SN/T 1474-2014.Quarantine protocol for infectious haematopoietic necrosis.
1范围
SN/T 1474规定了传染性造血器官坏死病临床症状、病毒分离、逆转录聚合酶链式反应、酶联免疫吸附试验中和试验、间接免疫荧光试验的检测方法。
SN/T 1474适用于传染性造血器官坏死病的诊断、监测和检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法
GB/T 18088出 人境动物检疫采样
GB 19489实验室生物安全通 用要求
3概述
传染性造血器官坏死病(Infectioushaematopoieticnecrosis,IHN)是由传染性造血器官坏死病病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)感染鲑、鳟鱼类后引起死亡的一种病毒性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列人水生动物疫病名录,我国将其列为二类动物疫病(参见附录A)。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CPE:细胞病变效应(cytopathic effect)
dNTPs:脱氧核糖核苷酸(deoxynucleotide triphosphates)
DEPC:焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate) ;
EPC:鲤鱼上皮瘤细胞系(epithelioma papulosum cyprini)
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)
ELISA:酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay)

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1474—2014
代替SN/T1474—2004
传染性造血器官坏死病检疫技术规范Quarantine protocol for infectious haematopoietic necrosis2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1474—2014
本标准代替SN/T1474一2004《传染性造血器官坏死病毒逆转录聚合酶链式反应操作规程》。本标准与SN/T1474一2004相比，除编纤性修改外，主要技术变化如下：修改了标准的名称；
增加了临床症状、病毒分离、中和试验、间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验；删除了原标准的套式逆转录聚合酶链式反应方法，替换为逆转录聚合酶链式反应方法。本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（2012年版）第2.3.4章，主要修改如下：
原文中*Diseaseinformation”内容经修改简缩后作为本标准附录A；删除了原文第5节中检测方法的选择依据和第6节传染性造血器官坏死病无疫区的相关内容。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、河南省水产技术推广站。
本标准主要起草人：贾鹏、何俊强、杨俊兴、杨雪冰、郑晓聪、于力、王津津、刘、花群义、史秀杰、兰文升、陈兵、王红英。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1474—2004。
1范围
传染性造血器官坏死病检疫技术规范SN/T1474—2014
本标准规定了传染性造血器官坏死病临床症状、病毒分离、逆转录聚合酶链式反应、酶联免疫吸附试验、中和试验、间接免疫荧光试验的检测方法。本标准适用于传染性造血器官坏死病的诊断、监测和检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T18088出入境动物检疫采样
GB19489实验室生物安全通用要求3概述
传染性造血器官坏死病（Infectioushaematopoieticnecrosis，IHN）是由传染性造血器官坏死病病毒（Infectioushaematopoieticnecrosisvirus，IHNV）感染鲑、鳟鱼类后引起死亡的一种病毒性传染病，被世界动物卫生组织（OIE)列人水生动物疫病名录，我国将其列为二类动物疫病（参见附录A）。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect）dNTPs：脱氧核糖核苷酸（deoxynucleotidetriphosphates）DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）；EPC：鲤鱼上皮瘤细胞系（epitheliomapapulosumcyprini）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）ELISA：酶联免疫吸附实验（enzyme-linkedimmunosorbentassay）FHM：肥头鲤细胞系（fatheadminnow）FBS：胎牛血清（fetalbovineserum）FITC：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate）HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid]HRP：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase）IHN：传染性造血器官坏死病（infectioushaematopoieticnecrosis）IHNV：传染性造血器官坏死病毒（infectioushaematopoieticnecrosisvirus）IPNV：传染性胰脏坏死病毒（infectiouspancreasnecrosisvirus）1
SN/T1474—2014
RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）5仪器和设备
组织研磨器或无菌研钵。
恒温培养箱。
倒置荧光显微镜。
PCR扩增仪。
水平电泳仪。
凝胶成像仪。
酶标仪。
普通冰箱和一80℃超低温冰箱。5.9
降温离心机。
微量移液器。
二级生物安全柜。
剪刀、镊子、离心管、PCR管和细胞培养器血等耗材。试剂和材料
水：符合GB/T6682中一级水的规格。6.1
IHNV参考株：由指定单位提供。细胞系：FHM、EPC。
6.475%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。6.5TaqDNA酶：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。6.6
dNTPs：含dCTP.dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L。6.7
RNA酶抑制剂：一20℃保存，避免温度剧烈变化。逆转录酶：一20℃保存，避免温度剧烈变化6.9
RT-PCR用引物，浓度为20mmol/L.序列如下：F1:5'-AGAGATCCCTACACCAGAGAC-3R1:5-GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAA-3扩增IHNV糖蛋白基因中大小为693bp的片段。6.10抗体：抗IPNV血清、抗IHNV血清和单克隆抗体。6.11
异硫氰酸荧光素（FITC)：一20℃避光保存。6.12
TritonX-100和Tween-20。
HRP标记的抗鼠或抗免抗体。
临床症状
病鱼初期表现为游动迟缓、昏睡，有时表现为狂游、转圈游动等。病鱼体色发黑、腮丝苍白、眼球突出、腹部膨胀、鳍基充血，不透明的粘液状管型粪便悬挂于肛门。剖解可见病鱼肝脏、脾脏和肾脏等器官苍白贫血，胃内空虚，肠道等器官有出血点。存活下来的鱼常出现脊柱畸形。2
8采样和制样
8.1样品和靶器官的采集
SN/T1474-2014
样品包括活的、发病的、濒死的鱼和鱼卵，采样数量按照GB/T18088规定执行。体长小于4cm的鱼苗取整条鱼；4cm～6cm的鱼苗取肾脏在内的所有内脏；体长大于6cm的鱼取脑、脾和肾，成熟雌鱼还需取其卵巢液；鱼卵仅取卵膜。由于肝脏和胃肠中的酶易将IHNV降解，尽量避免采集。实验室检测条件应符合CB19489的规定。
8.2小样的制备及处理
最多以10条鱼为一个小样，每个小样至少取0.5g组织。对组织称量后，用无菌手术剪刀将其剪碎并研磨成糊状，用细胞培养液1（见B.1）按照10mL/g比例将研磨后的组织重悬（将此组织液称为1：10稀释度）。卵巢液不必匀浆，用细胞培养液1将其稀释2倍。15℃孵育4h或4℃孵育过夜。4℃、12000r/min离心15min，取上清用于后续实验。9诊断方法
9.1病毒分离
9.1.1单层细胞的制备
用胰酶一EDTA消化液（见B.3）消化EPC或FHM细胞后，用细胞培养液2（见B.2)重悬细胞，加人细胞培养板，25℃培养，使细胞生长至单层。9.1.2中和IPNV
用细胞培养液2将1：10稀释度组织上清液连续稀释至1：100和1：1000。将1：10、1：100和1：1000组织稀释液分别与适当浓度的抗IPNV血清等量混合，15℃孵育1h。抗IPNV血清中和效价不低于2000。若样品来自于IPNV无疫区或确定未感染IPNV，此步骤可以省略。9.1.3接种细胞
将以上3个不同稀释度的组织上清液分别接种至新鲜的EPC或FHM单层细胞，每个稀释度至少3孔，每孔中组织上清液与细胞维持液的比例为1：10。同时，设立阳性对照和空白对照，阳性对照孔中接种IHNV参考株，空白对照孔中接种相同体积细胞培养液2。15℃培养，倒置显微镜下连续观察7d~10d。
9.1.4盲传
首次接种细胞7d～10d后未出现CPE，需进一步盲传。将细胞培养物反复冻融3次，收集至无菌离心管。4℃、7000r/min离心15min或用直径0.45μm滤器滤除细胞碎片，取上清液。用细胞培养液2将上清液稀释至1：10和1：100，将上清液、1：10和1：100稀释液接种于新鲜的EPC或FHM单层细胞，至少3孔，组织上清液接种量与孔内细胞培养液比例为1：10。同时，设立阳性对照和空白对照。15℃培养，倒置显微镜下连续观察7d～10d。9.1.5结果判定
9.1.5.1IHNN感染EPC或FHM细胞后，可出现典型CPE，表现为局部细胞变圆、皱缩和裂解，以此3
SN/T1474—2014
为中心周围细胞的病变范围扩大，形成明显空斑，最终细胞呈拉网状直至全部悬浮脱落。9.1.5.2若样品首次接种细胞或盲传后细胞出现典型CPE，则判定为阳性。若样品盲传后细胞仍未观紧到CPE，则判定为阴性。
9.1.5.3若阳性对照或阴性对照不成立，换用敏感细胞，需重新实验。9.2逆转录聚合酶链式反应（RT-PGR）9.2.1对照设立
从核酸抽提起，每步实验均需要设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用IHNV的病毒悬液作为阳性对照，用正常细胞悬液作为阴性对照，以DEPC水代替样品作为空白对照。9.2.2核酸抽提
取细胞培养物250μL至无RNA酶的1.5mL离心管，加人600μLTrizol溶液，剧烈振荡混勾后，室温放置5min。加200μL三氯甲烷，盖紧盖子，剧烈摇动15s，室温放置3min。4℃、12000r/min离心15min。吸取上清液至新的无RNA酶离心管，加人500μL预冷的异丙醇，上下翻转混匀，室温放置10min。4℃、12000r/min离心15min。缓慢弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去除。加人1000μL预冷的75%乙醇缓慢倒转洗涤沉淀。4℃，12000r/min离心15min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀5min~10min。加人20μLDEPC水，4000r/min离心5s，室温溶解10min。一80℃保存备用。
在实验过程中，可采用同等效果的商业化RNA抽提试剂盒代替以上方法。9.2.3反应体系
10XPCRbuffer(见B.4)5μL25mmol/LMgCl25μL,2.5mmol/LdNTPs4μL，20μmol/L引物F1和R1各2.5μL，5U/μLDNA聚合酶0.5μL，5U/μL逆转录酶1μL，40U/μLRNA酶抑制剂1μL，总RNA5μL，加DEPC水至总体系50μL。每个反应体系设置两个平行。9.2.4反应条件
50℃逆转录30min95℃预变性2min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环：72C再延伸7min；4℃保存。9.2.5琼脂糖电泳
用TBE电泳缓冲液（见B.5）配制浓度为1.5%的琼脂糖（含0.5ug/mL溴化乙锭，见B.6）凝胶板。将其放人水平电泳槽，使电泳缓冲液没过胶面。将5μLPCR产物与1μL6×上样缓冲液（见B.7）混勾后加人样品孔，5V/cm电泳约40min，当溴酚蓝到达凝胶板3/4处时停止，置于凝胶成像仪观察结果。电泳时，设立DNA标准分子量对照。9.2.6测序
对RT-PCR扩增产物进行基因测序，并将测序结果与参考序列（参见附录C)进行比对。9.2.7结果判定
9.2.7.1阳性对照可扩增出一条大小为693bp的特异性条带，阴性对照和空白对照无大小为693bp的条带。若阳性对照、阴性对照或空白对照不成立，则需要重新实验。9.2.7.2若被检样品扩增出大小为693bp的特异性条带，且基因测序结果正确，则判定为阳性。若被4
检样品未扩增出大小为693bp的条带，则判定为阴性9.3酶联免疫吸附试验（ELISA）9.3.1对照设立
SN/T1474—2014
取已知含有IHNV参考株的病毒悬液作为阳性对照，未感染病毒的细胞悬液作为阴性对照。9.3.2实验步骤
9.3.2.1用PBS（见B.8）将抗IHNV血清或单克隆抗体稀释至适当工作浓度，加至酶标板，每孔200μL，4℃孵育过夜。
9.3.2.2弃包被液，用PBST（见B.9）漂洗4次。9.3.2.3每孔加200uL5%脱脂乳封闭液（见B.10），37℃孵育1h。9.3.2.4弃封闭液，PBST漂洗4次。9.3.2.5向被检病毒悬液中加入TritonX-100，加人量为总体的2%，充分混匀。9.3.2.6用PBST分别将被检病毒悬液、阳性对照、阴性对照做2倍系列稀释，并加入酶标板，每孔100μL，20℃孵育1h。
9.3.2.7弃病毒悬液，PBST漂洗4次。9.3.2.8加100μuL抗IHNV血清或抗IHNV单克隆抗体，37℃孵育1h。该步骤使用的抗体所针对的IHNV抗原表位应不同于包被用抗体。9.3.2.9PBST漂洗4次。将HRP标记的抗体稀释至工作浓度并加人酶标板，每孔100uL，20℃孵育1h。
9.3.2.10用PBST漂洗4次。每孔加100μL显色液，避光显色。9.3.2.11当阳性对照开始显色，而阴性对照未显色时，加2mol/L硫酸溶液终止反应，每孔200μL。9.3.2.12将酶标板置于酶标仪，450nm波长测定OD值（A45o值）在实验过程中，可以采用同等效果的商业化ELISA试剂盒代替以上方法。9.3.3结果判定
阳性对照孔A45值（P）与阴性对照孔的A5o值（N）之比不小于5.0（即P/N≥5.0），表明对照成立。当被检样品孔A45值（T）与阴性对照孔的A45值（N）之比大于或等于5.0（即T/N≥5.0）判定为阳性，否则判定为阴性。
9.4中和试验
9.4.1对照设立
9.4.1.1·阳性对照组：用细胞培养液2将IHNV参考株病毒悬液稀释至200TCIDse，分别与抗IHNV血清和细胞培养液2等体积混合。9.4.1.2阴性对照组：将其他鱼类病毒悬液作为阴性对照，分别与抗IHNV血清和细胞培养液2等体积混合。
血清毒性对照组：取工作浓度的抗IHNV血清与细胞培养液2等体积混合。9.4.1.3
9.4.1.4空白对照组：等体积细胞培养液2。9.4.2
实验步骤
当9.1中被检样品接种细胞出现明显CPE后，将其反复冻融3次，收集细胞培养物，4℃、SN/T1474—2014
2000r/min离心15min或用直径为0.45μm的滤器过滤除去细胞碎片。9.4.2.2将被检样品的细胞培养物连续倍比稀释至10-2～10-4。9.4.2.3将稀释后的被检样品细胞培养物分别与抗IHNV血清和细胞培养液2等体积混合。15C感作60min。
9.4.2.4将被检样品组接种至24孔细胞培养板，每个稀释度2孔，每孔50μL。将对照组接种于24孔细胞培养板，阳性对照组2孔、阴性对照组2孔、血清毒性对照组2孔、空白对照组2孔。9.4.2.515℃培养，显微镜下连续观察2d~5d。9.4.3结果判定
9.4.3.1阳性对照组，细胞产生CPE明显延迟或不出现CPE；阴性对照组细胞产生CPE，抗体毒性对照组和空白对照组细胞生长正常。若阳性对照组不成立，或抗体毒性对照组和空白对照组细胞生长异常，需重新实验。
9.4.3.2接种被检样品细胞孔细胞产生CPE明显延迟或不出现CPE则判定为阳性，否则判定为阴性。9.5间接免疫荧光试验
9.5.1制样
9.5.1.1细胞培养物：用细胞培养液2制备6孔细胞培养板或飞片。当单层细胞密度生长至80%孔底面积（生长时间不超过24h），将病毒悬液（由9.1出现CPE的细胞培养物制备）接种于单层细胞或飞片，每孔病毒悬液接种量与细胞培养液的比例为1：10。15℃培养24h。弃细胞培养液2,用PBS轻轻漂洗细胞1次。
9.5.1.2组织涂片：将鱼体内血液排干，取其肾脏并剪碎，置于载玻片上或细胞培养板孔内，制备成涂片。室温放置20min，自然风干。9.5.2对照设立
9.5.2.1阳性对照：将含有IHNV参考株的病毒悬液稀释至5000PFU/mL10000PFU/mL，接种单层细胞，病毒悬液接种量与细胞培养液2的比例为1：10。9.5.2.2阴性对照：等体积细胞培养液2。9.5.3
操作方法
用预冷的固定液（见B.11）轻轻漂洗细胞3次。加500μL固定液，室温固定15min。缓慢弃固定液，室温风干30min。如不立即使用可置于一20℃存放待用。用PBST将IHNV单克隆抗体稀释至适当工作浓度。用PBST缓慢漂洗4次，每孔300μL。9.5.3.4
彻底弃除PBST，加IHNV单克隆抗体，每2cm细胞加250μL。置于湿盒内，37℃孵育1h9.5.3.5
9.5.3.6用PBST缓慢漂洗4次，每孔300μL。9.5.3.7
彻底弃除PBST，加人适当工作浓度FITC标记的荧光抗体，置于湿盒内，37℃孵育1h。用PBST缓慢漂洗4次，每孔300μL。9.5.3.9
直接将细胞培养板置于荧光显微镜下，或用pH8.5甘油封片后置于在荧光显微镜下观察结果。
结果判定
阳性对照组可见清晰的绿色荧光。阴性对照组没有任何荧光或仅有微弱绿色背景荧光。若阳9.5.4.1
SN/T1474—2014
性对照组未见清晰的绿色荧光，或阴性对照组出现异常绿色荧光，则对照不成立，需重新实验。9.5.4.2若被检样品组可见清晰的绿色荧光，则判定为阳性；若被检样品组没有任何荧光或仅有微弱绿色背景荧光，则判定为阴性。
综合判定
10.1满足以下任何一条均可判定为IHN可疑：样品为IHNV易感鱼类且具有典型临床症状。a）
样品为IHNV易感鱼类且具有典型、明显的组织病理变化。病毒分离方法可见明显细胞病变。c）
RT-PCR,ELISA、间接免疫荧光试验和中和试验中，任一种方法检测结果为阳性。在9.1的基础上，满足以下任何一条均可判定为，IHN阳性：病毒分离出现典型、明显细胞病变，且用RT-PCR、ELISA、中和试验和间接免疫荧光试验中的a)
任一种方法检测细胞培养物为阳性。b)
用RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光试验和中和试验中的一种方法检测为阳性。SN/T1474—2014
附录A
（资料性附录）
传染性造血器官坏死病
传染性造血器官坏死病（Infectioushaematopoieticnecrosis，IHN）是一种由传染性造血器官坏死病毒（Infectioushaematopoieticnecrosisvirus，IHNV）引起鲑、鳟鱼类发病，以出血、腹部膨胀等临床症状为特征的一种病毒性传染病。该病传染性强，致死率高，一且爆发将对鲑、鱼类养殖业造成巨大经济损失，死亡率达90%～95%。因此，世界动物卫生组织（OIE）将其列人《水生动物疾病诊断手册》（2012版），我国农业部将之列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》（2008）二类动物疫病。
IHNV作为IHN的病原，是一种基因组大小为11131bp、不分截段、单股负义RNA病毒，属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）粒外弹状病毒属（Novirhabdovirus）。基因组主要编码六个结构蛋白，核蛋白（Nucleocapsidprotein，N）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、基质蛋白（Matrixprotein，M）、糖蛋白（Glyco-protein，G）、非结构蛋白（Non-virionprotein，NV）和RNA依赖的RNA聚合酶（Polymeraseprotein，L）。其中，编码糖蛋白的基因与病毒抗原表位、病毒受体等有关，也是IHNV遗传进化分析常用的目标基因序列。以糖蛋白基因序列中303bp片段为基础，进行遗传进化分析，可将IHNV分为UM、L和JRt基因型。IHNV基因型和地域分布有密切关系。M基因型主要分布于欧洲国家，L和U基因型主要分布于美洲和亚洲地区，JRt基因型主要分布于日本，韩国等亚洲地区。值得注意的是，日本地区IHNV分离株包括两种基因型，基因型与时间关系密切。20世纪70年代前分离的IHNV毒株属于U基因型；20世纪70年代后分离的IHNV毒株为JRt基因型。我国IHNV分离株主要属于JRt基因型。IHN的流行病学。带毒的、发病的鱼及的主要传染源，垂直传播是其主要传播途径，鲑鱼及少数其他种类鱼均是其易感动物。1950年，首次在美国华盛顿红大麻哈鱼卵孵化中心发现该病，随后陆续从加利福尼亚州大鳞大麻哈鱼的孵化场等多地发现该病，但仅局限于北美洲地区，被认为是一种只感染鲢鱼的地方流行性疾病。然而，IHN的传播远超出人们的预料。该病随着隐形感染的鲑鱼及鱼卵迅速传播至世界多个地区。1977年～1987年，法国、德国、意大利、西班牙、克罗地亚、俄罗斯等欧洲国家以及日本、韩国和中国台湾地区陆续出现IHN相关报道。1987年，首次在我国东北地区发现疑似IHN。1990年，在辽宁省本溪市某虹鳟养殖场报道了我国第一例IHN，该地区于1983年先后从日本、美国和俄罗斯引进高白鲑、虹鳟和大麻哈鱼。IHNV对水温敏感，当水温低于14℃时极易爆发：无论海水养殖还是淡水养殖的鲑鱼对IHNV均易感，包括虹（Oncorhynchusmykiss）、大鳞大马哈鱼（O.tshawytscha）、红大马哈鱼（O.nerka）、狗鱼（O.gorbuscha）、银大马哈鱼（O.kisutch）、大西洋鲑鱼（Salmosalar）七彩鲑（S，trutta）、湖红点鲑（Salvelinusnamaycush）、日本淡水鲢（Plecoglossusal-tivelis）。一些非鲑科鱼类对IHNV也易感，包括鲱鱼（Clupeapallasi）、大西洋鳕鱼（Gadusmorhua）、美洲白鲜（Acipensertransmontanus）、白斑狗鱼（Esorlucius）、海鲈鱼（Cymatogasteraggregata），幼鱼对IHNV的敏感性高于成鱼。
诊断和检测过程中，濒死的、发病的和活的、鳟鱼及其鱼卵均可作为检测对象。若同一池塘养殖包括虹鳝在内的多种鱼类，仅采集虹即可，当没有虹鳟，则每个品种的鱼均需采集。目前，病毒分离、分子生物学方法和免疫学方法已经应用于IHNV检测。病毒分离结合RT-PCR方法被称之为检测IHN的“黄金标准”。相比之下，由于不同实验室使用抗体等试剂的差异较大，免疫学方法得出的结果也有一定差异。因此，对免疫学方法的检测结果需做严格的复验。细胞培养液1
附录B
（规范性附录）
试剂及配制
SN/T1474—2014
含有1000IU/mL青霉素，800μg/mL链霉素和10%FBS的M199细胞培养液。按说明书配制M199细胞培养液，加人10%FBS以及相应浓度的抗生素，抽滤除菌，4℃保存。细胞培养液2
含有100IU/mL青霉素100μg/mL链霉素和10%FBS的Eagle'sMEM或M199细胞培养液。按说明书配制MEM或M199细胞培养液，加10%FBS以及相应浓度的抗生素，抽滤除菌，开放系统使用时，加人过滤除菌的HEPES，使其在培养液中的终浓度为0.02mol/L，4℃保存。B.3
胰蛋白酶-EDTA消化液
双蒸水
1moL/L盐酸调pH至7.7,过滤除菌后分装备用。Tag酶用10倍浓缩缓冲液（10xbuffer）B.4
Tris-HCl
TritonX-100
500mmol/LpH8.8
500mmol/L
TBE电泳缓冲液（5×TBE)）www.bzxz.net
加双蒸水至
1000mL
5mol/LHCI调pH至8。
SN/T1474—2014
溴化乙锭（EthidiumBromide，EB）用水配制成10mg/mL的浓缩液。用时每10mL电泳液或琼脂中加1μL。6×上样缓冲液
溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移人漠酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加人NaOH溶液1滴，调至蓝色。80.01mol/LPBS
Na.HPO412H2O
将上述成分依次溶解，去离子水定容至终体积为1000mL，调pH至7.2,121℃高压灭菌20min，室温保存。
Na2HPO.·12H20
双蒸水
Tween-20
播匀后，4℃保存。
封闭液
脱脂乳
摇匀后，4℃保存。
固定液
充分混勾后，室温放置，备用。10
1000mL
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