SN/T 4818-2017.Determination of ractopamine 、salbutamol、clenbuterol hydrochloride in edible animal for imported and export-Enzyme linked immunosorbent assay method.
1范围
SN/T 4818规定了进出口食用动物的血浆、尿液中莱克多巴胺、沙丁胺醇和盐酸克伦特罗残留检测的酶联免疫吸附测定方法。
SN/T 4818适用于进出口禽类的血液、畜类的血液及尿液中莱克多巴胺、沙丁胺醇和盐酸克伦特罗残留量快速筛选检测,适用于出人境检验检疫工作。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
利用抗原抗体特异性结合的特性和酶的高效催化作用,通过化学方法将辣根过氧化物酶(HRP)与
克伦特罗(CL)偶联,形成辣根过氧化物酶标记克伦特罗。将固相载体上已包被的抗体与特异性的抗克伦特罗抗体结合，使抗克伦特罗抗体固相化，然后加入待测克伦特罗和辣根过氧化物酶标记克伦特罗，它们竞争性地与克伦特罗抗体结合,洗涤后加显色剂，根据显色剂的颜色变化计量待测克伦特罗量。若
待测克伦特罗多,则被结合的酶标记克伦特罗少，显色剂颜色浅,反之则深。用目测法或比色法测定样品中的克伦特罗含量,比色的最佳波长为450 nm。
沙丁胺醇与莱克多巴胺原理同克伦特罗。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4818—2017
进出口食用动物中莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸克伦特罗的测定酶联免疫吸附法
Determination of ractopamine,salbutamol,clenbuterol hydrochloride in edibleanimal for imported and export-Enzyme linked immunosorbent assay method2017-07-21发布
2018-03-01实施
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T4818—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局本标准主要起草人：孙明君、孙涛、梁广辉、梁成珠、郑小龙、岳志芹、朱来华、徐彪。H
1范围
进出口食用动物中莱克多巴胺
沙丁胺醇、盐酸克伦特罗的测定酶联免疫吸附法
SN/T4818—2017
本标准规定了进出口食用动物的血浆，尿液中莱克多巴胺，沙丁胺醇和盐酸克伦特罗残留检测的酶联免疫吸附测定方法。
本标准适用于进出口禽类的血液、畜类的血液及尿液中莱克多巴胺、沙丁胺醇和盐酸克伦特罗残留量快速筛选检测，适用于出人境检验检疫工作。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
利用抗原抗体特异性结合的特性和酶的高效催化作用，通过化学方法将辣根过氧化物酶（HRP)与克伦特罗（CL）偶联，形成辣根过氧化物酶标记克伦特罗。将固相载体上已包被的抗体与特异性的抗克伦特罗抗体结合，使抗克伦特罗抗体固相化，然后加人待测克伦特罗和辣根过氧化物酶标记克伦特罗，它们竞争性地与克伦特罗抗体结合，洗涤后加显色剂，根据显色剂的颜色变化计量待测克伦特罗量。若待测克伦特罗多，则被结合的酶标记克伦特罗少，显色剂颜色浅，反之则深。用目测法或比色法测定样品中的克伦特罗含量，比色的最佳波长为450nm。沙丁胺醇与莱克多巴胺原理同克伦特罗4试剂与材料
4.11mol/L氢氧化钠：配制参见附录A，试验用水应符合GB/T6682要求。4.2
乙酸乙酯：分析纯。
β-葡萄糖醛酸苷酶：含β-葡萄糖醛酸苷酶111000U/mL。磷酸钾缓冲液。
硼酸盐缓冲液。
包被缓冲液。
洗涤缓冲液。
封闭缓冲液。
稀释缓冲液。
4.10辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液，1
SN/T4818—2017
4.11底物液。
4.12显色剂液。
4.13终止液。
4.14抗抗体（克伦特罗为羊抗鼠IgG，沙丁胺醇、莱克多巴胺为免抗绵羊IgG)。4.15抗体（克伦特罗为鼠源单抗、沙丁胺醇和莱克多巴胺均为绵羊源多抗，抗体效价应>5000或有效抗体含量应>5mg/mL、ICso<1.0）。4.16HRP偶联物（克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺3种，交联比为（6～12）：1，以偶联物浓溶液保存，使用前需用辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液稀释）4.17包被IgG抗体的聚苯乙烯微量96孔反应板。4.18标准品：莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸克伦特罗（英文名称分别为：RactopaminehydrochlorideSalbutamol sulfate,Clenbuterol hydrochloride),纯度≥99%。4.19标准品贮备液：准确称取标准品（折合成目标化合物10.0mg），用适量甲醇溶解，并用甲醇定容至10mL，混匀。一18℃以下避光保存，有效期为12个月。4.20标准品中间液：用甲醇稀释标准储备液至10mg/L，4℃以下避光保存，有效期为6个月。4.21标准品工作液：用稀释缓冲液稀释标准中间液至工作浓度0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7ug/L、8.1μg/L，现用现配。
5仪器和设备
5.1分析天平：感量0.0001g。
5.2酶标仪，带有450nm滤光片。5.3离心机：转数≥8000r/min。5.4超声波发生器。wwW.bzxz.Net
5.5微量移液器：单道20μL、50μL100μL和多道50μL~350μL。5.615mL离心管。
酸度计：pH测量范围0~14。
涡旋式混合器。
5.9旋转蒸发仪。
振荡器。
6测定步骤
6.1试样制备和保存
6.1.1试样制备
分别取食用活动物的血液100mL放于抗凝血试管中，新鲜尿液样品约50mL，将样品分成两等份，装人洁净容器内，作为试样密封并标明标记。6.1.2试样保存
所采集食用动物的尿液、血浆置于4℃下保存备用，可保存3天～4天。若长期保存需将试样于一18℃以下冷冻保存，在制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化6.2提取
取0.5mL样品于15mL螺纹离心管中，加人3mL磷酸钾缓冲液稀释。然后加入10μLβ-葡萄糖2
SN/T 4818—2017
醛酸酶，在37℃条件下水解2h（或者在室温下过夜）。再加人2mL硼酸盐缓冲液，并用1mol/LNaOH调节pH至8～9。用3mL乙酸乙酯漩涡振荡萃取。室温（20℃~25℃）下，4000g离心10min。取上清液于新离心管中，60℃蒸干。干燥残留物溶于0.5mLPBS缓冲液。每孔取50μL备用检测。
6.3酶联免疫测定
6.3.1根据待测样品数量和标准样品（每个样品2个平行），决定微孔的使用量，6.3.2每孔100μL抗体包被板4℃过夜。6.3.3将微孔内液体垂直倒掉，加人250μL洗涤缓冲液，轻轻晃动后垂直倒掉，再重复洗涤微孔3次在滤纸上用力垂直磕掉残留在壁上的液体。每孔加250μL2%牛血清白蛋白.37℃封闭2h6.3.44
5重复6.3.3操作。
每个微孔中加入100μL的抗体，小心混合后在室温（20℃～25℃）下孵育15min。6.3.7重复6.3.3操作。
每个微孔加人50uL标准溶液或待测样品溶液，然后加人100辣根酶标记物，小心地充分混合，室温（20℃～25℃）下孵育30min。6.3.9重复6.3.3操作。
6.3.10每个微孔加人50μL底物液和50叫l.显色剂液，充分混合后在室温（20℃～25℃）下暗处孵育15min
6.3.11每个微孔加人100L终止液，充分混合后30min内于450nm处测量吸光度值。6.4空白试验
除不加试样外，均按6.3测定步骤进行。5质控试验
每次测定均应做一个用空白样品添加药物混合标样的质控样品，添加浓度应为相应产品的检测低限。
7结果计算
7.1标准曲线的绘制
将6个浓度的标准溶液（0μg/L.0.1μg/L.0.3#g/L.0.9μg/L2.7ug/L.8.1ug/L）和待测溶液按限量法测定步骤测定得相应的吸光度值。以O浓度的吸光度BO值为分母，其他标准浓度的吸光度B值为分子的比值，再乘以100，获得吸光度的百分比。以此吸光度百分比为纵坐标，对应的5个标准浓度为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线。该定标模型在0.1μg/L～10μg/L范围内是线性的。7.2
2百分吸光度值的计算
按式（1)计算百分吸光度值：
B样品.×100%
百分吸光度值一
式中：
B样品
样品孔的平均吸光度值：
零标准的平均吸光度值。
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7.3待测溶液中目标物含量的计算将样本的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上得到相应的药物浓度c（μg/L），按式（2）计算血浆和尿液中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇药物的残留量。X=cxf
式中：
X——试样中药物残留量，单位为微克每升（μg/L）；从标准曲线中得到的试样中药物含量，单位为微克每升（μg/L）；f试样稀释倍数。
计算结果保留三位有效数字。阳性结果需要经过LC-MS/MS方法进行确认。8方法性能指标
8.1灵敏度
本方法在检测猪、牛、羊的血浆和尿液样本中检测低限为0.1μg/L。本方法在检测猪、牛，羊的血浆和尿液样本中定量限为0.3μg/L。8.2回收率
本方法在0.1μg/L～10μg/L添加浓度水平上的回收率均为90%士15%。8.3精密度
·（2）
对于定量分析，每个试样最少应取两份平行样进行分析。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。附录A
（资料性附录）
酶联免疫检测试剂配制
A.11mol/L氢氧化钠：称取40.00g氢氧化钠，用1L容量瓶加水溶解定容SN/T4818-2017
A.275mmol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）：缓冲液A：10.2gKHPOa加人蒸馏水至1000mL，缓冲液B：13.06gK，HPO加人蒸馏水至1000mL，通过缓和缓冲液A和B(按比例1：1)，调节pH至6.8。A.325mmol/L硼酸缓冲液（pH9.0）：9.5g10水硼酸二钠（NazB.O,，10H.O）加人蒸馏水至1000mL。
A.40.05mol/L碳酸盐包被缓冲液（pH9.6）：称取NaHCOa1.46g、Na2CO.0.97g，加水定容至500mL，溶解后置于4℃冰箱保存。A.5洗涤缓冲液：含0.01mol/L~0.05mol/LpH7.5磷酸钠缓冲液，加人0.05%吐温-20。A.6封闭缓冲液：20g牛血清白蛋白加0.01mol/L磷酸盐缓冲液1000mL溶解混勾。A.7稀释缓冲液为0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液1000mL加吐温-200.5mL混匀。
A.8辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液：含0.01mol/L~0.05mol/LpH7.5磷酸钠缓冲液，加人0.05%吐温-20，2%牛血清白蛋白。A.9底物液：过氧化氢，浓度为0.3%。A.10显色剂液：用pH5.0乙酸钠-柠檬酸缓冲液配制0.2g/L的四甲基联苯胺溶液。A.11终止液：2mol/L硫酸溶液。5
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中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
进出口食用动物中莱克多巴胺
沙丁胺醇、盐酸克伦特罗的测定酶联免疫吸附法
SN/T4818—2017
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
印张0.75字数12千字
开本880X12301/16
2018年6月第一版
2018年6月第一次印刷
印数1-500
书号：155066·2-33359定价16.00元18
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