SN/T 4809-2017
基本信息
标准号： SN/T 4809-2017
中文名称：进出口食用动物、饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑药物的测定液相色谱质谱/质谱法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
相关标签： 进出口 食用动物 饲料 二甲 咪唑 药物 测定 色谱 质谱 质谱法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4809-2017.Determination of metronidazole and dimetridazole in edible animal and their feeds for import and export-LC-MS/MS method.
1范围
SN/T 4809规定了进出口饲料中甲硝唑和二甲硝眯唑、食用动物中甲硝唑及其代谢物羟基甲硝唑,二甲
硝咪唑及其代谢物羟基二甲硝眯唑残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。
SN/T 4809适用于进出口饲料中甲硝唑和二甲硝眯唑、畜禽血清和尿液中甲硝唑及其代谢物羟基甲硝
唑,二甲硝咪唑及其代谢物羟基二甲硝咪唑残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法原理
样品用乙酸乙酯提取,氮气吹干后经盐酸溶液溶解,经混合型阳离子交换柱净化后，液相色谱-质谱/质谱法测定,内标法定量。
4试剂和材料
除特别规定外,所有试剂均为分析纯;水为符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1乙酯乙酯:色谱纯。
4.2乙腈 :色谱纯。
4.3无水 硫酸镁。
4.4盐酸 :36%~38%。
4.5 甲醇:色谱纯。
4.6氨水:25%~28%。
4.7甲酸:色谱纯。
4.8混合型阳离 子交换柱:60 mg/3 mL。
4.90.1 mol/L 盐酸:移取5 mL盐酸(4.4)和595 mL水混合。
4.10洗脱溶液:5 mL氨水(4.6)和95 mL甲醇(4.5)混合。
1范围
SN/T 4809规定了进出口饲料中甲硝唑和二甲硝眯唑、食用动物中甲硝唑及其代谢物羟基甲硝唑,二甲
硝咪唑及其代谢物羟基二甲硝眯唑残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。
SN/T 4809适用于进出口饲料中甲硝唑和二甲硝眯唑、畜禽血清和尿液中甲硝唑及其代谢物羟基甲硝
唑,二甲硝咪唑及其代谢物羟基二甲硝咪唑残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法原理
样品用乙酸乙酯提取,氮气吹干后经盐酸溶液溶解,经混合型阳离子交换柱净化后，液相色谱-质谱/质谱法测定,内标法定量。
4试剂和材料
除特别规定外,所有试剂均为分析纯;水为符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1乙酯乙酯:色谱纯。
4.2乙腈 :色谱纯。
4.3无水 硫酸镁。
4.4盐酸 :36%~38%。
4.5 甲醇:色谱纯。
4.6氨水:25%~28%。
4.7甲酸:色谱纯。
4.8混合型阳离 子交换柱:60 mg/3 mL。
4.90.1 mol/L 盐酸:移取5 mL盐酸(4.4)和595 mL水混合。
4.10洗脱溶液:5 mL氨水(4.6)和95 mL甲醇(4.5)混合。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4809—2017
进出口食用动物、饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑药物的测定液相色谱-质谱/质谱法Determination of metronidazole and dimetridazole in edible animal andtheirfeedsforimportandexport-LC-MS/MSmethod2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
进出口食用动物、饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑药物的测定液相色谱-质谱/质谱法SN/T4809-2017
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张1字数26千字
2018年5月第一版
2018年5月第一次印刷
印数1—500
书号：155066·2-33258
定价18.00元
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4809-—2017
本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、山东畜牧兽医职业学院、
本标准主要起草人：张金玲、郭礼强、孙明君、李凯、侯建波、吴伟、张晓文、邵二波、崔晓娜、王洪涛。1范围
进出口食用动物、饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑药物的测定
液相色谱-质谱/质谱法
SN/T4809—2017
本标准规定了进出口饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑、食用动物中甲硝唑及其代谢物羟基甲硝唑，二甲硝咪唑及其代谢物羟基二甲硝咪唑残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本标准适用手进出口饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑、备离血清和尿液中甲硝唑及其代谢物羟基甲硝唑，二甲硝咪唑及其代谢物羟基二甲硝咪唑残留量的测定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法原理
样品用乙酸乙酯提取，氮气吹干后经盐酸溶液溶解，经混合型阳离子交换柱净化后，液相色谱-质谱/质谱法测定，内标法定量。
4试剂和材料
除特别规定外，所有试剂均为分析纯；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1
乙酯乙酯：色谱纯。
乙腊：色谱纯。
3无水硫酸镁。
4.4盐酸：36%~38%。
甲醇：色谱纯。
氨水：25%28%。
甲酸：色谱纯。
混合型阳离子交换柱：60mg/3mL。4.90.1mol/L盐酸：移取5mL盐酸（4.4）和595mL水混合。洗脱溶液：5mL氨水（4.6）和95mL甲醇（4.5）混合。4.10
4.110.1%的甲酸水：1mL甲酸（4.7）和999mL水混合。4.12定容液：取80mL0.1%的甲酸水（4.11)，与20mL乙腈混匀。标准品：甲硝唑（Metronidazole，CH，N.Oa，CAS：443-48-1），纯度99.0%：羟基甲硝唑4.13
（HydroxyMetronidazole，CgH,N,O4，CAS：4812-40-2)，纯度≥99.o%：二甲硝咪唑（Dimetridazole，C,H,N,O，CASNo.551-92-8），纯度≥99.0%；羟基二甲硝咪唑（HydroxyDimetridazole，CH,N.Os，CASNo.936-05-0），纯度≥99.0%；氛代二甲硝咪唑（Dimetridazole-D3，CsH,D,NOz，CASNo.646781
SN/T4809--2017
69-9），纯度≥99.0%；氛代羟基二甲硝咪唑（HydroxyDimetridazole-D3，CHD,NOs，CASNo1015855-78-3），纯度≥99.0%。4.14标准储备溶液：准确称取每种标准品（4.13）0.01g于100mL容量瓶，先用少量甲醇溶解，再用甲醇定容至刻度，混匀，配制成终浓度为100μg/mL的标准储备溶液，在0℃～4℃冰箱中保存，有效期6个月。
4.15标准中间溶液：准确移取每种标准储备溶液（4.14）1mL于100mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，配制成浓度1.0μg/mL的标准溶液；移取1mL1.0ug/mL的标准溶液于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成终浓度均为100ng/mL的标准中间溶液。于0℃~4℃冰箱中保存，有效期3个月。
4.16氛代内标工作溶液：准确移取氛代二甲硝咪唑和氛代羟基二甲硝咪唑标准储备溶液（4.14）1mL于100mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，配制成浓度1.0μg/mL的标准溶液：移取1mL1.0μg/mL的标准溶液于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成终浓度均为100ng/mL的内标工作溶液。于0℃～4℃冰箱中保存，有效期3个月。4.17标准工作溶液：根据需要分别取适量标准中间溶液（4.15），用水稀释成0.25ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL的混合标准工作溶液，现用现配。5
仪器和设备
5.1液相色谱质谱/质谱联用仪：配电喷雾离子源（ESI+）。5.2分析天平：感量分别为0.01mg和0.01g。5.3高速组织捣碎机。
离心机：10000r/min。
5.5涡旋混合器。
聚丙烯离心管：50mL。
微孔滤膜：0.22μm滤膜。
6样品制备与保存
从采集样品中取出有代表性样品，饲料样品经高速组织捣碎机均匀揭碎或混匀，用四分法缩分出适量试样：血液样品待血液凝固后分离出血清；尿液样品直接混匀。各均分为2份，装人干净无污染的密封袋或样品瓶中，做出标记，手一18℃C冷冻保存。7测定步骤
7.1提取
7.1.1尿液
准确量取4mL样品，置于50mL聚丙烯离心管（5.6）中，加人4mL水，再加人内标工作溶液（4.16)40μL，混匀后加人15mL乙酸乙酯涡混均匀，10000x/min离心10min，将上清液转人另一50mL聚丙烯离心管，残渣再次用15mL乙酸乙酯涡混重复提取，合并提取液，氮气吹干，加人0.1mol/L盐酸（4.9)25mL，涡混均匀，待净化。7.1.2血清
准确量取2mL样品，置于50mL聚丙烯离心管（5.6）中，加人内标工作溶液（4.16）40μL，混后2
SN/T4809-—2017
加人乙腈2mL，涡混均匀，加人15mL乙酸乙酯，2.0g无水硫酸镁，涡混均匀，10000r/min离心10min，将上清液转人另一50mL聚丙烯离心管，残渣再次用15mL乙酸乙酯涡混重复提取，合并提取液，氮气吹干，加入0.1mol/L盐酸（4.9）25mL，涡混均匀，待净化。7.1.3饲料
称取5.0g（预混合饲料2.0g，精确到0.01g）样品，置于50mL聚丙烯离心管（5.6）中，加入内标工作溶液（4,16）100μL（预混合饲料加40μL），静置15min后，加人15mL乙酸乙酯均质提取2min，10000r/min离心10min，将上清液转人50mL聚丙烯离心管，残渣再次用15mL乙酸乙酯涡混重复提取，合并提取液，氮气吹干，加入0.1mol/L盐酸（4.9）25mL，涡混均匀，用滤纸过滤，待净化7.2净化
混合型阳离子交换柱（4.8）依次用3mL甲醇、3ml0.1mol/l盐酸活化平衡，将上述提取液过柱，自然重力下流出，依次用5mL0.1mol/L盐酸，5mL甲醇淋洗，最后用5mL洗脱溶液（4.10）洗脱并收集，洗脱液在40℃水浴上用氮气吹干，用1mL定容液（4.12）涡旋溶解，过0.22μm滤膜（5.7），供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
3测定
液相色谱质谱条件
液相色谱条件如下：
a）色谱柱：Cis柱，100mmX3.0mm（内径），粒度1.8μm或性能相当者；b)
柱温：40℃：
流动相：A：0.1%甲酸水溶液，B：乙睛；流速：0.4mL/min；梯度洗脱条件见附录A中表A.1；d
进样量：20pL；
质谱参数条件：见附录A中A.2。e）
7.3.2定性标准
被测组分选择1个母离子，2个子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内·且样品谱图中被测组分监测离子的相对丰度与浓度接近的标准工作溶液谱图中对应的监测离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表1规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。
表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度
允许的最大偏差
7.3.3定量测定
20%~50%
10%~20%
≤10%
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作溶液一起进行色谱分析。用标准工作曲线按内标法定量，标准工作溶液和待测溶液中待测物的响应值在仪器线性响应范围内。在上述色谱条件下甲硝唑、羟基甲硝唑、二甲硝咪唑及羟基二甲硝咪唑的保留时间见表A.2，标准溶液和空白基质的多反应监测（MRM)色谱图参见附录B。3
SN/T4809-2017
7.4空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。8结果计算与表述
采用内标法定量，按式（1)计算甲硝唑、羟基甲硝唑、二甲硝咪唑及羟基二甲硝咪唑残留量，结果保留3位有效数字。
A×AV1000
X=C××
式中：
样品中待测组分残留量，单位为微克每千克或微升每升（μg/kg或者μL/L）；标准工作溶液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）：-样品中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；A
-样品中待测组分的峰面积；
标准工作溶液中内标物的峰面积；样品定容体积，单位为毫升（mL）；标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；样品溶液中内标物的峰面积；
标准工作溶液中待测组分的峰面积；样品称样量或移取量，单位为克或毫升（g或mL）)。mWww.bzxZ.net
9方法性能指标
9.1测定低限
本方法对饲料中甲硝唑残留量测定低限为1.00μg/kg，二甲硝咪唑残留量测定低限为0.50μg/kg；动物尿液中甲硝唑、羟基甲硝唑、二甲硝咪唑及羟基二甲硝咪唑残留的测定低限均为0.50g/kg：动物血清中甲硝唑、羟基甲硝唑、二甲硝咪唑及羟基二甲硝咪唑残留的测定低限均为1.00 μg/kg。9.2
回收率
本方法的不同水平添加浓度和回收率范围参见附录C。精密度
本方法的精密度的实验数据参见附录D4
梯度洗脱条件
见表A.1。
梯度时间
质谱/质谱仪参数
质谱/质谱仪参数如下：
离子源ESI，正离子；
雾化器：氮气；
气体流速：10L/min；
附录A
（规范性附录）
液相色谱-质谱/质谱仪参数\
mL/min
雾化气压力：275.8kPa（40psi)；干燥气温度：350℃；
毛细管电压：4000V；
电子倍增器电压：400V；
扫描方式：正离子扫描；
梯度洗脱条件
流动相A
检测方式：多反应监测（MRM）参数见表A.2。SN/T4809—2017
流动相B
非商业性声明：附录A所列参数是在AgilentHPLC-MS/MS（1290-6460）质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。5
SN/T4809—2017
化合物
二甲硝咪唑
羟基二甲硝咪唑
甲硝唑
羟基甲硝唑
氛代二甲硝
氛代羟基二
甲硝咪唑
母离子
子离子
反应监测参数表
保留时间
毛细管电压
碰撞能量
内标化合物
氛代二甲硝咪唑
尔代羟基二
甲硝咪唑
氛代羟基二
甲硝咪唑
氛代羟基二
甲硝咪唑
注：带*的离子为定量离子：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳6
（资料性附录）
标准品和空白基质多重反应监测（MRM）色谱图[email protected](142.0000->81.000)WorklistData-5.d二甲硝咪唑(142.0/81.0)
[email protected](142.0000>96.000WorklsData-5.d二甲硝咪唑(142.0/96.0)
[email protected](145.0000->99.000)WorklistData-5.d氧代二甲硝咪唑（145.0/99.0)）SN/T4809—2017
[email protected](158.000>55.10)WorkisiDat-6.d羟基二甲硝咪唑(158.0/55.1)
XMRMFg90.0VC000F=00000(8.000>1900Wokisd-5整基二甲硝腺唑(158.0/139.9)
[email protected](161.0000->142.9000)WorklistData-5.d尔代羟基二甲硝咪唑(161.0/142.9)[email protected](172.0000-82.0000)WorklistData-5.dX102
甲硝唑（172.0/82.0)
XESMRMFrg700VCF.00F000C0072.000>128.000) WorkistD-5d甲硝唑（172.0/128.0）
[email protected](188.000->123.000)Workistdat-5.d羟基甲硝唑(188.0/123.0)
X10+ESIMMFrag75.0VCF=0.00DF=0.000CI14.0(188.000->126.000)WorkisiData-5.d羟基甲硝唑(188.0/126.0)
0.20.40.60.811.21.41.61822.22.42.62.833.23.43.63.844.24.44.64.855.25.45.65.8Counts(%)vs.AcquisitionTime(min)图B.1
甲硝唑和二甲硝咪唑及代谢物的液相色谱-质谱/质谱提取离子色谱图（1.0μg/L）SN/T4809—2017
[email protected](142.0000->81.000)WorklistData-18.d二甲硝味唑(142.0/81.0）
[email protected](142.0000->96.000)WorklistData-18.d102
二甲硝味唑(142.0/96.0)
[email protected](45.000->9.000Workisdatl-18.d尔代二甲硝咪唑(145.0/99.0)
[email protected](158.0000>55.1000)WorklistData-18.dX102
羟基二甲硝咪唑(158.0/55.1)
[email protected](158.0000->139.9000)WorklistData-18.d羟基二甲硝咪唑(158.0/139.9)
SMFrg=90.0VCF000.00 C00 (000>142900 WorkistDat-1.d狐代羟基二甲硝咪唑(161.0/142.9)[email protected](172.0000->82.000)WorkistDat-18.d甲硝唑(172.0/82.0)
M00000000000001000 orlia-
甲硝唑(172.0/128.0)
[email protected](188.0000->123.000.0)WorklistData-18.d羟基甲硝唑(188.0/123.0)
[email protected](188.0000->126.0000)WorklistData-18.d羟基甲硝唑(188.0/126.0)
0.20.40.60.811.21.41.61.822.22.42.62.833.23.43.63.844.24.44.64.855.25.45.65.8Counts(%)vs.AcquisitionTime(min)图B.2
甲硝唑和二甲硝咪唑及代谢物空白基质（猪血清）的液相色谱-质谱/质谱提取离子色谱图样品
鸡全价料
鸡浓缩料
鸡预混料
牛全价料
化合物
附录C
（资料性附录）
回收率
SN/T4809—2017
甲硝唑和二甲硝咪唑及代谢物在不同饲料基质中的添加水平及回收率范围添加浓度
μg/kg
甲硝唑
二甲硝
甲硝唑
二甲硝
甲硝唑
二甲硝
甲硝唑
二甲硝
二甲硝
牛浓缩料
回收率范围
85.4~110.5
84.3111.4
90.2~113.1
91.0~109.6
90.7~108.5
89.9~112.3
91.3~114.7
88.2~116.3
91.3~113.9
90.2~109.6
91.3~109.3
80.5~112.3
83.9~110.6
90.9~111.4
80.5~110.4
84.3~108.0
81.4~102.9
90.5~114.4
90.4~110.5
87.8~113.3
91.4~109.4
88.8~111.0
90.1~109.6
91.0~109.2
90.8~109.3
91.4~108.7
牛浓缩料
牛预混料
猪全价料
猪浓缩料
猪预混料
化合物
甲硝唑
甲硝唑
二甲硝
甲硝唑
二甲硝
甲硝唑
二甲硝
甲硝唑
三甲硝
添加浓度
回收率范围
82.5~109.2
82.5~112.5
90.9~113.8
84.7~114.3
84.3~107.0
91.1~113.3
81.8~112.4
85.1~108.7
80.7~101.7
90.9~114.5
87.3111.9
81.5~113.5
90.0~109.6
90.4~111.4
90.9~110.0
81.1~111.1
84.8~111.2
91.9~113.6
91.4~106.4
90.7~108.2
90.6~109.8
87.3~113.6
88.8~112.2
91.4~113.5
82.4~110.8
84.4~110.4
81.4~103.5
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进出口食用动物、饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑药物的测定液相色谱-质谱/质谱法Determination of metronidazole and dimetridazole in edible animal andtheirfeedsforimportandexport-LC-MS/MSmethod2017-07-21发布
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本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4809-—2017
本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、山东畜牧兽医职业学院、
本标准主要起草人：张金玲、郭礼强、孙明君、李凯、侯建波、吴伟、张晓文、邵二波、崔晓娜、王洪涛。1范围
进出口食用动物、饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑药物的测定
液相色谱-质谱/质谱法
SN/T4809—2017
本标准规定了进出口饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑、食用动物中甲硝唑及其代谢物羟基甲硝唑，二甲硝咪唑及其代谢物羟基二甲硝咪唑残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本标准适用手进出口饲料中甲硝唑和二甲硝咪唑、备离血清和尿液中甲硝唑及其代谢物羟基甲硝唑，二甲硝咪唑及其代谢物羟基二甲硝咪唑残留量的测定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法原理
样品用乙酸乙酯提取，氮气吹干后经盐酸溶液溶解，经混合型阳离子交换柱净化后，液相色谱-质谱/质谱法测定，内标法定量。
4试剂和材料
除特别规定外，所有试剂均为分析纯；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1
乙酯乙酯：色谱纯。
乙腊：色谱纯。
3无水硫酸镁。
4.4盐酸：36%~38%。
甲醇：色谱纯。
氨水：25%28%。
甲酸：色谱纯。
混合型阳离子交换柱：60mg/3mL。4.90.1mol/L盐酸：移取5mL盐酸（4.4）和595mL水混合。洗脱溶液：5mL氨水（4.6）和95mL甲醇（4.5）混合。4.10
4.110.1%的甲酸水：1mL甲酸（4.7）和999mL水混合。4.12定容液：取80mL0.1%的甲酸水（4.11)，与20mL乙腈混匀。标准品：甲硝唑（Metronidazole，CH，N.Oa，CAS：443-48-1），纯度99.0%：羟基甲硝唑4.13
（HydroxyMetronidazole，CgH,N,O4，CAS：4812-40-2)，纯度≥99.o%：二甲硝咪唑（Dimetridazole，C,H,N,O，CASNo.551-92-8），纯度≥99.0%；羟基二甲硝咪唑（HydroxyDimetridazole，CH,N.Os，CASNo.936-05-0），纯度≥99.0%；氛代二甲硝咪唑（Dimetridazole-D3，CsH,D,NOz，CASNo.646781
SN/T4809--2017
69-9），纯度≥99.0%；氛代羟基二甲硝咪唑（HydroxyDimetridazole-D3，CHD,NOs，CASNo1015855-78-3），纯度≥99.0%。4.14标准储备溶液：准确称取每种标准品（4.13）0.01g于100mL容量瓶，先用少量甲醇溶解，再用甲醇定容至刻度，混匀，配制成终浓度为100μg/mL的标准储备溶液，在0℃～4℃冰箱中保存，有效期6个月。
4.15标准中间溶液：准确移取每种标准储备溶液（4.14）1mL于100mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，配制成浓度1.0μg/mL的标准溶液；移取1mL1.0ug/mL的标准溶液于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成终浓度均为100ng/mL的标准中间溶液。于0℃~4℃冰箱中保存，有效期3个月。
4.16氛代内标工作溶液：准确移取氛代二甲硝咪唑和氛代羟基二甲硝咪唑标准储备溶液（4.14）1mL于100mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，混匀，配制成浓度1.0μg/mL的标准溶液：移取1mL1.0μg/mL的标准溶液于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成终浓度均为100ng/mL的内标工作溶液。于0℃～4℃冰箱中保存，有效期3个月。4.17标准工作溶液：根据需要分别取适量标准中间溶液（4.15），用水稀释成0.25ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL的混合标准工作溶液，现用现配。5
仪器和设备
5.1液相色谱质谱/质谱联用仪：配电喷雾离子源（ESI+）。5.2分析天平：感量分别为0.01mg和0.01g。5.3高速组织捣碎机。
离心机：10000r/min。
5.5涡旋混合器。
聚丙烯离心管：50mL。
微孔滤膜：0.22μm滤膜。
6样品制备与保存
从采集样品中取出有代表性样品，饲料样品经高速组织捣碎机均匀揭碎或混匀，用四分法缩分出适量试样：血液样品待血液凝固后分离出血清；尿液样品直接混匀。各均分为2份，装人干净无污染的密封袋或样品瓶中，做出标记，手一18℃C冷冻保存。7测定步骤
7.1提取
7.1.1尿液
准确量取4mL样品，置于50mL聚丙烯离心管（5.6）中，加人4mL水，再加人内标工作溶液（4.16)40μL，混匀后加人15mL乙酸乙酯涡混均匀，10000x/min离心10min，将上清液转人另一50mL聚丙烯离心管，残渣再次用15mL乙酸乙酯涡混重复提取，合并提取液，氮气吹干，加人0.1mol/L盐酸（4.9)25mL，涡混均匀，待净化。7.1.2血清
准确量取2mL样品，置于50mL聚丙烯离心管（5.6）中，加人内标工作溶液（4.16）40μL，混后2
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加人乙腈2mL，涡混均匀，加人15mL乙酸乙酯，2.0g无水硫酸镁，涡混均匀，10000r/min离心10min，将上清液转人另一50mL聚丙烯离心管，残渣再次用15mL乙酸乙酯涡混重复提取，合并提取液，氮气吹干，加入0.1mol/L盐酸（4.9）25mL，涡混均匀，待净化。7.1.3饲料
称取5.0g（预混合饲料2.0g，精确到0.01g）样品，置于50mL聚丙烯离心管（5.6）中，加入内标工作溶液（4,16）100μL（预混合饲料加40μL），静置15min后，加人15mL乙酸乙酯均质提取2min，10000r/min离心10min，将上清液转人50mL聚丙烯离心管，残渣再次用15mL乙酸乙酯涡混重复提取，合并提取液，氮气吹干，加入0.1mol/L盐酸（4.9）25mL，涡混均匀，用滤纸过滤，待净化7.2净化
混合型阳离子交换柱（4.8）依次用3mL甲醇、3ml0.1mol/l盐酸活化平衡，将上述提取液过柱，自然重力下流出，依次用5mL0.1mol/L盐酸，5mL甲醇淋洗，最后用5mL洗脱溶液（4.10）洗脱并收集，洗脱液在40℃水浴上用氮气吹干，用1mL定容液（4.12）涡旋溶解，过0.22μm滤膜（5.7），供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
3测定
液相色谱质谱条件
液相色谱条件如下：
a）色谱柱：Cis柱，100mmX3.0mm（内径），粒度1.8μm或性能相当者；b)
柱温：40℃：
流动相：A：0.1%甲酸水溶液，B：乙睛；流速：0.4mL/min；梯度洗脱条件见附录A中表A.1；d
进样量：20pL；
质谱参数条件：见附录A中A.2。e）
7.3.2定性标准
被测组分选择1个母离子，2个子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内·且样品谱图中被测组分监测离子的相对丰度与浓度接近的标准工作溶液谱图中对应的监测离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表1规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。
表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度
允许的最大偏差
7.3.3定量测定
20%~50%
10%~20%
≤10%
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作溶液一起进行色谱分析。用标准工作曲线按内标法定量，标准工作溶液和待测溶液中待测物的响应值在仪器线性响应范围内。在上述色谱条件下甲硝唑、羟基甲硝唑、二甲硝咪唑及羟基二甲硝咪唑的保留时间见表A.2，标准溶液和空白基质的多反应监测（MRM)色谱图参见附录B。3
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7.4空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。8结果计算与表述
采用内标法定量，按式（1)计算甲硝唑、羟基甲硝唑、二甲硝咪唑及羟基二甲硝咪唑残留量，结果保留3位有效数字。
A×AV1000
X=C××
式中：
样品中待测组分残留量，单位为微克每千克或微升每升（μg/kg或者μL/L）；标准工作溶液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）：-样品中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；A
-样品中待测组分的峰面积；
标准工作溶液中内标物的峰面积；样品定容体积，单位为毫升（mL）；标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；样品溶液中内标物的峰面积；
标准工作溶液中待测组分的峰面积；样品称样量或移取量，单位为克或毫升（g或mL）)。mWww.bzxZ.net
9方法性能指标
9.1测定低限
本方法对饲料中甲硝唑残留量测定低限为1.00μg/kg，二甲硝咪唑残留量测定低限为0.50μg/kg；动物尿液中甲硝唑、羟基甲硝唑、二甲硝咪唑及羟基二甲硝咪唑残留的测定低限均为0.50g/kg：动物血清中甲硝唑、羟基甲硝唑、二甲硝咪唑及羟基二甲硝咪唑残留的测定低限均为1.00 μg/kg。9.2
回收率
本方法的不同水平添加浓度和回收率范围参见附录C。精密度
本方法的精密度的实验数据参见附录D4
梯度洗脱条件
见表A.1。
梯度时间
质谱/质谱仪参数
质谱/质谱仪参数如下：
离子源ESI，正离子；
雾化器：氮气；
气体流速：10L/min；
附录A
（规范性附录）
液相色谱-质谱/质谱仪参数\
mL/min
雾化气压力：275.8kPa（40psi)；干燥气温度：350℃；
毛细管电压：4000V；
电子倍增器电压：400V；
扫描方式：正离子扫描；
梯度洗脱条件
流动相A
检测方式：多反应监测（MRM）参数见表A.2。SN/T4809—2017
流动相B
非商业性声明：附录A所列参数是在AgilentHPLC-MS/MS（1290-6460）质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。5
SN/T4809—2017
化合物
二甲硝咪唑
羟基二甲硝咪唑
甲硝唑
羟基甲硝唑
氛代二甲硝
氛代羟基二
甲硝咪唑
母离子
子离子
反应监测参数表
保留时间
毛细管电压
碰撞能量
内标化合物
氛代二甲硝咪唑
尔代羟基二
甲硝咪唑
氛代羟基二
甲硝咪唑
氛代羟基二
甲硝咪唑
注：带*的离子为定量离子：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳6
（资料性附录）
标准品和空白基质多重反应监测（MRM）色谱图[email protected](142.0000->81.000)WorklistData-5.d二甲硝咪唑(142.0/81.0)
[email protected](142.0000>96.000WorklsData-5.d二甲硝咪唑(142.0/96.0)
[email protected](145.0000->99.000)WorklistData-5.d氧代二甲硝咪唑（145.0/99.0)）SN/T4809—2017
[email protected](158.000>55.10)WorkisiDat-6.d羟基二甲硝咪唑(158.0/55.1)
XMRMFg90.0VC000F=00000(8.000>1900Wokisd-5整基二甲硝腺唑(158.0/139.9)
[email protected](161.0000->142.9000)WorklistData-5.d尔代羟基二甲硝咪唑(161.0/142.9)[email protected](172.0000-82.0000)WorklistData-5.dX102
甲硝唑（172.0/82.0)
XESMRMFrg700VCF.00F000C0072.000>128.000) WorkistD-5d甲硝唑（172.0/128.0）
[email protected](188.000->123.000)Workistdat-5.d羟基甲硝唑(188.0/123.0)
X10+ESIMMFrag75.0VCF=0.00DF=0.000CI14.0(188.000->126.000)WorkisiData-5.d羟基甲硝唑(188.0/126.0)
0.20.40.60.811.21.41.61822.22.42.62.833.23.43.63.844.24.44.64.855.25.45.65.8Counts(%)vs.AcquisitionTime(min)图B.1
甲硝唑和二甲硝咪唑及代谢物的液相色谱-质谱/质谱提取离子色谱图（1.0μg/L）SN/T4809—2017
[email protected](142.0000->81.000)WorklistData-18.d二甲硝味唑(142.0/81.0）
[email protected](142.0000->96.000)WorklistData-18.d102
二甲硝味唑(142.0/96.0)
[email protected](45.000->9.000Workisdatl-18.d尔代二甲硝咪唑(145.0/99.0)
[email protected](158.0000>55.1000)WorklistData-18.dX102
羟基二甲硝咪唑(158.0/55.1)
[email protected](158.0000->139.9000)WorklistData-18.d羟基二甲硝咪唑(158.0/139.9)
SMFrg=90.0VCF000.00 C00 (000>142900 WorkistDat-1.d狐代羟基二甲硝咪唑(161.0/142.9)[email protected](172.0000->82.000)WorkistDat-18.d甲硝唑(172.0/82.0)
M00000000000001000 orlia-
甲硝唑(172.0/128.0)
[email protected](188.0000->123.000.0)WorklistData-18.d羟基甲硝唑(188.0/123.0)
[email protected](188.0000->126.0000)WorklistData-18.d羟基甲硝唑(188.0/126.0)
0.20.40.60.811.21.41.61.822.22.42.62.833.23.43.63.844.24.44.64.855.25.45.65.8Counts(%)vs.AcquisitionTime(min)图B.2
甲硝唑和二甲硝咪唑及代谢物空白基质（猪血清）的液相色谱-质谱/质谱提取离子色谱图样品
鸡全价料
鸡浓缩料
鸡预混料
牛全价料
化合物
附录C
（资料性附录）
回收率
SN/T4809—2017
甲硝唑和二甲硝咪唑及代谢物在不同饲料基质中的添加水平及回收率范围添加浓度
μg/kg
甲硝唑
二甲硝
甲硝唑
二甲硝
甲硝唑
二甲硝
甲硝唑
二甲硝
二甲硝
牛浓缩料
回收率范围
85.4~110.5
84.3111.4
90.2~113.1
91.0~109.6
90.7~108.5
89.9~112.3
91.3~114.7
88.2~116.3
91.3~113.9
90.2~109.6
91.3~109.3
80.5~112.3
83.9~110.6
90.9~111.4
80.5~110.4
84.3~108.0
81.4~102.9
90.5~114.4
90.4~110.5
87.8~113.3
91.4~109.4
88.8~111.0
90.1~109.6
91.0~109.2
90.8~109.3
91.4~108.7
牛浓缩料
牛预混料
猪全价料
猪浓缩料
猪预混料
化合物
甲硝唑
甲硝唑
二甲硝
甲硝唑
二甲硝
甲硝唑
二甲硝
甲硝唑
三甲硝
添加浓度
回收率范围
82.5~109.2
82.5~112.5
90.9~113.8
84.7~114.3
84.3~107.0
91.1~113.3
81.8~112.4
85.1~108.7
80.7~101.7
90.9~114.5
87.3111.9
81.5~113.5
90.0~109.6
90.4~111.4
90.9~110.0
81.1~111.1
84.8~111.2
91.9~113.6
91.4~106.4
90.7~108.2
90.6~109.8
87.3~113.6
88.8~112.2
91.4~113.5
82.4~110.8
84.4~110.4
81.4~103.5
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