR和荧光PCR等方法中的任何一种方法的检测结果为阳性的均可判为阳性。6.2临床诊断不符合5.3描述的症状的样品，当PCR检测为阳性时，还需要进行测序与标准序列比对相似性在95%以上，才能判为阳性。6.3基因分型判定：经PCR确认为阳性后，同时使用309F/309R和MG831F/MG831R引物进行基因分型判定。如用309F/309R扩增，结果为阳性，则判定为感染有传染性皮下和造血器官坏死病毒I型和IⅡ型。如用MG831F/MG831R扩增，结果为阳性，则判定为感染有传染性皮下和造血器官坏死病毒血型。
附录A
（资料性附录）
传染性皮下和造血器官坏死概述SN/T-1673—2013
传染性皮下和造血器官坏死病是由传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）引起的。IHHNV隶属于细小病毒科短浓核病毒属，国际病毒分类委员会暂定种名为PstDNV（forPenaeus stylirostrisdensovirus），但OIE仍然用IHHNV的名称。IHHNV是目前已知的最小的对虾病毒。病毒粒子大小为20nm～22nm，是无囊膜的二十面体，在CsCl中的浓度为1.40g/mL，线性单链DNA，估计长度为4.1kb，核衣壳蛋白至少由4个分子量分别为74kD、47kD、39kD、37.5kD的多肽组成。地理分布：IHHNV可感染世界各地养殖对虾，太平洋东部沿岸从秘鲁到墨西哥的野生对虾中发现有IHHNV，太平洋岛屿包括夏威夷群岛、法属波利尼西亚、关岛和新卡里多尼亚养殖对虾中也发现有IHHNV感染，IHHNV还可感染东亚东南亚和中东地区的养殖对虾和野生虾（Lighnter，1996）。临床症状：大部分的对虾都有可能感染IHHNV，包括目前饲养较多的斑节对虾、南美白对虾和红额角对虾等对虾品种。IHHNV感染太虾和红额角对虾后，可以引起大暴发和高死亡率（>90%），红额角对虾从稚虾到接近成虾是受影响最严重的阶段。垂直感染IHHNV的幼体和早期的仔虾不会表现出症状，但大约35日龄后到稚虾期就可可能观察到发病的症状，接看就会出现大量死亡。水平感染的稚虾会引起急性流行并会大量死亡，其潜伏期的长短和疾病的严重程度取决于虾的大小和日龄，小一些的稚虾最严重，而受感染的成虾很少表现出发病症状或死亡。患有急性IHHN的红额角对虾摄食明显减少，外表及行为表现异常，患病对虾在养殖池中缓缓上升到水面，静止后翻转继而又缓慢沉到水底，腹部向上，出现这种行为的对虾在几小时内不断重复这个过程，直到体力不支或被其他健康对虾攻击和吞食。感染期的红额角对虾表点（此种斑点的形状及出现部位不同于对虾白种斑点会逐渐消褪
同时，感染了IHHN
夏部背板接合处经常出现白色或浅黄色的斑特别是膜
，使对虾看上去体色斑驳。继而这额角对虾和斑节对虾在死时体色常偏蓝，腹部肌肉不透明。南美白对虾感染IHHNV后表现为慢性矮小残缺综合症（runt-deformitysyndrome，RDS），主要影响是患病对虾生长缓慢，表皮畸形，但死亡率很低。据报道养殖的红额角对虾和斑节对虾也会患慢性矮小残缺综合症。稚虾或大一些的南美白对虾患慢性矮小残缺综合症的严重程度及流行与幼体或仔虾阶段的早期感染有关。患病稚虾表现额角弯曲、变形，触角鞭毛皱起，表皮粗糙或残缺。患RDS的稚虾大小差异很大，且一般比正常的对虾短小。南美白对虾和红额角对虾的稚虾如没有感染IHHNV且没表现RDS，其患RDS的种群变异系数CV等于标准偏差与一个种群内不同组别大小的平均数的比值，通常只有10%～30%，而感染患病的对虾CV通常大于30%，有时甚至会接近90%。斑节对虾感染后，通常症状不明显，但引起RDS，造成生长缓慢和生产性能下降。IHHNV可影响南美白对虾的各个生长期（如卵、幼体、仔虾、稚虾和成虾）。IHHNV已确定至少有四个不同的基因型。一是美洲和东亚（主要是菲律宾），二是东南亚，三是东非，四是西印度-太平洋。前两个基因型可以感染代表性的对虾南美白对虾和斑节对虾，而后两个变异的基因型也许并不会感染这些对虾品种。其中392F/R和389F/R两对引物是检测包括3A型和3B型在内的西太平洋、东非、澳大利亚和印度所有IHHNV已知病毒型的最合适引物。309F/R只扩增IH-HNV的I型和Ⅱ型（IHHNV感染型）一段目的片断。而MG831F/R引物可以扩增3A型和3B型非感染型片断。
SN/T1673—2013
附录B
（资料性附录）
IHHNVPCR目的片段序列
389F和389R引物扩增产物序列（大小389bp）B.1
cggaacacaa
gcgactggaa
catcagagaa
agatcatggt
tagagctaca
gactacggta
tgaacggctt
cccgacttta
gagagtgaga
aaaccacaae
actggc
atcctcgcct
cttgttagaa
tcgtattttg
ttgaagggac
ttgataaaca
caagaagact
acatcacata
atttgggagt
etatcaagag
gtettggec
392F和392R引物扩增产物序列（大小392bp）1
gggcgaacca
ccagggaatt
cgaacaactt
tcaaactcet
ctgggaattc
teccttggaa
tacatcagtg
gaatcactta
tctccaagce
cttaatatgt
ccaagaactt
gagagggaad
gtgttgga
acacatcag
Bigaattget
ttctcace
ctgaagaact
caacaccaga
aggaaacgga
cagtaatg
atteetcegg
77012F和77353R引物扩增产物序列（大小356bp）1
atcggtgcac
accttccatc
agtcaaataa
ataaaacacc
gatgtggact
ttccacetga
tacaaaacet
cagtggacga
aagagtcaga
actgggtace
caagcaaat
tgaacact
catcggaaag
cttcaaactc
aattatggga
tccagctgat
aaaaggcctc
309F和309R引物扩增产物序列（大小309bp）1
tccaacactt
acgatgagga
ggggaatact
ttacaaacct
agtacatgtt
tagcagaca
agtcaaaacc
atacaaacag
aacttactac
gcaaaatata
agccaacaac
aaatctgcaa
ctatggaccc
aacaacaaga
tcaaaaagga
gacatccgtg
tcccaacgga
agtggaa
etceggacga
ctecgga
tacetttgct
atggatacte
icgagaacgc
aggtccaaat
cagttt
acaaacigatc
acaattcaac
aggggtaaaa
ggcctagtaa
tcctacgcte
ctttcgaag
cgaataccaa
ggtaaagctc
tcagacagga
gaacagtcca
gcaccagagg
aaaagtcaaa
aaccagacta
taccagaaat
ccggacgaaa
acaacatggt
acgccaaact
ccaaccaata
gccagagccg
tatcttatca
acgaacgaaa
caagacccta
tcagacgagg
ctaaggtctg
ttggaagtga
agagacagag
caagaacagg
tettcgaaga
gatcagactt
tcttcatatc
tacaaacaag
tgaacagcca
agaacttgtc
acaatataaa
ccaaagccaa
cgacaacatg
cttagcttgg
tggacggaag
acaccttcgt
tcaccattac
agaccagaca
aagctgaagc
gatacggtat
ctcactccag
aacccactac
aagacaactc
cgtggataac
atcagaaacc
aggaattact
agactcaaac
acccagaate
agaagtaaac
aacaaacaaa
aacaaaaacc
gtacga
aataaacttg
gacaaactca
ctgtcactca
cagtggataa
ataatcatcg
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