SN/T 4881-2017
基本信息
标准号： SN/T 4881-2017
中文名称：鸡球虫病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4881-2017.Quarantine protocol for chicken coccidiosis.
1范围
SN/T 4881规定了鸡球虫病的粪便检查、组织检查、聚合酶链式反应(PCR)的操作规程。
SN/T 4881适用于鸡球虫病的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3病原
鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内所引起的一-种寄生性原虫病。简介参见附录A.
4设备、材料和试剂
4.1设备
电炉、显微镜、天平、离心机、移液器、冰箱(4℃、- 20 ℃)、水浴锅(或金属浴)、PCR仪、凝胶成像
系统。
4.2材料
铜丝筛(60目)、尼龙筛(60目)、量筒、烧杯、接种环、研钵、平皿、吸管、载玻片、盖玻片、麦氏虫卵计数板。
4.3试剂
4.3.1实验室用水
应符合GB/T 6682的规定。
4.3.2饱和盐水
称取400gNaCl,放人烧杯中,加人1 000 mL水,加热搅拌至全部溶解后,静置冷却,有少量盐析出，即为饱和盐水。
4.3.3磷酸盐缓冲液
将下列试剂依次加入到1 000 mL烧杯中:
氯化钠 8.00 g
氯化钾 0.20 g
磷酸氢二钠 1.44 g
磷酸二氢钾 0.24 g
蒸馏水 至1000mL
充分搅匀,调pH值至7.4,并定容至1 000 mL。103.41 kPa压力下蒸气灭菌20 min,室温保存待用。
4.3.4 2.5%重铬酸钾溶液
称取5g重铬酸钾固体,溶于200 mL水中,搅拌至重铬酸钾完全溶解。
4.3.5 DNA 提取试剂或成品试剂盒
裂解缓冲液、0.5 mol/L EDTA、蛋白酶K溶液、核糖核酸酶溶液。
1范围
SN/T 4881规定了鸡球虫病的粪便检查、组织检查、聚合酶链式反应(PCR)的操作规程。
SN/T 4881适用于鸡球虫病的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3病原
鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内所引起的一-种寄生性原虫病。简介参见附录A.
4设备、材料和试剂
4.1设备
电炉、显微镜、天平、离心机、移液器、冰箱(4℃、- 20 ℃)、水浴锅(或金属浴)、PCR仪、凝胶成像
系统。
4.2材料
铜丝筛(60目)、尼龙筛(60目)、量筒、烧杯、接种环、研钵、平皿、吸管、载玻片、盖玻片、麦氏虫卵计数板。
4.3试剂
4.3.1实验室用水
应符合GB/T 6682的规定。
4.3.2饱和盐水
称取400gNaCl,放人烧杯中,加人1 000 mL水,加热搅拌至全部溶解后,静置冷却,有少量盐析出，即为饱和盐水。
4.3.3磷酸盐缓冲液
将下列试剂依次加入到1 000 mL烧杯中:
氯化钠 8.00 g
氯化钾 0.20 g
磷酸氢二钠 1.44 g
磷酸二氢钾 0.24 g
蒸馏水 至1000mL
充分搅匀,调pH值至7.4,并定容至1 000 mL。103.41 kPa压力下蒸气灭菌20 min,室温保存待用。
4.3.4 2.5%重铬酸钾溶液
称取5g重铬酸钾固体,溶于200 mL水中,搅拌至重铬酸钾完全溶解。
4.3.5 DNA 提取试剂或成品试剂盒
裂解缓冲液、0.5 mol/L EDTA、蛋白酶K溶液、核糖核酸酶溶液。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4881—2017
鸡球虫病检疫技术规范
Quarantineprotocolforchickencoccidiosis2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T48812017
本标准起草单位：中华人民共和国江西出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国中山出入境检验检疫局、中华人民共和国无锡出入境检验检疫局。本标准主要起草人：杨春华、蔡先全、童明龙、孙思扬、孙洁、罗秋红、张强、祝建新、李仕祥、夏彪。1范围
鸡球虫病检疫技术规范
SN/T4881-—2017
本标准规定了鸡球虫病的粪便检查、组织检查、聚合酶链式反应（PCR）的操作规程。本标准适用于鸡球虫病的检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3病原
鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内所引起的一种寄生性原虫病。简介参见附录A。
4设备、材料和试剂
4.1设备
电炉、显微镜、天平、离心机、移液器、冰箱（4℃、一20℃）、水浴锅（或金属浴）、PCR仪、凝胶成像系统。
4.2材料
铜丝筛（60目）、尼龙筛（60目）、量筒、烧杯、接种环、研钵、平Ⅲ、吸管、载玻片、盖玻片、麦氏虫卵计数板。
4.3试剂
实验室用水
应符合GB/T6682的规定。
饱和盐水
称取400gNaCl，放人烧杯中，加人1000mL水，加热搅拌至全部溶解后，静置冷却，有少量盐析出，即为饱和盐水。
3磷酸盐缓冲液
将下列试剂依次加入到1000mL烧杯中：氯化钠
氯化钾
磷酸氢二钠
SN/T4881—2017
磷酸二氢钾
蒸馏水
至1000mL
充分搅匀，调pH值至7.4，并定容至1000mL。103.41kPa压力下蒸气灭菌20min，室温保存，待用。
4.3.42.5%重铬酸钾溶液
称取5g重铬酸钾固体，溶于200mL水中，搅拌至重铬酸钾完全溶解。4.3.5
DNA提取试剂或成品试剂盒
裂解缓冲液、0.5mol/LEDTA、蛋白酶K溶液、核糖核酸酶溶液。4.3.6
PCR反应预混液
鸡球虫通用引物1
上游引I物P1：5-ACCTGGTTGATCCTGCCAG-3，下游引物P2:5-CTTCCGCAGGTTCACCTACGG-34.3.8
鸡球虫分型检测引物
鸡球虫分型检测引物见表1。
堆型艾美耳球虫
(E.acervulina)
布氏艾美耳球虫
(E.brunetti)
巨型艾美耳球虫
(E.marima)
和缓艾美耳球虫
(E.mitis)
毒害艾美耳球虫
(E.necatri)
早熟艾美耳球虫
(E.praecor)
柔嫩艾美耳球虫
(E.tenella)
参考文献[2]。
5参考文献[3]。
引物名称
鸡球虫分型检测引物
引物序列5°-+3”
CTGCGAGGGAACGCTTAAT
AACGAACGCAATAACACACG
CTGGGGCTGCAGCGACAGGG
ATCGATGGCCCCATCCCGCAT
TTGTGGGGCATATTGTTGTG
CAATGAGGCACCACATGTCT
GTTTATTTCCTGTCGTCGTCTCGC
GTATGCAAGAGAGAATCGGGATTCC
AGTATGGGCGTGAGCATGGAG
GATCAGTCTCATCATAATTCTCGCG
CATCGGAATGGCTTTTTGAAAGCG
GCATGCGCTAACACCTCCCCTT
CGCTGCTGGTTTTACAGGTT
GCTGAAGCAAAGTTCCAAGC
长度/bp
通用引物为真核生物18SrDNAPCR通用引物，目的片段长度及序列信息参见附录B中B.1，引物序列引自参考文献[]。
电泳试剂
TAE缓冲液、琼脂糖、电泳上样缓冲液、1OOObpDNA分子量标准。5球虫诊断
5.1粪便检查2
5.1.1采样量
采集被检鸡只或鸡群的新鲜粪便不少于200g。5.1.2定性检查
SN/T4881-2017
5.1.2.1取新鲜粪便10g，放人50mL烧杯中，加入30mL~40ml水，搅匀。经60目铜丝网或尼龙网过滤。
5.1.2.2将滤液平均移入4支10mL~15mL试管.2500/min离心10min。5.1.2.3倾去上清液，向各管沉淀物中加入少量饱和盐水，混匀。将各管的沉淀物混悬液移入一个5mL玻璃瓶。
5.1.2.4用饱和盐水加满，盖上盖玻片（盖玻片须能与液面接触），静置10min。5.1.2.5取下盖玻片，将其放在载玻片上。5.1.2.6
置载玻片于显微镜载物台，用10×10或10入40的倍数进行检查5.1.2.7判定
发现球虫卵囊，被检样品判为鸡球虫阳性：a）
b）未发现球虫卵囊，需重复检查5次，仍未见球虫卵囊，被检样品判为鸡球虫阴性3定量检查
对定性检查中呈阳性的粪样，进行定量检查5.1.3.1
5.1.3.2取待检粪样2g，放人50mL烧杯。加入少量水搅匀，经60目铜丝网或尼龙网过滤，并用水冲洗几次滤网。
5.1.3.3滤液经2500r/min离心10min5.1.3.4用少量饱和盐水将沉淀物搅匀，移入100ml.烧杯，加饱和盐水至60mL，充分混匀。用吸管吸取混悬液注满麦氏虫卵计数板，静置5min。5.1.3.5将麦氏虫卵计数板置于显微镜下检查，用10×10或10×40倍，数出每个刻室（1cm×1cm×0.15cm=0.15cm，含100个小方格）内的所有卵囊数，计算出平均值A，对压线的卵囊，按左、上压线计，右、下压线不计处理。
5.1.3.6每克粪便卵囊数（OPG)按式(1)计算：OPG=A+0.15)X60-2=A×200
....（1)
5.1.3.7对卵囊数较多的粪样，可在60mL的基础上，用饱和盐水再稀释B倍后计数，则OPG按式(2)计算：
OPG=A×200XB
处判定标准：
a）严重感染：OPG>10×10%；
2）类便检查参考GB/T18647—2002中的操作方法。..
.（2)
SN/T4881-2017
b）中度感染：10×10≥0PG1x10；轻度感染OPG<1X10
5.2组织检查
对疑似感染或致死鸡进行病理解剖，观察病变情况，主要检查肠道病变。取病变肠道，刮取黏膜、内容物放在载玻片上，滴1滴～2滴磷酸盐缓冲液，加盖玻片，进行显微镜检查，在涂片上发现有虫体（子孢子、滋养体、大小配子体、合子、卵囊），即可判定为鸡球虫阳性。若镜检发现有裂殖体、裂殖子，可初步判定为鸡球虫阳性，需经鸡球虫通用型PCR或分型PCR进一步检测鉴定，并根据其判定标准予以判定。
5.3通用型PCR检测
DNA提取
取200mg待测样品放人1.5mL的离心管中，加人1mL双蒸水，混勾，置离心机中3000r/min离心10min，重复以上操作离心洗涤4次。经离心洗涤后的样品加人200μL双蒸水，再加人与样品体积相同的玻璃珠，漩涡震荡30min，吸取研磨液置另一离心管，加裂解缓冲液、0.5mol/LEDTA、蛋白酶K溶液及核糖核酸酶溶液，混匀后，放于恒温浴锅中，55℃作用16h~18h，其间不时地摇动离心管，使虫体组织裂解充分。
取250uL裂解混合液加入上述水浴后的离心管中，摇匀后置漩锅振荡，将混合液移入过滤柱，13000r/min离心4min，弃去过滤柱下面的液体；加人650μL洗液13000r/min离心2min，重复以上步骤4次，将过滤柱移人1.5mL的离心管，加人30μL无菌水，室温放置2min，13000r/min离心2min，弃去过滤柱，离心管中即为所需DNA，一20℃保存。5.3.2
通用型反应体系
通用型反应体系见表2。
2通用型反应体系
10XPCRbuffer
MgCl,(25.0mmol/L)
dNTPs(10.0mmol/L)
上游引物（50.0μmol/L）
下游引物（50.0μmol/L）
TagDNA聚合酶（5U/μL）
模板DNA
加ddH，0至
通用型反应条件
通用型反应条件如下：
预变性：94℃5min；
体积/uL
扩增循环：94℃30s，50℃1min，72℃2min，35个循环；延伸：72℃10min。
设立对照wwW.bzxz.Net
每次实验均需设立阴性对照、阳性对照。5.3.5
凝胶电泳分析
SN/T4881—2017
制备1%琼脂糖凝胶板，取5μLPCR产物与0.5μL上样缓冲液混匀，加人凝胶板加样孔，同时加Marker、阴性对照和阳性对照。5V/cm电压电泳30min~40min。经凝胶成像系统观察、摄像并保存图像。
结果判定
阳性对照出现目的条带，阴性对照未出现目的条带，实验成立。实验成立的条件下，被检样品出现目的条带，测序结果符合的判为鸡球虫阳性。实验成立的条件下，被检样品未出现目的条带，判为鸡球虫阴性。分型检测
DNA提取
见5.3.1。
分型检测反应体系
分型检测反应体系见表3。
10XPCRbuffer
MgCl(25.0mmol/L)
dNTPs(10.0mmol/L)
上游引物（50.0μmol/L）
下游引物（50.0μmol/L）
TaqDNA聚合酶（5U/μL）
模板DNA
加ddH0至
5.4.3分型检测反应条件
分型检测反应条件见表4。
分型检测反应体系
体积/μ
SN/T4881—2017
柔嫩艾美耳球虫
(E.tenella)
巨型艾美耳球虫
(E.marima)
堆型艾美耳球虫
(E.acervulina)
毒害艾美耳球虫
(E.necatrir)
布氏艾美耳球虫
(E.brunetti)
和缓艾美耳球虫
(E.mitis)
早熟艾美耳球虫
(E.praecor)
对照设立
预变性
944min
分型检测反应条件
94℃45s
每次实验均需设立阴性对照、阳性对照。凝胶电泳分析
见5.3.5。
5.4.6结果判定
55℃30s
55℃30s
55℃30s
58℃30s
58℃30s
58℃30s
58℃30s
5.4.6.1阳性对照出现目的条带，阴性对照未出现目的条带，实验成立。延伸
72℃1min
实验成立的条件下，被检样品出现××种的目的条带，判为鸡球虫×X种阳性。5.4.6.2
实验成立的条件下，被检样品未出现××种目的条带，判为鸡球虫××种阴性。5.4.6.3
循环数
35个循环
72℃延伸
附录A
（资料性附录）
鸡球虫病概述
SN/T48812017
鸡球虫病（ChickenCoccidiosis）是由艾美耳属（Eimeria）多种球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内所引起的一种寄生性原虫病。鸡球虫在分类上属于原生动物门（Protozoa）、顶复器亚门（Apicomlexa）、孢子虫纲（Sporozoasida）、球虫亚纲（Coccidiasina）、真球虫目（Eucoccidiorida）、艾美耳亚目（Eimeriorina）、艾美耳科（Eimeridae）、艾美耳属（Eimeria）。感染鸡的艾美耳球虫有7种：柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）；毒害艾美耳球虫（E.necatria）；堆型艾美耳球虫（E.acervulina）；巨型艾美耳球虫（E.marima）和缓艾美耳球虫（E.mifs）：早熟艾美耳球虫（E.praecor）：布氏艾美耳球虫（E.brunetti）。其中，柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫致病性最强，布氏艾美耳球虫，有明显的致病力，但感染不普遍；堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫的致病力属轻度至中度，在鸡群中普遍存在，其毒力的强弱取决于虫株和缓艾美耳球虫致病力轻微，在自然条件下危害不大；早熟艾美耳球虫基本没有致病力。7
SN/T4881—2017
附录B
（资料性附录）
核酸序列
B.1艾美耳球虫属不同种18SrDNA序列信息艾美耳球虫属不同种18SrDNA序列信息见表B.1。表B.1Genbank艾美耳球虫属不同种18SrDNA序列信息种
堆型艾美耳球虫
(E.acervulina)
布氏艾美耳球虫
(E.brunetti)
巨型艾美耳球虫
(E.matima)
和缓艾美耳球虫
(E.mitis)
毒害艾美耳球虫
(E.necatrir)
早熟艾美耳球虫
(E.praecox)
柔嫩艾美耳球虫
(E. tenella)
登录号
U67115
U67116
U67117
U67118
U67119
U67120
U67121
堆型艾美耳球虫（E.acervulina）（GenBank：AF926384，196bp~498bp）181 ggatgatgtt tgctgctgcg agggaacgct taattgaacc ttatcatcta ccaatctttg24l aatctgtttt gttatcccac cacgacgcat tttgtgaag aaaaaagagg aaaaaacctg30l actgtgcaag catcattgcc accttttgaa gggatgggat gatgatgcat gcatgggaag36l gggagggcgg cgcatgcacc gcttggggct ttttggggct ttggggctgt ggtggtgggg421 cttgcatgct acatgtgacc ctggcacggc tgtctatgat gagcacccat agcgccagcg48l tgtgttattg cgttcgttgc cttgtatttt atattaaaaa aaaacaaaac tttcagcaatB.3布氏艾美耳球虫（E.brunetti）（GenBank：AF026383，212bp~395bp）181 ttggagtttt ctgcatgcgg gactgtgtgg ggctggggct gcagcgacag gggagaaaag8
长度/bp
24latcagtttga gcaaaccttc gaatcaattaacgctttcca acaaagtctttttgaaaatt30l gaagcatgaa aattaaattt gaaattggat ttgatggatc tgaagcgcgc tggaaggagc361 ggaaggaggc gtgcatgcgg gatggggcca tcgatggcca tgcgtgcatg catgcatgag巨型艾美耳球虫（E.maxima）（GenBank：AF065095，198bp~348bp）18l tscaattttg gttgctattg tggggcatat tgttgtgawt cgttygggag tttgctgcga241 ggaarcgctt attacaatca tatatwccca atcattgaat cttttatttc cccacaacgt301 attttgagg gaatwtgagg agcttgggag acatgtggtg cctcattgtg agtggtgwgo和缓艾美耳球虫（E.mitis）（GenBank：AF065093155bp~484bp）121 tcattcacac ataatgcgcg tctcgcgggc tggggtttat ttcctgtcgt cgtctcgctt181 ttgcgattcg tgggaggaag gaagcgtcgg taccgtcggg attggctgct tctgaaccat241 tgttatcaaa tctttgaate catagttatt tctccacgac gttattttta aaaagaaggc301 ttttaaagt tgttttgcct gcatcaac tcgatttgca ggtgtgtggg atgagtatgc361 ttgttggggg gtctgtcggt ggtggggctt tggggctgca tgtgcatgcg tgcatgtggc421 tgcagcccca agctctgcac accacggtgt gttattaccg gaatcccgat tctctcttgc48l atacttttct cactgttttt ttgtttgttt aaagaaaaaa aactttcagc aatggatgtcB.6毒害艾美耳球虫（E.necatrix）（GenBank：AF026385，344bp~503bp）301 aaattaaaag gcattttggt cttgcaaggc atgtgctagt agtagtatgg gcgtgagcat36l ggaggggaag tggtggtgtc atgcgcatgc gtggcttgca tgtgtggggc ttgtcggtgg421 cagccccagg gccagcccca gccccatgac cagccccata gtcgcgatca cgacgaggcg48l cgagaattat gatgagactg atcggggctg ctttttttt tgcagacgtt cgcagctcgaB.7早熟艾美耳球虫（E.praecox）（GenBank：AF065092，154bp~368bp）12l tcattcacacattgcgtctc caagcgattt catcatcggaatggctttttgaaagcgttt181 tgcgatgttg gagtctgcta ggggggagcg ccgacaaacc aacgtaaacc aatccttgaa24l tcgctttgct ttccctccac aacgttcttt tgttattaaa aaagaaatga atgaacttct30l ctttgtatga aagatggatt ttaacgatgg aagatctgtc gcatgcaagg ggaggtgtta361 gcgcatgcgg ggggtggggc tggttggggg ctgcatgcat gcatgcatgc aagtatgcatB.8
柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）（GenBank：AF026388，2311bp~2773bp）2281 atcattcaca caattcgcac gcctggaacg cgctgctggt tttacaggtt tcaagcatto234l gctttgcctg ggtggccagc agcaggtagt cgtcggtgtt gttggaaaga aaaatttagt240l ccatcgcaac ccttgaatct gtttttctct gcaacggttt ttctactttt taaaaattga2461 tggaattttt tgctgctgca aggatatata gcagtagtat gtacgtgggc ggtcggggggSN/T4881—2017
SN/T4881-2017
2521 gtggtggcgc atgcacgggc tcgcgtgggg cctgtcggtg gcagccccag cgcgccggcg2581 cagccccgtg atcgtcgatc gcgcacgtac gtggagggga ttatgagagg agaagacgcg2641 cacggggctg tgtcgtatgc agagcgctcg cggctcgggc gattgttccg tgttgtgtgc2701 tctgctgcat gctggtgtgt gcgttctgte tctttctctc tccgttacat gctgcttgga2761 actttgcttc agcaagaaac ttttgctcac taaggtgaat cgaatcactt ttgttgatga10
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鸡球虫病检疫技术规范
Quarantineprotocolforchickencoccidiosis2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T48812017
本标准起草单位：中华人民共和国江西出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国中山出入境检验检疫局、中华人民共和国无锡出入境检验检疫局。本标准主要起草人：杨春华、蔡先全、童明龙、孙思扬、孙洁、罗秋红、张强、祝建新、李仕祥、夏彪。1范围
鸡球虫病检疫技术规范
SN/T4881-—2017
本标准规定了鸡球虫病的粪便检查、组织检查、聚合酶链式反应（PCR）的操作规程。本标准适用于鸡球虫病的检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3病原
鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内所引起的一种寄生性原虫病。简介参见附录A。
4设备、材料和试剂
4.1设备
电炉、显微镜、天平、离心机、移液器、冰箱（4℃、一20℃）、水浴锅（或金属浴）、PCR仪、凝胶成像系统。
4.2材料
铜丝筛（60目）、尼龙筛（60目）、量筒、烧杯、接种环、研钵、平Ⅲ、吸管、载玻片、盖玻片、麦氏虫卵计数板。
4.3试剂
实验室用水
应符合GB/T6682的规定。
饱和盐水
称取400gNaCl，放人烧杯中，加人1000mL水，加热搅拌至全部溶解后，静置冷却，有少量盐析出，即为饱和盐水。
3磷酸盐缓冲液
将下列试剂依次加入到1000mL烧杯中：氯化钠
氯化钾
磷酸氢二钠
SN/T4881—2017
磷酸二氢钾
蒸馏水
至1000mL
充分搅匀，调pH值至7.4，并定容至1000mL。103.41kPa压力下蒸气灭菌20min，室温保存，待用。
4.3.42.5%重铬酸钾溶液
称取5g重铬酸钾固体，溶于200mL水中，搅拌至重铬酸钾完全溶解。4.3.5
DNA提取试剂或成品试剂盒
裂解缓冲液、0.5mol/LEDTA、蛋白酶K溶液、核糖核酸酶溶液。4.3.6
PCR反应预混液
鸡球虫通用引物1
上游引I物P1：5-ACCTGGTTGATCCTGCCAG-3，下游引物P2:5-CTTCCGCAGGTTCACCTACGG-34.3.8
鸡球虫分型检测引物
鸡球虫分型检测引物见表1。
堆型艾美耳球虫
(E.acervulina)
布氏艾美耳球虫
(E.brunetti)
巨型艾美耳球虫
(E.marima)
和缓艾美耳球虫
(E.mitis)
毒害艾美耳球虫
(E.necatri)
早熟艾美耳球虫
(E.praecor)
柔嫩艾美耳球虫
(E.tenella)
参考文献[2]。
5参考文献[3]。
引物名称
鸡球虫分型检测引物
引物序列5°-+3”
CTGCGAGGGAACGCTTAAT
AACGAACGCAATAACACACG
CTGGGGCTGCAGCGACAGGG
ATCGATGGCCCCATCCCGCAT
TTGTGGGGCATATTGTTGTG
CAATGAGGCACCACATGTCT
GTTTATTTCCTGTCGTCGTCTCGC
GTATGCAAGAGAGAATCGGGATTCC
AGTATGGGCGTGAGCATGGAG
GATCAGTCTCATCATAATTCTCGCG
CATCGGAATGGCTTTTTGAAAGCG
GCATGCGCTAACACCTCCCCTT
CGCTGCTGGTTTTACAGGTT
GCTGAAGCAAAGTTCCAAGC
长度/bp
通用引物为真核生物18SrDNAPCR通用引物，目的片段长度及序列信息参见附录B中B.1，引物序列引自参考文献[]。
电泳试剂
TAE缓冲液、琼脂糖、电泳上样缓冲液、1OOObpDNA分子量标准。5球虫诊断
5.1粪便检查2
5.1.1采样量
采集被检鸡只或鸡群的新鲜粪便不少于200g。5.1.2定性检查
SN/T4881-2017
5.1.2.1取新鲜粪便10g，放人50mL烧杯中，加入30mL~40ml水，搅匀。经60目铜丝网或尼龙网过滤。
5.1.2.2将滤液平均移入4支10mL~15mL试管.2500/min离心10min。5.1.2.3倾去上清液，向各管沉淀物中加入少量饱和盐水，混匀。将各管的沉淀物混悬液移入一个5mL玻璃瓶。
5.1.2.4用饱和盐水加满，盖上盖玻片（盖玻片须能与液面接触），静置10min。5.1.2.5取下盖玻片，将其放在载玻片上。5.1.2.6
置载玻片于显微镜载物台，用10×10或10入40的倍数进行检查5.1.2.7判定
发现球虫卵囊，被检样品判为鸡球虫阳性：a）
b）未发现球虫卵囊，需重复检查5次，仍未见球虫卵囊，被检样品判为鸡球虫阴性3定量检查
对定性检查中呈阳性的粪样，进行定量检查5.1.3.1
5.1.3.2取待检粪样2g，放人50mL烧杯。加入少量水搅匀，经60目铜丝网或尼龙网过滤，并用水冲洗几次滤网。
5.1.3.3滤液经2500r/min离心10min5.1.3.4用少量饱和盐水将沉淀物搅匀，移入100ml.烧杯，加饱和盐水至60mL，充分混匀。用吸管吸取混悬液注满麦氏虫卵计数板，静置5min。5.1.3.5将麦氏虫卵计数板置于显微镜下检查，用10×10或10×40倍，数出每个刻室（1cm×1cm×0.15cm=0.15cm，含100个小方格）内的所有卵囊数，计算出平均值A，对压线的卵囊，按左、上压线计，右、下压线不计处理。
5.1.3.6每克粪便卵囊数（OPG)按式(1)计算：OPG=A+0.15)X60-2=A×200
....（1)
5.1.3.7对卵囊数较多的粪样，可在60mL的基础上，用饱和盐水再稀释B倍后计数，则OPG按式(2)计算：
OPG=A×200XB
处判定标准：
a）严重感染：OPG>10×10%；
2）类便检查参考GB/T18647—2002中的操作方法。..
.（2)
SN/T4881-2017
b）中度感染：10×10≥0PG1x10；轻度感染OPG<1X10
5.2组织检查
对疑似感染或致死鸡进行病理解剖，观察病变情况，主要检查肠道病变。取病变肠道，刮取黏膜、内容物放在载玻片上，滴1滴～2滴磷酸盐缓冲液，加盖玻片，进行显微镜检查，在涂片上发现有虫体（子孢子、滋养体、大小配子体、合子、卵囊），即可判定为鸡球虫阳性。若镜检发现有裂殖体、裂殖子，可初步判定为鸡球虫阳性，需经鸡球虫通用型PCR或分型PCR进一步检测鉴定，并根据其判定标准予以判定。
5.3通用型PCR检测
DNA提取
取200mg待测样品放人1.5mL的离心管中，加人1mL双蒸水，混勾，置离心机中3000r/min离心10min，重复以上操作离心洗涤4次。经离心洗涤后的样品加人200μL双蒸水，再加人与样品体积相同的玻璃珠，漩涡震荡30min，吸取研磨液置另一离心管，加裂解缓冲液、0.5mol/LEDTA、蛋白酶K溶液及核糖核酸酶溶液，混匀后，放于恒温浴锅中，55℃作用16h~18h，其间不时地摇动离心管，使虫体组织裂解充分。
取250uL裂解混合液加入上述水浴后的离心管中，摇匀后置漩锅振荡，将混合液移入过滤柱，13000r/min离心4min，弃去过滤柱下面的液体；加人650μL洗液13000r/min离心2min，重复以上步骤4次，将过滤柱移人1.5mL的离心管，加人30μL无菌水，室温放置2min，13000r/min离心2min，弃去过滤柱，离心管中即为所需DNA，一20℃保存。5.3.2
通用型反应体系
通用型反应体系见表2。
2通用型反应体系
10XPCRbuffer
MgCl,(25.0mmol/L)
dNTPs(10.0mmol/L)
上游引物（50.0μmol/L）
下游引物（50.0μmol/L）
TagDNA聚合酶（5U/μL）
模板DNA
加ddH，0至
通用型反应条件
通用型反应条件如下：
预变性：94℃5min；
体积/uL
扩增循环：94℃30s，50℃1min，72℃2min，35个循环；延伸：72℃10min。
设立对照wwW.bzxz.Net
每次实验均需设立阴性对照、阳性对照。5.3.5
凝胶电泳分析
SN/T4881—2017
制备1%琼脂糖凝胶板，取5μLPCR产物与0.5μL上样缓冲液混匀，加人凝胶板加样孔，同时加Marker、阴性对照和阳性对照。5V/cm电压电泳30min~40min。经凝胶成像系统观察、摄像并保存图像。
结果判定
阳性对照出现目的条带，阴性对照未出现目的条带，实验成立。实验成立的条件下，被检样品出现目的条带，测序结果符合的判为鸡球虫阳性。实验成立的条件下，被检样品未出现目的条带，判为鸡球虫阴性。分型检测
DNA提取
见5.3.1。
分型检测反应体系
分型检测反应体系见表3。
10XPCRbuffer
MgCl(25.0mmol/L)
dNTPs(10.0mmol/L)
上游引物（50.0μmol/L）
下游引物（50.0μmol/L）
TaqDNA聚合酶（5U/μL）
模板DNA
加ddH0至
5.4.3分型检测反应条件
分型检测反应条件见表4。
分型检测反应体系
体积/μ
SN/T4881—2017
柔嫩艾美耳球虫
(E.tenella)
巨型艾美耳球虫
(E.marima)
堆型艾美耳球虫
(E.acervulina)
毒害艾美耳球虫
(E.necatrir)
布氏艾美耳球虫
(E.brunetti)
和缓艾美耳球虫
(E.mitis)
早熟艾美耳球虫
(E.praecor)
对照设立
预变性
944min
分型检测反应条件
94℃45s
每次实验均需设立阴性对照、阳性对照。凝胶电泳分析
见5.3.5。
5.4.6结果判定
55℃30s
55℃30s
55℃30s
58℃30s
58℃30s
58℃30s
58℃30s
5.4.6.1阳性对照出现目的条带，阴性对照未出现目的条带，实验成立。延伸
72℃1min
实验成立的条件下，被检样品出现××种的目的条带，判为鸡球虫×X种阳性。5.4.6.2
实验成立的条件下，被检样品未出现××种目的条带，判为鸡球虫××种阴性。5.4.6.3
循环数
35个循环
72℃延伸
附录A
（资料性附录）
鸡球虫病概述
SN/T48812017
鸡球虫病（ChickenCoccidiosis）是由艾美耳属（Eimeria）多种球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内所引起的一种寄生性原虫病。鸡球虫在分类上属于原生动物门（Protozoa）、顶复器亚门（Apicomlexa）、孢子虫纲（Sporozoasida）、球虫亚纲（Coccidiasina）、真球虫目（Eucoccidiorida）、艾美耳亚目（Eimeriorina）、艾美耳科（Eimeridae）、艾美耳属（Eimeria）。感染鸡的艾美耳球虫有7种：柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）；毒害艾美耳球虫（E.necatria）；堆型艾美耳球虫（E.acervulina）；巨型艾美耳球虫（E.marima）和缓艾美耳球虫（E.mifs）：早熟艾美耳球虫（E.praecor）：布氏艾美耳球虫（E.brunetti）。其中，柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫致病性最强，布氏艾美耳球虫，有明显的致病力，但感染不普遍；堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫的致病力属轻度至中度，在鸡群中普遍存在，其毒力的强弱取决于虫株和缓艾美耳球虫致病力轻微，在自然条件下危害不大；早熟艾美耳球虫基本没有致病力。7
SN/T4881—2017
附录B
（资料性附录）
核酸序列
B.1艾美耳球虫属不同种18SrDNA序列信息艾美耳球虫属不同种18SrDNA序列信息见表B.1。表B.1Genbank艾美耳球虫属不同种18SrDNA序列信息种
堆型艾美耳球虫
(E.acervulina)
布氏艾美耳球虫
(E.brunetti)
巨型艾美耳球虫
(E.matima)
和缓艾美耳球虫
(E.mitis)
毒害艾美耳球虫
(E.necatrir)
早熟艾美耳球虫
(E.praecox)
柔嫩艾美耳球虫
(E. tenella)
登录号
U67115
U67116
U67117
U67118
U67119
U67120
U67121
堆型艾美耳球虫（E.acervulina）（GenBank：AF926384，196bp~498bp）181 ggatgatgtt tgctgctgcg agggaacgct taattgaacc ttatcatcta ccaatctttg24l aatctgtttt gttatcccac cacgacgcat tttgtgaag aaaaaagagg aaaaaacctg30l actgtgcaag catcattgcc accttttgaa gggatgggat gatgatgcat gcatgggaag36l gggagggcgg cgcatgcacc gcttggggct ttttggggct ttggggctgt ggtggtgggg421 cttgcatgct acatgtgacc ctggcacggc tgtctatgat gagcacccat agcgccagcg48l tgtgttattg cgttcgttgc cttgtatttt atattaaaaa aaaacaaaac tttcagcaatB.3布氏艾美耳球虫（E.brunetti）（GenBank：AF026383，212bp~395bp）181 ttggagtttt ctgcatgcgg gactgtgtgg ggctggggct gcagcgacag gggagaaaag8
长度/bp
24latcagtttga gcaaaccttc gaatcaattaacgctttcca acaaagtctttttgaaaatt30l gaagcatgaa aattaaattt gaaattggat ttgatggatc tgaagcgcgc tggaaggagc361 ggaaggaggc gtgcatgcgg gatggggcca tcgatggcca tgcgtgcatg catgcatgag巨型艾美耳球虫（E.maxima）（GenBank：AF065095，198bp~348bp）18l tscaattttg gttgctattg tggggcatat tgttgtgawt cgttygggag tttgctgcga241 ggaarcgctt attacaatca tatatwccca atcattgaat cttttatttc cccacaacgt301 attttgagg gaatwtgagg agcttgggag acatgtggtg cctcattgtg agtggtgwgo和缓艾美耳球虫（E.mitis）（GenBank：AF065093155bp~484bp）121 tcattcacac ataatgcgcg tctcgcgggc tggggtttat ttcctgtcgt cgtctcgctt181 ttgcgattcg tgggaggaag gaagcgtcgg taccgtcggg attggctgct tctgaaccat241 tgttatcaaa tctttgaate catagttatt tctccacgac gttattttta aaaagaaggc301 ttttaaagt tgttttgcct gcatcaac tcgatttgca ggtgtgtggg atgagtatgc361 ttgttggggg gtctgtcggt ggtggggctt tggggctgca tgtgcatgcg tgcatgtggc421 tgcagcccca agctctgcac accacggtgt gttattaccg gaatcccgat tctctcttgc48l atacttttct cactgttttt ttgtttgttt aaagaaaaaa aactttcagc aatggatgtcB.6毒害艾美耳球虫（E.necatrix）（GenBank：AF026385，344bp~503bp）301 aaattaaaag gcattttggt cttgcaaggc atgtgctagt agtagtatgg gcgtgagcat36l ggaggggaag tggtggtgtc atgcgcatgc gtggcttgca tgtgtggggc ttgtcggtgg421 cagccccagg gccagcccca gccccatgac cagccccata gtcgcgatca cgacgaggcg48l cgagaattat gatgagactg atcggggctg ctttttttt tgcagacgtt cgcagctcgaB.7早熟艾美耳球虫（E.praecox）（GenBank：AF065092，154bp~368bp）12l tcattcacacattgcgtctc caagcgattt catcatcggaatggctttttgaaagcgttt181 tgcgatgttg gagtctgcta ggggggagcg ccgacaaacc aacgtaaacc aatccttgaa24l tcgctttgct ttccctccac aacgttcttt tgttattaaa aaagaaatga atgaacttct30l ctttgtatga aagatggatt ttaacgatgg aagatctgtc gcatgcaagg ggaggtgtta361 gcgcatgcgg ggggtggggc tggttggggg ctgcatgcat gcatgcatgc aagtatgcatB.8
柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）（GenBank：AF026388，2311bp~2773bp）2281 atcattcaca caattcgcac gcctggaacg cgctgctggt tttacaggtt tcaagcatto234l gctttgcctg ggtggccagc agcaggtagt cgtcggtgtt gttggaaaga aaaatttagt240l ccatcgcaac ccttgaatct gtttttctct gcaacggttt ttctactttt taaaaattga2461 tggaattttt tgctgctgca aggatatata gcagtagtat gtacgtgggc ggtcggggggSN/T4881—2017
SN/T4881-2017
2521 gtggtggcgc atgcacgggc tcgcgtgggg cctgtcggtg gcagccccag cgcgccggcg2581 cagccccgtg atcgtcgatc gcgcacgtac gtggagggga ttatgagagg agaagacgcg2641 cacggggctg tgtcgtatgc agagcgctcg cggctcgggc gattgttccg tgttgtgtgc2701 tctgctgcat gctggtgtgt gcgttctgte tctttctctc tccgttacat gctgcttgga2761 actttgcttc agcaagaaac ttttgctcac taaggtgaat cgaatcactt ttgttgatga10
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