SN/T 1280-2014
基本信息
标准号： SN/T 1280-2014
中文名称：国境口岸鼠疫检验规程
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1280-2014.Inspection codes for plague at frontier port.
1范围
SN/T 1280规定了国境口岸鼠疫检验的实验室生物安全规范、材料的采集、保存和运输、检验程序、结果判定。
SN/T 1280适用于国境口岸检验检疫工作中鼠疫的实验室检验。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
WS279鼠疫诊断标准
《人间传染的病原微生物名录》(卫生部)
《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》(卫生部)
3要求
3.1鼠疫菌检验应在卫生部《人间传染的病原微生物名录》规定的相应等级的生物安全实验室内进行。
3.2检验人员应熟悉并遵守实验室管理制度、自身防护制度技术操作规程等,见附录A。
3.3 应两人以上同时进人实验室工作。
3.4及时准确做好检验的各项实验记录。
3.5用鼠疫特异抗原和抗体检测(见wS279)及基因检测(见附录B),进行口岸鼠疫的快速初步检验。
4准备
4.1设备和材料
天平;离心机、离心管;震荡器;温箱;显微镜;解剖盘、剪刀、短镊子;带盖白瓷缸;接种棒、白金耳;平皿;灭菌小试管;1 mL注射器;血凝微量板、稀释棒;定量滴头。
4.2培养 基和试剂
4.2.1鼠疫菌检验
95%乙醇;生理盐水;革兰氏.美兰染液;溶血(0.1%)赫氏琼脂平板培养基(培养基的制备见附录C);龙胆紫[(1:10万)~(1;20万)]亚硫酸钠(0.025%)平板或龙胆紫溶血平板培养基;鼠疫噬菌体。
1范围
SN/T 1280规定了国境口岸鼠疫检验的实验室生物安全规范、材料的采集、保存和运输、检验程序、结果判定。
SN/T 1280适用于国境口岸检验检疫工作中鼠疫的实验室检验。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
WS279鼠疫诊断标准
《人间传染的病原微生物名录》(卫生部)
《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》(卫生部)
3要求
3.1鼠疫菌检验应在卫生部《人间传染的病原微生物名录》规定的相应等级的生物安全实验室内进行。
3.2检验人员应熟悉并遵守实验室管理制度、自身防护制度技术操作规程等,见附录A。
3.3 应两人以上同时进人实验室工作。
3.4及时准确做好检验的各项实验记录。
3.5用鼠疫特异抗原和抗体检测(见wS279)及基因检测(见附录B),进行口岸鼠疫的快速初步检验。
4准备
4.1设备和材料
天平;离心机、离心管;震荡器;温箱;显微镜;解剖盘、剪刀、短镊子;带盖白瓷缸;接种棒、白金耳;平皿;灭菌小试管;1 mL注射器;血凝微量板、稀释棒;定量滴头。
4.2培养 基和试剂
4.2.1鼠疫菌检验
95%乙醇;生理盐水;革兰氏.美兰染液;溶血(0.1%)赫氏琼脂平板培养基(培养基的制备见附录C);龙胆紫[(1:10万)~(1;20万)]亚硫酸钠(0.025%)平板或龙胆紫溶血平板培养基;鼠疫噬菌体。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1280-2014
代替SN/T1280—2003
国境口岸鼠疫检验规程
Inspection codes for plague at frontier port2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1280—2003《国境口岸鼠疫检验规程》。本标准与SN/T1280—2003相比，主要技术变化如下：修改了规范性引用文件：“GB15991一1995”修改为“WS279”SN/T1280—2014
修改了要求：“专用实验室”修改为“卫生部《人间传染的病原微生物名录》规定的相应等级的生物安全实验室”，“条件具备用聚合酶链式反应（PCR）\修改为“用鼠疫特异抗原和抗体检测及基因检测”；
一修改了检验程序：
一修改了结果判定：
一修改了附录A、附录B、附录D附录B修改为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局和中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局本标准主要起草人：王东胜、乔舜、魏怀波、田丽、孟东平、孙利。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1280—2003。I
1范围
国境口岸鼠疫检验规程
SN/T1280—2014
本标准规定了国境口岸鼠疫检验的实验室生物安全规范、材料的采集、保存和运输、检验程序、结果判定。
本标准适用于国境口岸检验检疫工作中鼠疫的实验室检验2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。WS279鼠疫诊断标准
《人间传染的病原微生物名录》（卫生部）《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（卫生部）3要求
鼠疫菌检验应在卫生部《人间传染的病原微生物名录》规定的相应等级的生物安全实验室内进行。检验人员应熟悉并遵守实验室管理制度、自身防护制度、技术操作规程等，见附录A。应两人以上同时进人实验室工作及时准确做好检验的各项实验记录3.5用鼠疫特异抗原和抗体检测（见WS279）及基因检测（见附录B)，进行口岸鼠疫的快速初步检验。4准备
设备和材料
天平：离心机、离心管；震荡器；温箱；显微镜：解剖盘、剪刀、短镊子：带盖白瓷缸；接种棒、白金耳：平血；灭菌小试管；1mL注射器：血凝微量板、稀释棒；定量滴头。4.2培养基和试剂
4.2.1鼠疫菌检验
95%乙醇；生理盐水；革兰氏、美兰染液：溶血（0.1%）赫氏琼脂平板培养基（培养基的制备见附录C）：龙胆紫［（1：10万）（1：20万）亚硫酸钠（0.025%）平板或龙胆紫溶血平板培养基：鼠疫噬菌体。4.2.2间接血凝试验（IHA）
4.2.2.12.5%F1抗原致敏血球。用细菌凝集效价为1：320以上的鼠疫全菌免疫血清滴定、血凝滴度应不低于1：40000；与假结核血清交叉滴定、滴度应不高于1：5；符合上两项规定的致敏血球为合格诊断用血球，每一鼠疫季节开始前或更换致敏血球批号时应进行上述滴定。1
SN/T1280—2014
1%正常免血清盐水。
2.5%单宁酸血球。
F1抗原液（50μg/mL~100μg/mL）。4.2.2.4
反向血凝试验（RIHA）
2.5%鼠疫抗体致敏血球；1%正常免血清盐水；鼠疫诊断血清。疑似鼠疫材料的采取、保存和运输5
按附录D的规定执行。
检验程序
鼠疫菌检验
6.1.1镜检
6.1.1.1.1
取材腺、肝、脾、肺、心，用切面在洁净玻片上压印或涂成薄片；或取骨髓、脑脊液及各种渗出液、痰，用接种环直接涂片。至少2张，室温下自然干燥，人体及自死动物材料至少涂4张片。2用95%乙醇或乙醇、乙醚各半配制的固定液固定10min，取出自然干燥。6.1.1.1.2
涂片进行革兰氏染色和美兰染色。6.1.1.3镜检
发现革兰氏阴性、两极浓染、两端钝圆的短小球杆菌，为符合鼠疫菌的特点。注意腐败材料或陈旧材料菌本身形态的变化。
细菌培养
按WS279的规定执行。
3鼠疫噬菌体裂解试验
按WS279的规定执行。
6.1.4动物接种
按WS279的规定执行。
血清学检验
间接血凝试验（IHA）
按WS279的规定执行。
反向血凝试验（RIHA）
按WS279的规定执行。
结果判定
鼠疫菌判定依据
按WS279的规定判定。
间接血凝试验的结果判定
按WS279的规定判定。
反向血凝试验的结果判定
按WS279的规定判定。
SN/T1280—2014
SN/T1280-2014
A.1导言
附录A
（规范性附录）
鼠疫实验室生物安全规范
由于鼠疫菌特别危险的性质，对鼠疫实验室有不同于一般细菌学实验室的特殊要求。鼠疫菌检验应在卫生部《人间传染的病原微生物名录》规定的相应等级的生物安全实验室内进行。A.2鼠疫实验室结构
A.2.1普通鼠疫实验室
实验室宜设立于独立的建筑物，结构相对密闭，由洁净区、普通实验室、缓冲区和强毒操作区组成，强毒操作区应安装带有除菌滤器的通风排气系统，污水应通过处理才能进入公共污水系统，采取防鼠防虫措施，防止啮齿类动物或昆虫审人室内，并严防实验动物外审。实验室的强毒区域内，设动物解剖室、细菌培养室、实验动物接种及饲养室，如果有条件可增设疑似材料接检室（接受材料、检蚤等）。这些工作室互相联系成为一个系统。在实验室的强毒区和其他辅助区域之间，设双重缓冲间、消毒间和出人实验室的更衣间。在强毒区域之外，宜根据需要设置普通实验室和其他建筑以提供技术支持，如培养基制备、镜检、血清学试验、高压、洗涤以及健康动物饲养间等A.2.2生物安全Ⅱ级实验室
在普通鼠疫实验室内配备Ⅱ级以上生物安全柜，即为生物安全Ⅱ级实验室，可简化进人实验室的着装要求。
A.2.3生物安全Ⅱ级实验室
在生物安全Ⅱ级的基础上，实验室维持恒定的负压，保证进出实验室时空气流向为由外向内，保证实验室内空气流向自上而下，无横向气流和紊流，并维持必要的洁净度，即达到生物安全Ⅲ级标准。适用于特别危险，容易产生气溶胶的实验操作，并具备较强的抗御事故能力。A.3鼠疫实验室工作制度
A.3.1进行鼠疫实验室操作时，需有两名工作人员同时进人。A.3.2非实验室工作人员一律禁止进人鼠疫强毒实验区。A.3.3实验室内禁止吃东西、吸烟和喧哗。A.3.4全体工作人员经鼠疫正规培训后方可进行强毒操作，并严格按照鼠疫菌强毒操作规程和其他国家标准进行各项实验，准确记录实验结果。A.3.5工作人员要熟知实验室常规感染途径和掌握个人防护措施A.3.6建立工作人员基础医学检测卡片。A.3.7工作人员如有皮肤损伤、发热、感冒、抵抗力低下和妊娠者，不应进入强毒实验区。4
A.3.8工作完毕，检查实验室水、电、防火设备，打开防盗报警装置。A.4鼠疫实验室着装要求
SN/T1280—2014
A.4.1普通鼠疫实验室按下列顺序穿着防护服装：穿内隔离衣裤；穿防蚤袜及长筒胶靴，戴白帽和小口罩（两鼻翼与小口罩间用适量脱脂棉填充）：扎三角头巾及帽子；穿后开口的白大衣（偏衫）；戴20层～24层的纱布大口罩：戴医用手术手套，必要时外面套细线手套：进行已知毒菌动物接种、解或菌种开封等工作应戴有机玻璃面罩或眼镜，以防操作时细菌溅人眼内或脸部裸露皮肤：或在无菌罩中进行。A.4.2在配备生物安全柜的生物安全Ⅱ级和Ⅲ级实验室内，着装可简省至外科手术着装水平，即带一次性口罩，帽子，穿后开口的白大衣，戴医用手术手套，普通套鞋：也可使用一次性服装。用后高压灭菌。耐用服装也应定期高压灭菌。
A.5鼠疫生物安全操作规程
A.5.1凡是鼠疫材料及疑似材料的检验或鉴定工作，均需在鼠疫实验室内进行，在开始工作之前，工作间用紫外线照射消毒灭菌30min。A.5.2进人鼠疫强毒实验区后，不应用手触及身体的任何部位A.5.3进行细菌分离、培养或其他操作时，生物安全Ⅱ级和Ⅲ级实验室应在生物安全柜中进行；普通实验室应在无菌罩中进行。
A.5.4工作之前，生物安全柜的台面用75%乙醇消毒灭菌，无菌罩的台面用消毒液灭菌，并铺放浸有消毒液的毛巾。
A.5.5进行细菌操作时，接种环应在酒精灯内焰中燃烧，避免菌液飞溅。A.5.6稀释菌液时，将吸管插入试管或烧瓶底部，用吸球缓慢一次性打击菌液，避免产生气泡或气溶胶。
A.5.7切勿从吸管中打出最后一滴菌液，而产生爆破性气溶胶。A.5.8实验中需使用酚、三氟甲烷等腐蚀性试剂时，在乳胶手套外加一次性塑料手套。A.5.9离心时，应使用双盖封闭式离心机和全封闭试管，每管离心液总量低于最高容量一个刻度单位；平衡时不得有菌液渗漏到套管中·离心机使用后立即用消毒液擦洗消毒。A.5.10鼠疫强毒操作不得使用均化器，以免菌液外逸。实验室中所需要的其他物品应从传递窗送人。A.5.11
A.5.12随时用消毒液浸泡手套，如有操作区污染，立即用消毒液清洗处理。如有防护服污染或手套破裂，立即置消毒液中浸泡5min~10min后更换。A.5.13进行动物实验时，勿用手直接对接或拨开注射器和针头，以免划破皮肤或无意接种。A.5.14切勿在空气中直接排放含有菌液的注射器内的气泡，以免形成气溶胶。A.5.15接种过的实验动物应该放在定期消毒、封闭式实验动物室内，并有明确的实验记录。A.5.16每次操作规程结束后，应清理工作面，普通实验室台面用消毒液，生物安全柜台面用75%乙醇抹拭。所有物品应该归位，关闭生物安全柜。A.6污染处理及消毒
强毒实验区内的各项工作记录和其他物品，需经消毒液浸泡或高压灭菌后，方可拿出实验室。A.6.1
A.6.2实验用试管，吸管及其他器械，经消毒液浸泡24h，高压灭菌后，方可拿出实验室。A.6.3细菌培养物、实验动物户体及污物，经高压灭菌后，方可拿出实验室，进行进一步处理。5
SN/T1280—2014
A.6.4工作完毕，检查各仪器设备是否恢复零位或正常运行，做好使用记录。5更衣顺序：在普通鼠疫强毒实验室内，工作结束后将手和脚（着穿胶靴和手套）在消毒液内浸A.6.5
1min～3min，然后在消毒间按上述相反顺序脱下（手术手套在偏衫后脱），头巾或白大衣高压灭菌，医用手术手套和纱布口罩用0.1%新洁而灭消毒，如用滤材口罩可用环氧乙烷密闭灭菌，面罩或眼镜用酒精棉球消毒。最后洗手并用75%乙醇棉球擦面部裸露部位，用3%硼酸水漱口后，方可离开实验室。A.6.6
鼠疫实验室内，未经消毒的污水不应直接排人公共下水系统。A.7意外事故处理
一般实验室事故，如培养物跌落破碎等，立即在污染区域喷洒消毒液，待消毒液彻底渗透污染物A.7.1
后，再行清理。清理时特别注意避免破碎玻璃等锐利物体割伤皮肤。清理出来的污染物品尽早高压灭菌，清理后的场所再用消毒液及75%乙醇擦拭后，方可重新开始工作。A.7.2可能造成人身伤害的实验室事故，如污染物溅落在身体表面，割伤、烧伤、烫伤，感染动物咬伤等情况时，立即进行紧急处理：未破溃的皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒、酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗：事故的情况报告实验室主任，根据感染鼠疫的可能，决定预防性使用链霉素或其他对鼠疫有效的抗生素，并对受伤害者进行隔离观察。判明确实感染鼠疫时，按传染病防治法的规定报告。A.7.3工作人员进人强毒区工作后，7日内发生不明原因咳嗽、发烧和可疑为鼠疫的症状，应及时向实验室主任报告，不得擅自到医院就诊。不能排除实验室感染时，按鼠疫进行隔离观察和治疗。只有在排除鼠疫感染情况下方可到医院就医。6
B.1导言
附录B
（规范性附录）
鼠疫的PCR技术检测
SN/T1280—2014
PCR（聚合酶链式反应）技术是用分子生物学技术，在体外模拟生物体内环境，对特定的DNA进行体外扩增。用这样的方法对鼠疫菌进行检测，操作简单、快速、特异性强、灵敏度高。将这一先进的检验技术应用到国境口岸的鼠疫检测工作中，可以提高鼠疫诊断的准确性和灵敏度，提高口岸鼠疫监测水平，对国境口岸鼠疫检测的快速诊断有一定的实用性。B.2设备和材料
高速台式离心机；水浴锅：培养箱；pH计：双蒸水发生器；微波炉；匀浆器；微量取液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)；PCR仪，电泳仪；凝胶成像分析系统或紫外线透射仪。B.3试剂配制
B.3.11mol/LTris100mL
Tris12.1g双蒸水90mL，加盐酸5mL左右，调pH=8.0，再加双蒸水至100mL，高压灭菌。B.3.20.5mol/LEDTA100mL
EDTA18.6g双蒸水90mL，加氢氧化钠约2g，在磁力搅拌器上搅拌，再用10mol/L氢氧化钠滴加调pH=8.0，再加双蒸水至100mL，高压灭菌。（EDTA在加人氢氧化钠、pH近8.0时才全部溶解）。B.3.3TEC10mmol/LTris.1mmol/LEDTA.pH=8.0)100mL1 mol/L Tris(pH=8.0)
0.5mol/LEDTA(pH=8.0)
加双蒸水至100mL.高压灭菌。
B.3.4蛋白酶K裂解液（0.5%SDS、300μg/mL蛋白酶K、50μg/mLRNA酶A)2mL10%SDS
20mg/mL蛋白酶K
10mg/mLRNA酶A
加TE(pH=8.0)至2mL。
10%SDS
SDS（十二烷基磺酸钠）
双蒸水
30μL（冷冻保存）
10 μL
SN/T1280—2014
B.3.610mol/L氢氧化钠100mL
氢氧化钠www.bzxz.net
双蒸水
B.3.7加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖）100mL溴酚蓝
加双蒸水至100mL，4℃保存。
B.3.8溴化乙锭保存液（10mg/mL）溴化乙锭
双蒸水
B.4PCR模板的制作
B.4.1蛋白酶K裂解法
适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳。如组织细胞（包括石蜡包埋组织）绒毛、B.4.1.1
血液（血清、血浆、全血）、局部分泌物、尿、粪便B.4.1.2粪便、分泌物、痰液、组织块、右蜡包理组织，用蛋白酶长-消化前，还需作预处理，其方法有离心去掉杂质、脱蜡。
B.4.1.3对动物标本、临床标本或经预处理的标本应采取如下步骤：分别取10mg~100mg.各加蛋白酶K裂解液50μL~500μL，研磨或混勾。a）
置56℃水浴0.5h一1h，或37℃过夜。短暂离心，使盖上或壁上蒸发冷凝的水分沉至管底。各加等体积的饱和酚.颠倒混勾10min，1o000r/min离心10min，取上清液置新离心管。如此抽提1～2次。小心不要吸人沉淀和酚。加等体积的三氯甲烷，颠倒混勾10min，10000/min离心10min，取上清液置新离心管。如d)
此抽提1次～2次。小心不要吸人下层主氯甲烷e)
加人2.5倍体积的冰冷无水乙醇（或加等体积的异内醇），一20℃放置20min～3h。取出后14000r/min离心10min，小心吸弃或倒出上清。沉淀加人75%冰冷乙醇150000r/min离心5min。如此离心洗涤1次～2次，特别小心地吸弃或倒掉上清。
真空或37℃温箱或室温干燥。
加TE缓冲液20μL，溶解后，取3μL~8μL用PCR扩增，或放一20℃保存。除4.1.2列项中第三项处理方法外，亦可在蛋白酶K消化处理标本并经离心处理后，吸取上清液，经95℃～97℃水浴或煮沸10min后，高心取上清液，作PCR扩增。B.4.1.5
杂质较多时，还可继续经酚：三氯甲烷抽提后，离心取上清液，作PCR扩增煮沸法
动物脏器标本
应如下处理：
a）取被检动物肝、脾等组织10mg100mg，加灭菌生理盐水或蒸馏水500μL~1000μL研磨；8
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代替SN/T1280—2003
国境口岸鼠疫检验规程
Inspection codes for plague at frontier port2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1280—2003《国境口岸鼠疫检验规程》。本标准与SN/T1280—2003相比，主要技术变化如下：修改了规范性引用文件：“GB15991一1995”修改为“WS279”SN/T1280—2014
修改了要求：“专用实验室”修改为“卫生部《人间传染的病原微生物名录》规定的相应等级的生物安全实验室”，“条件具备用聚合酶链式反应（PCR）\修改为“用鼠疫特异抗原和抗体检测及基因检测”；
一修改了检验程序：
一修改了结果判定：
一修改了附录A、附录B、附录D附录B修改为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局和中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局本标准主要起草人：王东胜、乔舜、魏怀波、田丽、孟东平、孙利。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1280—2003。I
1范围
国境口岸鼠疫检验规程
SN/T1280—2014
本标准规定了国境口岸鼠疫检验的实验室生物安全规范、材料的采集、保存和运输、检验程序、结果判定。
本标准适用于国境口岸检验检疫工作中鼠疫的实验室检验2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。WS279鼠疫诊断标准
《人间传染的病原微生物名录》（卫生部）《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》（卫生部）3要求
鼠疫菌检验应在卫生部《人间传染的病原微生物名录》规定的相应等级的生物安全实验室内进行。检验人员应熟悉并遵守实验室管理制度、自身防护制度、技术操作规程等，见附录A。应两人以上同时进人实验室工作及时准确做好检验的各项实验记录3.5用鼠疫特异抗原和抗体检测（见WS279）及基因检测（见附录B)，进行口岸鼠疫的快速初步检验。4准备
设备和材料
天平：离心机、离心管；震荡器；温箱；显微镜：解剖盘、剪刀、短镊子：带盖白瓷缸；接种棒、白金耳：平血；灭菌小试管；1mL注射器：血凝微量板、稀释棒；定量滴头。4.2培养基和试剂
4.2.1鼠疫菌检验
95%乙醇；生理盐水；革兰氏、美兰染液：溶血（0.1%）赫氏琼脂平板培养基（培养基的制备见附录C）：龙胆紫［（1：10万）（1：20万）亚硫酸钠（0.025%）平板或龙胆紫溶血平板培养基：鼠疫噬菌体。4.2.2间接血凝试验（IHA）
4.2.2.12.5%F1抗原致敏血球。用细菌凝集效价为1：320以上的鼠疫全菌免疫血清滴定、血凝滴度应不低于1：40000；与假结核血清交叉滴定、滴度应不高于1：5；符合上两项规定的致敏血球为合格诊断用血球，每一鼠疫季节开始前或更换致敏血球批号时应进行上述滴定。1
SN/T1280—2014
1%正常免血清盐水。
2.5%单宁酸血球。
F1抗原液（50μg/mL~100μg/mL）。4.2.2.4
反向血凝试验（RIHA）
2.5%鼠疫抗体致敏血球；1%正常免血清盐水；鼠疫诊断血清。疑似鼠疫材料的采取、保存和运输5
按附录D的规定执行。
检验程序
鼠疫菌检验
6.1.1镜检
6.1.1.1.1
取材腺、肝、脾、肺、心，用切面在洁净玻片上压印或涂成薄片；或取骨髓、脑脊液及各种渗出液、痰，用接种环直接涂片。至少2张，室温下自然干燥，人体及自死动物材料至少涂4张片。2用95%乙醇或乙醇、乙醚各半配制的固定液固定10min，取出自然干燥。6.1.1.1.2
涂片进行革兰氏染色和美兰染色。6.1.1.3镜检
发现革兰氏阴性、两极浓染、两端钝圆的短小球杆菌，为符合鼠疫菌的特点。注意腐败材料或陈旧材料菌本身形态的变化。
细菌培养
按WS279的规定执行。
3鼠疫噬菌体裂解试验
按WS279的规定执行。
6.1.4动物接种
按WS279的规定执行。
血清学检验
间接血凝试验（IHA）
按WS279的规定执行。
反向血凝试验（RIHA）
按WS279的规定执行。
结果判定
鼠疫菌判定依据
按WS279的规定判定。
间接血凝试验的结果判定
按WS279的规定判定。
反向血凝试验的结果判定
按WS279的规定判定。
SN/T1280—2014
SN/T1280-2014
A.1导言
附录A
（规范性附录）
鼠疫实验室生物安全规范
由于鼠疫菌特别危险的性质，对鼠疫实验室有不同于一般细菌学实验室的特殊要求。鼠疫菌检验应在卫生部《人间传染的病原微生物名录》规定的相应等级的生物安全实验室内进行。A.2鼠疫实验室结构
A.2.1普通鼠疫实验室
实验室宜设立于独立的建筑物，结构相对密闭，由洁净区、普通实验室、缓冲区和强毒操作区组成，强毒操作区应安装带有除菌滤器的通风排气系统，污水应通过处理才能进入公共污水系统，采取防鼠防虫措施，防止啮齿类动物或昆虫审人室内，并严防实验动物外审。实验室的强毒区域内，设动物解剖室、细菌培养室、实验动物接种及饲养室，如果有条件可增设疑似材料接检室（接受材料、检蚤等）。这些工作室互相联系成为一个系统。在实验室的强毒区和其他辅助区域之间，设双重缓冲间、消毒间和出人实验室的更衣间。在强毒区域之外，宜根据需要设置普通实验室和其他建筑以提供技术支持，如培养基制备、镜检、血清学试验、高压、洗涤以及健康动物饲养间等A.2.2生物安全Ⅱ级实验室
在普通鼠疫实验室内配备Ⅱ级以上生物安全柜，即为生物安全Ⅱ级实验室，可简化进人实验室的着装要求。
A.2.3生物安全Ⅱ级实验室
在生物安全Ⅱ级的基础上，实验室维持恒定的负压，保证进出实验室时空气流向为由外向内，保证实验室内空气流向自上而下，无横向气流和紊流，并维持必要的洁净度，即达到生物安全Ⅲ级标准。适用于特别危险，容易产生气溶胶的实验操作，并具备较强的抗御事故能力。A.3鼠疫实验室工作制度
A.3.1进行鼠疫实验室操作时，需有两名工作人员同时进人。A.3.2非实验室工作人员一律禁止进人鼠疫强毒实验区。A.3.3实验室内禁止吃东西、吸烟和喧哗。A.3.4全体工作人员经鼠疫正规培训后方可进行强毒操作，并严格按照鼠疫菌强毒操作规程和其他国家标准进行各项实验，准确记录实验结果。A.3.5工作人员要熟知实验室常规感染途径和掌握个人防护措施A.3.6建立工作人员基础医学检测卡片。A.3.7工作人员如有皮肤损伤、发热、感冒、抵抗力低下和妊娠者，不应进入强毒实验区。4
A.3.8工作完毕，检查实验室水、电、防火设备，打开防盗报警装置。A.4鼠疫实验室着装要求
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A.4.1普通鼠疫实验室按下列顺序穿着防护服装：穿内隔离衣裤；穿防蚤袜及长筒胶靴，戴白帽和小口罩（两鼻翼与小口罩间用适量脱脂棉填充）：扎三角头巾及帽子；穿后开口的白大衣（偏衫）；戴20层～24层的纱布大口罩：戴医用手术手套，必要时外面套细线手套：进行已知毒菌动物接种、解或菌种开封等工作应戴有机玻璃面罩或眼镜，以防操作时细菌溅人眼内或脸部裸露皮肤：或在无菌罩中进行。A.4.2在配备生物安全柜的生物安全Ⅱ级和Ⅲ级实验室内，着装可简省至外科手术着装水平，即带一次性口罩，帽子，穿后开口的白大衣，戴医用手术手套，普通套鞋：也可使用一次性服装。用后高压灭菌。耐用服装也应定期高压灭菌。
A.5鼠疫生物安全操作规程
A.5.1凡是鼠疫材料及疑似材料的检验或鉴定工作，均需在鼠疫实验室内进行，在开始工作之前，工作间用紫外线照射消毒灭菌30min。A.5.2进人鼠疫强毒实验区后，不应用手触及身体的任何部位A.5.3进行细菌分离、培养或其他操作时，生物安全Ⅱ级和Ⅲ级实验室应在生物安全柜中进行；普通实验室应在无菌罩中进行。
A.5.4工作之前，生物安全柜的台面用75%乙醇消毒灭菌，无菌罩的台面用消毒液灭菌，并铺放浸有消毒液的毛巾。
A.5.5进行细菌操作时，接种环应在酒精灯内焰中燃烧，避免菌液飞溅。A.5.6稀释菌液时，将吸管插入试管或烧瓶底部，用吸球缓慢一次性打击菌液，避免产生气泡或气溶胶。
A.5.7切勿从吸管中打出最后一滴菌液，而产生爆破性气溶胶。A.5.8实验中需使用酚、三氟甲烷等腐蚀性试剂时，在乳胶手套外加一次性塑料手套。A.5.9离心时，应使用双盖封闭式离心机和全封闭试管，每管离心液总量低于最高容量一个刻度单位；平衡时不得有菌液渗漏到套管中·离心机使用后立即用消毒液擦洗消毒。A.5.10鼠疫强毒操作不得使用均化器，以免菌液外逸。实验室中所需要的其他物品应从传递窗送人。A.5.11
A.5.12随时用消毒液浸泡手套，如有操作区污染，立即用消毒液清洗处理。如有防护服污染或手套破裂，立即置消毒液中浸泡5min~10min后更换。A.5.13进行动物实验时，勿用手直接对接或拨开注射器和针头，以免划破皮肤或无意接种。A.5.14切勿在空气中直接排放含有菌液的注射器内的气泡，以免形成气溶胶。A.5.15接种过的实验动物应该放在定期消毒、封闭式实验动物室内，并有明确的实验记录。A.5.16每次操作规程结束后，应清理工作面，普通实验室台面用消毒液，生物安全柜台面用75%乙醇抹拭。所有物品应该归位，关闭生物安全柜。A.6污染处理及消毒
强毒实验区内的各项工作记录和其他物品，需经消毒液浸泡或高压灭菌后，方可拿出实验室。A.6.1
A.6.2实验用试管，吸管及其他器械，经消毒液浸泡24h，高压灭菌后，方可拿出实验室。A.6.3细菌培养物、实验动物户体及污物，经高压灭菌后，方可拿出实验室，进行进一步处理。5
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A.6.4工作完毕，检查各仪器设备是否恢复零位或正常运行，做好使用记录。5更衣顺序：在普通鼠疫强毒实验室内，工作结束后将手和脚（着穿胶靴和手套）在消毒液内浸A.6.5
1min～3min，然后在消毒间按上述相反顺序脱下（手术手套在偏衫后脱），头巾或白大衣高压灭菌，医用手术手套和纱布口罩用0.1%新洁而灭消毒，如用滤材口罩可用环氧乙烷密闭灭菌，面罩或眼镜用酒精棉球消毒。最后洗手并用75%乙醇棉球擦面部裸露部位，用3%硼酸水漱口后，方可离开实验室。A.6.6
鼠疫实验室内，未经消毒的污水不应直接排人公共下水系统。A.7意外事故处理
一般实验室事故，如培养物跌落破碎等，立即在污染区域喷洒消毒液，待消毒液彻底渗透污染物A.7.1
后，再行清理。清理时特别注意避免破碎玻璃等锐利物体割伤皮肤。清理出来的污染物品尽早高压灭菌，清理后的场所再用消毒液及75%乙醇擦拭后，方可重新开始工作。A.7.2可能造成人身伤害的实验室事故，如污染物溅落在身体表面，割伤、烧伤、烫伤，感染动物咬伤等情况时，立即进行紧急处理：未破溃的皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒、酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗：事故的情况报告实验室主任，根据感染鼠疫的可能，决定预防性使用链霉素或其他对鼠疫有效的抗生素，并对受伤害者进行隔离观察。判明确实感染鼠疫时，按传染病防治法的规定报告。A.7.3工作人员进人强毒区工作后，7日内发生不明原因咳嗽、发烧和可疑为鼠疫的症状，应及时向实验室主任报告，不得擅自到医院就诊。不能排除实验室感染时，按鼠疫进行隔离观察和治疗。只有在排除鼠疫感染情况下方可到医院就医。6
B.1导言
附录B
（规范性附录）
鼠疫的PCR技术检测
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PCR（聚合酶链式反应）技术是用分子生物学技术，在体外模拟生物体内环境，对特定的DNA进行体外扩增。用这样的方法对鼠疫菌进行检测，操作简单、快速、特异性强、灵敏度高。将这一先进的检验技术应用到国境口岸的鼠疫检测工作中，可以提高鼠疫诊断的准确性和灵敏度，提高口岸鼠疫监测水平，对国境口岸鼠疫检测的快速诊断有一定的实用性。B.2设备和材料
高速台式离心机；水浴锅：培养箱；pH计：双蒸水发生器；微波炉；匀浆器；微量取液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)；PCR仪，电泳仪；凝胶成像分析系统或紫外线透射仪。B.3试剂配制
B.3.11mol/LTris100mL
Tris12.1g双蒸水90mL，加盐酸5mL左右，调pH=8.0，再加双蒸水至100mL，高压灭菌。B.3.20.5mol/LEDTA100mL
EDTA18.6g双蒸水90mL，加氢氧化钠约2g，在磁力搅拌器上搅拌，再用10mol/L氢氧化钠滴加调pH=8.0，再加双蒸水至100mL，高压灭菌。（EDTA在加人氢氧化钠、pH近8.0时才全部溶解）。B.3.3TEC10mmol/LTris.1mmol/LEDTA.pH=8.0)100mL1 mol/L Tris(pH=8.0)
0.5mol/LEDTA(pH=8.0)
加双蒸水至100mL.高压灭菌。
B.3.4蛋白酶K裂解液（0.5%SDS、300μg/mL蛋白酶K、50μg/mLRNA酶A)2mL10%SDS
20mg/mL蛋白酶K
10mg/mLRNA酶A
加TE(pH=8.0)至2mL。
10%SDS
SDS（十二烷基磺酸钠）
双蒸水
30μL（冷冻保存）
10 μL
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B.3.610mol/L氢氧化钠100mL
氢氧化钠www.bzxz.net
双蒸水
B.3.7加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖）100mL溴酚蓝
加双蒸水至100mL，4℃保存。
B.3.8溴化乙锭保存液（10mg/mL）溴化乙锭
双蒸水
B.4PCR模板的制作
B.4.1蛋白酶K裂解法
适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳。如组织细胞（包括石蜡包埋组织）绒毛、B.4.1.1
血液（血清、血浆、全血）、局部分泌物、尿、粪便B.4.1.2粪便、分泌物、痰液、组织块、右蜡包理组织，用蛋白酶长-消化前，还需作预处理，其方法有离心去掉杂质、脱蜡。
B.4.1.3对动物标本、临床标本或经预处理的标本应采取如下步骤：分别取10mg~100mg.各加蛋白酶K裂解液50μL~500μL，研磨或混勾。a）
置56℃水浴0.5h一1h，或37℃过夜。短暂离心，使盖上或壁上蒸发冷凝的水分沉至管底。各加等体积的饱和酚.颠倒混勾10min，1o000r/min离心10min，取上清液置新离心管。如此抽提1～2次。小心不要吸人沉淀和酚。加等体积的三氯甲烷，颠倒混勾10min，10000/min离心10min，取上清液置新离心管。如d)
此抽提1次～2次。小心不要吸人下层主氯甲烷e)
加人2.5倍体积的冰冷无水乙醇（或加等体积的异内醇），一20℃放置20min～3h。取出后14000r/min离心10min，小心吸弃或倒出上清。沉淀加人75%冰冷乙醇150000r/min离心5min。如此离心洗涤1次～2次，特别小心地吸弃或倒掉上清。
真空或37℃温箱或室温干燥。
加TE缓冲液20μL，溶解后，取3μL~8μL用PCR扩增，或放一20℃保存。除4.1.2列项中第三项处理方法外，亦可在蛋白酶K消化处理标本并经离心处理后，吸取上清液，经95℃～97℃水浴或煮沸10min后，高心取上清液，作PCR扩增。B.4.1.5
杂质较多时，还可继续经酚：三氯甲烷抽提后，离心取上清液，作PCR扩增煮沸法
动物脏器标本
应如下处理：
a）取被检动物肝、脾等组织10mg100mg，加灭菌生理盐水或蒸馏水500μL~1000μL研磨；8
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