SN/T 4849.2-2017.Identification of the ingredients of common small berry fruits in food and juice for export- Real-time PCR method-Part 2: Raspberry.
1范围
SN/T 4849.2规定了出口食品及饮料中树莓成分的检测方法实时荧光PCR法。
SN/T 4849.2适用于鲜果冷冻果、蜜饯、鲜榨果汁、果肉型果汁、混浊汁、果干、果酱、及其他以树莓为原辅料的食品及饮料中树莓成分的定性检测(清汁及果酒除外)，包括红树莓、黄树莓、黑树莓。此部分所规定方法的红树莓最低检出限(LOD)为1%(体积比)，黄树莓和黑树莓的最低检出限(LOD)为0.1%(体积比)。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403- 2008 实验室 质量控制规范食 品分子生物学检测
GB/T 27657- 2011 树莓
3术语和定义、缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1小浆果small berry fruits
浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果,由一个或几个心皮形成。小浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果。
3.1.2树莓raspberry
根据GB/T 27657- -2011 描述,树莓是蔷薇科悬钩子属植物的果实,聚合果,形状有圆头形、圆锥形和半球形等，根据颜色分为红树莓(Rubus idaeus)、黄树莓(Rubus xamhocar pus)、黑树莓(Rubus occi-dentalis)、紫树莓(Rubus neglectus)4个种群。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4849.2-2017
出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法
第2部分：树莓
Identification of the ingredients of common small berry fruitsinfood andjuicefor export-Real-timePCRmethod-Part 2:Raspberry
2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T4849.2-2017
SN/T4849出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法》系列标准共分为6部分：
一第1部分：蓝莓；
第2部分：树莓；
—第3部分：黑加仑；
第4部分：桑葚；
第5部分：蔓越莓和蓝莓；
第6部分：猕猴桃。
本部分为SN/T4849的第2部分。
本部分按照GB/T1.1-—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院本部分主要起草人：吴亚君、陈颖、杨艳歌、邓婷婷、黄文胜、刘鸣畅、王斌、张九凯、韩建勋。I
1范围
出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法
第2部分：树莓
SN/T4849.2-—2017
SN/T4849的本部分规定了出口食品及饮料中树莓成分的检测方法实时荧光PCR法。本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜钱、鲜榨果汁、果肉型果汁、混浊汁、果干、果酱、及其他以树莓为原辅料的食品及饮料中树莓成分的定性检测（清汁及果酒除外）·包括红树莓、黄树莓、黑树莓。此部分所规定方法的红树莓最低检出限（LOD）为1%（体积比），黄树莓和黑树的最低检出限（LOD）为0.1%（体积比）。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T27657-2011树莓
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
小浆果smallberryfruits
浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成。小浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果。3.1.2
树莓raspberry
根据GB/T27657—2011描述，树莓是蓄薇科悬钩子属植物的果实，聚合果，形状有圆头形、圆锥形和半球形等，根据颜色分为红树莓（Rubusidaeus）、黄树莓（Rubuszamhocarpus）、黑树莓（Rubusoccidentalis）、紫树莓（Rubusneglectus）4个种群。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数1
SN/T4849.2-2017
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）UNG：尿嘧啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase）CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷Tris（Hydroxymethyl)aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid)Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus）OD：光度密度（opticaldensity）4方法提要
果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA，果干、果酱、蜜饯先用蒸馏水清洗再提取DNA。以树莓果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。使用特异性引物探针进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在树莓成分。5试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
5.1检测用引物和探针：树莓成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1.树莓引物扩增的靶标序列参见附录A。表1树莓序列引物探针bZxz.net
物种名称
内参照
引物/探针序列（5'-+3'）
F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACARAGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA
P.FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1F.GTTATTCGTTGGAACCGTAGGAA
R:GACTGAAAAAACTGCATTTGTGA
P：FAM-ATTATCCAAATTGTTAACCCCGTCCATAAACCT-TAMAR
2三氯甲烷（氯仿）。
3异丙醇。
扩增片
段长度
靶基因
NADH dehydrogenase
subunit B(ndhB)gene
NADH dehydrogenase
(ndhF)gene
5.4CTAB提取缓冲液：20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl.0.02mol/LNazEDTA,pH8.0。
5.5CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。5.670%乙醇（体积分数）。
5.7NaCl溶液(1.2mol/L)。
5.8蛋白酶K（20mg/mL）。
SN/T4849.2-2017
5.9实时荧光PCR反应混合液：12.5L反应体系包括：1U~2U（Unit.酶学单位）的Tag酶、1×PCRbuffer、2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg+、0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的d（A,C,G）TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料。10XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/LKCl,15mmol/LMgClz。5.10
仪器设备
实时荧光PCR仪。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3
恒温水浴锅。
离心机：离心力≥12000g。
微量移液器：0.5~10μ10gL100，20μ~200μ，200μL~1000μ6.5
6.6粉碎装置。
6.7涡旋振荡器。
6.8pH计。
量筒：容量50mL。
烘箱。
检测步骤
7.1样品前处理
鲜果、冷冻果样品直接粉碎，6000r/min离心，取沉淀物部分。果干、果酱、蜜钱类样品先用蒸馏水浸泡清洗3次，再粉碎果汁样品取适量15000r/min离心30min，取沉淀部分。7.2
DNA提取
取50mg~500mg样品，加人1mLCTAB提取缓冲液，同时加人0.01倍体积的20mg/mL蛋白酶K，65℃温育1h2h，期间不时振荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加人适量CTAB提取缓冲液：取出后12000r/min离心10min，转移上清至2mL离心管中，加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈振荡混勾，12000r/min转速下离心10min转移上清至另一灭菌的离心管中，再加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈振荡混匀，室温下12000r/min离心10min；转移上清至干净离心管中，加入等体积的CTAB沉淀液混勾，室温沉淀1h；13000r/min的转速离心10min；弃上清，加入350μL1.2mol/LNaCl浴液，充分溶解沉淀；加入0.8倍体积的异内醇或2倍体积一20℃冰箱中预冷的无水乙醇混勾，一20℃放置30min，12000r/min4℃离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。加人50μL~100L双蒸水，室温10min，混匀，一20℃保存。
上述模板DNA均可用等效DNA提取试剂盒提取7.3DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按照式（1）计算：
SN/T4849.2-2017
C=AXNX50/1000
DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）；260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数。
当A26/A2o比值在1.72.0之间时，适宜于PCR扩增。实时荧光PCR扩增
7.4.1每个试样PCR反应设置3个重复7.4.2实时荧光PCR反应体系见表2。表2实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应混合液
正向引物（10μmol/L）
反向引物（10μmol/L）
探针（10μmol/L）
DNA模板（5ng/μL~100ng/μL）灭菌ddHO
·（1）
7.4.3实时荧光PCR反应程序按如下条件进行。内参和树莓ndhF基因均为：50℃2min95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。7.5对照反应
7.5.1所有试样均应同时设置平行的内参照检测与树莓特异性检测，各体系中除引物探针外，其余组分及反应条件均与7.4一致。
7.5.2在试样PCR反应的同时.应设置阴性对照、阳性对照和空白对照，各对照反应体系中，除模板外，其余组分及反应条件应与7.4一致。质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0。a)
阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0。阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0。结果判断与表述
结果判定
在符合第8章的情况下，结果判定如下：Ct值≤35，则判定为阳性。
35光信号判定结果；Ct值≥40，则判定为阴性c）Ct值≥40，则判定为阴性。
结果表述
内参照阴性，目标成分阴性，表述为“未提取到植物DNA组分”。9.2.2内参照阳性，目标成分阳性，表述为“检出树莓成分”。内参照阳性，目标成分阴性，表述为“未检出树莓成分”。9.2.3
检测过程中防止交叉污染的措施SN/T4849.2—2017
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403~2008中附录D的规定执行。5
SN/T4849.2-—2017
附录A
（资料性附录）
树莓ndhF基因扩增靶标参考序列（GeneBank：U95233.1）树莓ndhF基因扩增靶标参考序列（GeneBank：U95233.1）为GTTATTCGTTGGAACCGTAGGAATTCCTTTCTTCAATCAGGAAGGAATAGATTTAGATATATTATCCAAATTGTTAACCCCGTCCATAAACCTTTTACATCAAAATCGAACCCACCCTGTCGATTGGTATGAATTTATCACAAATGCAGTTTTTTCAGTC。6
SN/T4849.2-2017
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法
第2部分：树莓
SN/T4849.2—-2017
中国标准出版社出版
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张0.75字数14千字2018年6月第一版2018年6月第一次印刷印数1-500
书号：155066·2-33295定价16.00元
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