SN/T 4877.7-2017.DNA barcoding screening method- Part 7 :Quarantine Verticillium.
1范围
SN/T 4877.7规定了棉花黄萎病菌和苜蓿黄萎病菌DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。
SN/T 4877.7适用于检疫性轮枝菌的DNA条形码筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 28084棉花 黄萎病菌检疫检测与鉴定
SN/T 1145苜 蓿黄萎病检疫鉴定方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码DNA barcode
生物体内能够代表该物种的,标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。
3.2内部转录间隔区序列internal transcribed spacer;ITS
在真核生物中，核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成,其基因组序列从5'到3’依次为:外部转录间隔区、18 S基因、内部转录间隔区1(ITS1)、5.8 S基因、内部转录间隔区2(ITS2)、28 S基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于18 S rDNA、5.8 S rDNA和28 S rDNA之间的区域,ITS1和1ITS2作为非编码区.受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守,而在真菌种间存在极大的变化,表现出极大的序列多态性，能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状。
4检疫性轮枝菌基本信息
学名:Verticillium dahliae Kleb
中文名:棉花黄萎病菌
学名:Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold
中文名:苜蓿黄萎病菌

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4877.7—2017
基因条形码筛查方法
第7部分：检疫性轮枝菌
DNA barcoding screening methodPart 7:QuarantineVerticillium2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌；
第3部分：检疫性植原体；
一第4部分：检疫性茎点霉；
第5部分：检疫性拟茎点霉；
第6部分：检疫性嗜酸菌；
一第7部分：检疫性轮枝菌；
一第8部分：检疫性炭疽菌；
第9部分：检疫性腥黑粉菌；
第10部分：检疫性疫霉。
本部分为SN/T4877的第7部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T4877.7—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院本部分起草人：高瑞芳、章桂明、汪莹、程颖慧、王颖、卢小雨、向才玉、潘广。1
1范围
基因条形码筛查方法
第7部分：检疫性轮枝菌
SN/T4877.7-2017
SN/T4877的本部分规定了棉花黄萎病菌和首黄萎病菌DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等
本部分适用于检疫性轮枝菌的DNA条形码筛查2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T28084棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定SN/T1145bzxZ.net
首猪黄萎病检疫鉴定方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNA条形码DNAbarcode
生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.2
内部转录间隔区序列internaltranscribedspacerITs在真核生物中，核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成，其基因组序列从5到3依次为：外部转录间隔区、18S基因、内部转录间隔区1（ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2（ITS2）、28S基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于18SrDNA,5.8SrDNA和28SrDNA之间的区域，ITS1和ITS2作为非编码区，受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状。4检疫性轮枝菌基本信息
学名：VerticilliumdahliaeKleb中文名：棉花黄萎病菌
学名：Verticilliumalbo-atrumReinkeetBerthold中文名：首猪黄菱病菌
分类地位：真菌界（Fungi），丝孢纲（Hyphomycetes），丝孢目（Hyphomycetales），淡色孢科（Moniliaceae），轮枝孢属（Verticillium）寄主范围参见附录A。
5方法原理
使用ITS片段作为棉花黄萎病菌和首着黄萎病菌的DNA条形码基因，通过对检测对象的DNA进SN/T4877.7—2017
行PCR扩增及产物测序后，利用DNA条形码数据库生物条形码数据（BOLD）或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库比对，根据序列相似度筛查物种。仪器设备和试剂
6.1仪器设备
超净工作台、高压灭菌锅、4℃冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统。
6.2试剂
CTAB提取液、三氯甲烷、乙醇、PCRTaqDNA聚合酶、PCRTaq缓冲液、dNTP、DNA标记物、无菌超纯水。
7筛查鉴定方法
7.1DNA提取与纯化
对真菌进行液体培养或平板培养，CTAB法对基因组DNA的提取方法详见附录B，测定DNA浓度及纯度后，保存于20℃冰箱备用。7.2DNA条形码片段PCR扩增
利用通用引物进行ITS片段序列扩增（具体步骤参见附录C），测序。7.3序列分析
测序结果利用BioEdit等生物信息学软件进行剪接编辑，比对峰图和正反向测序结果是否有误，去掉两端引物部分序列，然后在BOLD数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中比对分析。8结果判定
ITS序列长度SOObp左右，在生物条形码数据库BOLD和中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对，若与DNA条码数据库中检疫性轮枝菌序列相似度大于99%时，即可以筛查判定是该物种。棉花黄萎病菌和首著黄萎病菌DNA条形码参考序列参见附录D若判定为目标检疫性轮枝菌，应结合GB/T28084和SN/T1145进行最终鉴定。9样品保存
9.1样品保存
分离得到的菌种转移到马铃薯葡萄糖斜面培养基上，置于4℃黑暗条件下保存至少12个月，以备复验、谈判和仲裁。
9.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。2
附录A
（资料性附录）
首 黄萎病菌和棉花黄菱病菌寄主范围SN/T4877.7-2017
首黄萎病菌（Verticilliumalbo-atrumReinkeetBerthold）的主要寄主有首、蚕豆、马铃薯、草莓、冠状岩黄芪、红花菜豆等。棉花黄萎病菌（VerticilliumdahliaeKleb）的主要寄主有棉花、向日葵、茄子、辣椒、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等。3
SN/T4877.7--2017
B.1DNA制备
附录B
（规范性附录）
基因组DNA制备
实验器血于121℃、30min湿热灭菌或180℃干热灭菌1h。从培养基上，刮取100mg左右的菌丝体至研钵内，加人液氮充分研磨，加人4mL预热的CTAB抽提液。
将离心管放人水浴锅前先振荡1min然后放人65℃水浴锅水浴15min，每隔3min~5min振荡1次。
加三氯甲烷4mL，用移液器混匀1min，水浴10min；4℃，12000g离心15min，取上清液加等体积异丙醇，轻轻摇匀，然后一20℃静置15min。4℃，12000g离心15min，小心去除上清液，留沉淀；加70%预冷酒精，洗涤3次，放于通风处干燥；加人50μL～100μL灭菌的去离子水溶解DNA。B.2
DNA浓度及纯度测定
用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度.分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD250/ODz
DNA浓度=50×ODzsoμg/ml
PCR级DNA溶液的OD2/OD28o比值为1.7～1.9。4
C.1.1引物序列
附录C
（资料性附录）
ITS片段扩增流程
ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGO
ITS5.GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
2扩增体系及条件
扩增反应的组成成分为：
10XPCR缓冲液
2.5mmol/LdNTPS
前向引物（10μmol/L）
后向引物（10μmol/L）
5U/μLTaq酶
模板DNA
补无菌水至
......
.... l μl.
......
SN/T4877.7—-2017
反应用双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有轮枝菌的DNA作为模板，每个样品重复2次。ITS扩增反应程序为：95℃预热5min，进人循环反应：95℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸90s，共循环35次，循环后72℃延伸10min。2测序与序列处理
扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离·目的片段长度为480bp~500bp，经DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，采用核酸蛋白分析仪对DNA进行定量检测。测序引物与PCR扩增引物相同，进行Sanger测序。
SN/T4877.7—2017
附录D
（资料性附录）
首黄萎病菌和棉花黄萎病菌ITS片段参考序列D.1首黄菱病菌（Verticilliumalbo-atrumReinkeetBerthold）482bpCCTGATCCGAGGTCaACCGTTGCCGCACGAGGCGGGCTTGTAGGGGGTTTAGAGGCAAGTGCCTGCGGGACTCCGATGCGAGCTGTAATTACTACGCAAGGAAGGGCCACGCGGGTCCGCCACTGCTTTTAAGGGCCTACAGACGTAGATCCCCAACACCGGGCCACTGGGGCTCGAGGGTTGAAACGACGCTCGGACAGGCATGCCTCCCAGGATACTGGAAGGCGCCATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACATATCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCTAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTTTAATAGTTCGCTAAGAACACTCAGAAGTATCGTTGGTATGAATAAAGAGACTGATGTACCGGCGGGCTCGCAGAACGAGCCGCCGAAGCAACAATATGGTTCACAAAGGGTTATGAGTAGATACTCGGTAATGaTCCCTCC/D.2棉花黄萎病菌（VerticilliumdahliaeKleb)500bpCGGGTATTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCGTTGCCGCACGAGGCGGGCTTGTAGGGGGTTTAGAGGCAAGCGCCTGCGGGACTCCGATGCGAGCTGTAACTACTACGCAAGGAAGGGCCACGCGGGTCCGCCACTGCTTTTAAGGGCCTACAGACGTAGATCCCCAACACCGGGCCACTGGGGCTCGAGGGTTGAAACGACGCTCGGACAGGCATGCCTCCCAGGATACTGGAAGGCGCCATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACATATCGCGTTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCTAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTTTAATAGTTCGCTAAGAACACTCAGAAGTATCGTTGGTATAAACAGAGAGACTGATGGACCGGCGGGCTCGCAGAACGAGCCGCCGAAGCAACAATATGGTTCACAAAGGGTTATGAGTAGATACTCGGTAATGATCCCTCCGCtGGT/
参考文献
SN/T4877.7—2017
[1] Barbara, Clewes(2003)Plant pathogenic Verticillium species:how many of them are there?MolecularPlantPathology.theIntemet.2003-01-ol.[2] Seifert(20o9)Progress towards DNA barcoding of fungi.Molecular Ecology Resources. theInternet.20o9-o1-o1.
[3］段维军，张慧丽，郭立新，等.ITS片段作为轮枝菌DNA条形码的评价研究.植物保护，2013，39(4):72-77.
SN/T4877.7-2017
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
基因条形码筛查方法
第7部分：检疫性轮枝菌
SN/T4877.7—2017
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张0.75字数16千字2018年5月第一版
2018年5月第一次印刷
印数1-500
书号：155066·2-32854定价16.00元18/
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