SN/T 1222-2012.Quarantine protocol for fowl ty phoid and pullorum disease.
1范围
SN/T 1222规定了禽伤寒和鸡白痢的病原分离与鉴定.全血平板凝集试验和血清平板凝集试验的技术要求。
SN/T 1222适用于鸡禽伤寒和鸡白痢的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 2123出 人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BPW   buffered peptone water:缓冲蛋白胨水
BS      bismuth sulfite agar:亚硫酸铋琼脂
HE      hektoen enteric agar:HE琼脂
SC      selenite cysteine broth:亚硒酸盐胱氨酸增菌液
TSI     trple sugar iron agar:三糖铁琼脂
TTB    tetrathionate/ brilliant green broth:四硫磺酸钠煌绿增菌液
XLD    xylose lysine deoxycholate agar :木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂
4生物安全措施
样品采集,样品处理及检验过程所涉及的实验操作和防护要求应符合GB 19489的规定。
5病原分离与鉴定
5.1试剂与材料
5.1.1 培养基
5.1.1.1非选择性增菌液:BPW。
5.1.1.2 选择性增菌液:SC,TTB.
5.1.1.3 选择性琼脂平板:BS.XLD,HE,沙门氏菌显色培养基。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1222—2012
代替SN/T1222—2003
禽伤寒和鸡白痫检疫技术规范
Quarantine protocol for fowl typhoid and pullorum disease2012-05-07发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2012-11-16实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
禽伤寒和鸡白检疫技术规范
SN/T1222-2012
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）64275323
网址spc.net.cn
中国标推出版社泰皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
印张1字数25千字
2012年10月第一版
2012年10月第一次印剧
印数1-1600
书号：155066·2-24014
定价18.00元
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1222—2003《鸡白痢抗体检测方法全血平板凝集试验》。
本标准与SN/T1222—2003相比，主要技术变化如下：增加了病原分离与鉴定和血清平板凝集试验。SN/T1222—2012
修改了“全血平板凝集试验\的试剂部分，将阳性血清细分为强阳性和弱阳性血清；修改了“全血平板凝集试验”的结果判定。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘中勇、许如苏、马保华、陈茹、鱼海琼、陈冠武、林彩华、朱道中。本标准所代替标准的历次版本发布情况为SN/T1222—2003
1范围
禽伤寒和鸡白检疫技术规范
SN/T1222—2012
本标准规定了禽伤寒和鸡白的病原分离与鉴定、全血平板凝集试验和血清平板凝集试验的技术要求。
本标准适用于鸡禽伤寒和鸡白痢的检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BPwbufferedpeptonewater：缓冲蛋白陈水BS
bismuthsulfiteagar：亚硫酸铋琼脂HE
hektoen enteric agar：HE琼脂selenitecysteinebroth：亚硒酸盐胱氨酸增菌液TSItrple sugar iron agar：三糖铁琼脂TTB
tetrathionate/brilliantgreenbroth：四硫磺酸钠煌绿增菌液XLD
xyloselysine deoxycholateagar：木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂4生物安全措施
样品采集、样品处理及检验过程所涉及的实验操作和防护要求应符合GB19489的规定。5病原分离与鉴定
5.1试剂与材料
5.1.1培养基
非选择性增菌液：BPW。
选择性增菌液：SC，TTB。
选择性琼脂平板：BS.XLD.HE，沙门氏菌显色培养基。生化鉴定培养基：TSI，赖氨酸脱羧酶培养基、鸟氨酸脱羧酶培养基、尿素酶培养基、半固体培SN/T1222—2012
养基、糖发酵管、生化鉴定试剂盒或试剂条。5.1.1.5培养基的配制：培养基配制方法见附录A。5.1.2蒸馏水
配制培养基的蒸馏水应符合GB/T6682三级水的要求5.1.3革兰氏染色液
购买市售商品或自行配制。配制方法见附录B。5.1.4沙门氏菌诊断血清
A-F多价O血清.O因子血因于血清H-a因子血清.H-d因子血清.H-g.m因子血清和H-g.P因子血清。
5.2设备
5.2.1二级生物安全柜。
生化培养箱。
5.2.3均质器。
5.2.4电子天平（感量0.1g）。
5.2.5显微镜。
全自动微生物鉴定系统。
5.3样品采集
卵管你组织样品，如无病鸡或死鸡，可采集活鸡新鲜粪便或泄无菌采集病、死鸡的肝、脾
卵建和辅
务还可采集解化谨程中出现的先胚。样品采集方法及保存条件应殖腔子。种鸡还可采集新鲜蛋
符合SN/T2123的规定。
病原分离
组织样品或死胚
将组织样品或死胚直接划线接种BS或HE
少门氏菌显色培养基平板，36℃土1℃培养24h，挑取可疑菌落进行鉴定。同时，将剩余组织样品或死胚制成110浆，各取10mL同时接种90mLBPW.90mLSC和90mLTTB.将BPW和SC接种物置36C土1C培养.TTB接种物置42C士1℃培养，取培养24h的接种物分别划线接种XLD和BS或HE或显色培养基平板，36℃土1℃培养24h，挑取可疑菌落进行鉴定。如无可疑菌落，取培养48h的上述接种物再划线分离一次。无可疑菌落者判为病原分离阴性。5.4.2新鲜粪便或泄殖腔拭子
将新鲜粪便或泄殖腔拭子同时接种90mLSC和90mLTTB增菌液，分别置36C土1℃和42℃士1℃培养。取24h培养的接种物分别划线接种XLD和BS或HE或显色培养基平板，36士1℃培养24h，挑取可疑菌落进行鉴定。如无可疑菌落，取培养48h的上述接种物再划线分离一次。无可疑菌落者，判为病原分离阴性。2
蛋内容物
SN/T1222—2012
无菌采取新鲜鸡蛋的内容物25g.加入225mLBPW搅拌勾浆，36℃土1培养，取培养24h的接种物分别划线接种XLD和BS或HE或显色培养基平板，36℃土1℃培养24h，挑取可凝菌落进行鉴定。如无可疑菌落，用培养48h的上述接种物再划线分离一次。无可疑菌落者，判为病原分离阴性。5.5病原鉴定
菌落特征
菌落特征见表1。
表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征琼脂平板
显色培养基
菌落呈粉红色，带或不带黑色中菌落：有些菌株为黄色菌落，
沙门氏随福靠特
有些菌株可
带色中
菌落呈黑色有金属光泽、棕捆色或灰的菌落·周围培养基
呈蓝绿色或蓝色，
见大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落周围培养基可黑色或棕色，有些菌株形成灰绿色未为黄色，中心黑色或几乎全黑色。效落中心黑色或儿平全黑色·有些随味按照显色培养基的说明进行判定。5.5.2
形态与染色特性
从XLD、BS或HE或显色培养基平板上挑取典型或可疑菌落涂片，革兰氏染色镜检。沙门氏菌为革兰氏染色阴性杆菌。
5.5.3生化鉴定
从XLD、BS或HE或显色培养基平板上挑取典型或可是菌落，分或尿素酶培养基。36℃土1℃培养培养基内的反应分别见表2和表321h.观察结果
沙门氏菌在T
引接种TSI、赖氨酸脱羧酶培养基和赖氨酸脱酸酶培养基或尿素酶表2
沙门氏菌属在TSI和赖氨酸脱羧酶培养基内的反应结果TSI
硫化氢
赖氨酸脱羧酶培养基
初步判断
可疑沙门氏菌属
可疑沙门氏菌属
可疑沙门氏菌属
非沙门氏菌
非沙门氏菌
注，K：产碱\A，产酸+：阳性：一·阴性：+（-），多数阳性.少数阴性：十/-，阳性或阴性。3
SN/T1222—2012
表3沙门氏菌属在TSI和尿素酶培养基内的反应结果TSI
硫化氮
尿素酶培养基
初步判断
可沙门氏菌属
可疑沙门氏菌属
非沙门氏菌
非沙门氏菌
非沙门氏菌
注：K：产碱：A.产酸：十：阳性一：阴性：十（-).多数阳性，少数阴性：十/一：阳性或阴性。初步判定为可疑沙门氏菌属的.用其TSI培养物按表4或生化鉴定试剂盒或试剂条或全自动微生物生化鉴定系统作进一步鉴定。表4鸡伤寒沙门氏菌和鸡白痫沙门氏菌生化反应结果项目
鸡伤寒沙
门氏菌
鸡白菊沙
门氏菌
倒插管葡
葡糖产气
尿素酶
鸟氨酸
脱羧酶
赖氨酸
脱羧酶
麦芽糖
一或迟
半固体
注：K：产碱：A：产酸：+，1d~2d内90%（含90%）以上出现阳性反应：一：1d~2d内90%（含90%）以上无反应：V：反应不定。TSI、赖氨酸脱羧酶试验和尿素酶试验结果可利用表2或表3的结果，无需另做。符合表4反应的，初判为鸡伤寒沙门氏菌和鸡白痫沙门氏菌，需进一步作血清学鉴定：经生化鉴定试剂盒或试剂条，或全自动微生物生化鉴定系统鉴定为沙门氏菌的，也需进一步作血清学鉴定。5.5.4血清学鉴定
在洁净的玻片上划出2个1cm×2cm的区域，一个区域加1滴生理盐水作为对照，另一个区域加1滴A-F多价O血清。从培养18h～24h的TSI上挑取少量待鉴定菌苔.分别与生理盐水和血清混匀，并研成乳状液。轻轻摇动玻片1min～2min，置黑色背景下观察。如对照试验出现凝集反应，判定菌株自凝，不能进行血清分型：如对照试验不出现凝集反应，多价血清试验出现凝集反应的，用单因子血清O。.O12.H-a，H-dH-g.m和H-g.p分别代替A-F多价O血清进行凝集试验。培养物与O.Oi和H-d因子血清作用出现凝集反应，与H-a，H-g.m和H-g.P因子血清作用不出现凝集反应的，判定为鸡伤寒沙门氏菌；培养物与OO12因子血清作用出现凝集反应，与H-a，H-d，H-g.m和H-g.p因子血清作用不出现凝集反应的，判定为鸡白痫沙门氏菌。6全血平板凝集试验
6.1试剂与器材
1禽伤寒和鸡白痢多价染色平板抗原、强阳性血清（500IU/mL）、弱阳性血清（10TU/ml）、阴性6.1.1
血清。
SN/T1222—2012
玻璃板或白瓷板、可调移液器（20L～200μL）、一次性吸头、消毒针头，消毒盘和酒精棉等。6.2试验操作
在洁净的玻璃板或白瓷板上，用标记笔划出3cm×3cm的方格。将抗原摇匀后，在每一方格内垂直滴加抗原1滴。用针头刺破鸡的翅静脉或冠尖，用移液器吸取与抗原等量的血液，滴加在方格内，与抗原充分混合均勾，轻轻摇动玻璃板或白瓷板，2min内判定结果，同时设立强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清对照。
6.3凝集反应判定标准
凝集反应判定标准如下：
100%凝集（#）：紫色凝集块大而明显，混合液较清：75%凝集（十十十）：紫色凝集块较明显，混合液有轻度浑浊：-50%凝集（十十）：出现明显的紫色凝集颗粒，混合液较为浑浊；25%凝集（+）：仅出现少量的细小颗粒，混合液浑浊：不凝集（一）无凝集颗粒出现，混合液浑浊。6.4试验成立条件wwW.bzxz.Net
在2min内，抗原与强阳性血清出现100%凝集（#），与弱阳性血清出现50%凝集（++），与阴性血清不凝集（一）时，试验成立，可进行结果判定。否则，应重新试验。6.5结果判定
结果判定如下：
在2min内被检全血与抗原出现50%（十十）以上凝集的，判为禽伤寒和鸡白痴抗体阳性：在2min内，被检全血与抗原不发生凝集的，判为禽伤寒和鸡白痢抗体阴性：在2min内，被检全血与抗原出现50%（十十）以下凝集，判为可疑反应。需将可疑鸡隔离饲养1个月后，再检验，若仍为可疑反应，则按阳性反应判定。7血清平板凝集试验
本试验所用试剂、材料、试验操作和结果判定与全血平板凝集试验相同，所不同的是用血清代替全血进行试验。试验所用血清宜在血清采集后72h内完成试验。未能及时进行试验的，血清应保存在一18℃以下，
SN/T1222—2012
A.1缓冲蛋白陈水（BPW）
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钠（含12个结晶水
磷酸二氢钾
蒸馏水
附录A
（规范性附录）
培养基的配制
将各成分加人蒸馏水中，搅拌均匀，静量约10min者沸溶解.调节pH为7.2士0.2.分装后高压灭菌121℃，15mim。
A.2亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC
蛋白陈
磷酸氢二钠
亚硒酸氢钠
L-胱氨酸
蒸馏水
除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸
各成分加人族信水中，搅
外将餐
菌操作加人亚硒酸氢钠和1g
气酸溶夜10m
15mlL.使溶解.再加灭菌蒸馏水至1007.0±0.2。
四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）
基础液
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
碳酸钙
蒸馏水
（称取。
口为DL胱氨鼓
1000ml
煮沸溶解，冷至55℃以下，以无光氨酸加1mol/L氢氧化钠溶液
用量应加倍）。摇匀，调节pH为除碳酸钙外，将各成分加人蒸馅水中，煮沸溶解，再加人碳酸钙，调节pH为7.0土0.2.高压灭菌121℃.20min.
A.3.2硫代硫酸钠溶液
硫代硫酸钠（含5个结晶水）
蒸馏馅水
高压灭菌121℃，20min。
碘溶液
碘化钾
蒸馏水
加至100mL
加至100mL
SN/T1222—2012
将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投人碘片.振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。A3.4
0.5%煌绿水溶液
蒸馏水
溶解后，存放暗处，不少于1d.使其自然灭A.3.5
牛胆盐溶液
牛胆盐
蒸馏水
加热煮沸至完全溶解高压灭121.20mmA.3.6
基础液
硫代硫酸钠溶液
碘溶液
煌绿水溶液
牛胆盐溶液
临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加人基础成分。
A.4木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂(XLD酵母膏
L-赖氨酸
去氧胆酸钠
柠檬酸铁铵
硫代硫酸钠
氯化钠
0.5%酚红
蒸馏水
中，每力
1000ml
成分，均应摇匀后再加入另一种SN/T1222—2012
除酚红和琼脂外，将其他成分加人400mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH为7.4士0.2。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加人酚红指示剂，待冷至50℃~55℃时倾注平血。
注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。
亚硫酸铋琼脂（BS）
蛋白陈
牛肉膏
葡萄糖
硫酸亚铁
磷酸氢二钠
0.5%煌绿
柠檬酸铋铵
亚硫酸钠
蒸馏水
18.0g~20.0g
1000ml
将前三种成分加人300mL蒸馏水（制作基础液）.将硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加人20mL和30mL蒸馏水，将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入20mL和30mL蒸馏水，将琼脂加人600mL蒸馏水中。然后分别搅拌均勾，煮沸溶解。冷至80℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒人基础液中，混勾。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混勾·倒人基础液中再混勾。调节pH为7.5士0.2，随即倾人琼脂液中，混合均匀.冷至50℃～55℃。加人煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平血。注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。储于室温暗处，超过48h会降低其选择性，本培养基宜于当天配制，第二天使用。A.6
HE琼脂
蛋白陈
牛肉膏
水杨素
氯化钠
蒸馏水
0.4%溴廓香草酚蓝溶液
Andrade指示剂
18.0g~20.0g
1000ml
将前面七种成分溶解于400mL蒸馏馅水内作为基础液：将琼脂加人于600mL蒸馏水内。然后分别搅拌均勾煮沸溶解。将甲液和乙液加人基础液内，调节pH为7.5土0.2。再加人指示剂，并与琼脂液8
合并，待冷至50℃～55℃倾注平血。注1：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。注2：甲液的配制
硫代硫酸钠
柠檬酸铁铵
蒸馏水
注3：乙液的配制
去氧胆酸钠
蒸馏水
注4：Andrade指示剂
酸性复红
1mol/L氢氧化钠溶液
蒸馏水
SN/T1222—2012
将复红溶解于蒸馏水中，加人氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1mL～2mL。A.7沙门氏菌显色培养基
按使用说明称取干粉培养基，加适量蒸馏水，加热溶解后.待冷至50℃～55℃时倾注平血，A.8三糖铁琼脂（TSI）
蛋白陈
牛肉膏
葡萄糖
硫酸亚铁铵（含6个结晶水）
0.5%酚红
氯化钠
硫代硫酸钠
蒸馏水
1000ml
除酚红和琼脂外，将其他成分加人400mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH为7.4土0.2。另将琼脂加人600mL蒸馏水中，煮沸洛解。将上述两溶液混合均匀后，再加人指示剂.混匀·分装试管，每管约3mL~4mL，高压灭菌121℃，10min或115℃，15min，灭菌后置成高层斜面.呈桔红色。A.9赖氨酸脱羧酶培养基
蛋白陈
酵母浸膏
葡萄糖
蒸馏水
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液
L-赖氨酸或DL-赖氨酸
1000mL
0.5g/100mL或1.0g/100ml
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