SN/T 1439-2013
基本信息
标准号： SN/T 1439-2013
中文名称：国境口岸埃博拉病毒分子生物学检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1439-2013.Molecular detection methods of Ebola virus at frontier ports.
1范围
SN/T 1439规定了国境口岸埃博拉出血热疑似病例血清标本中埃博拉病毒检测的生物安全要求,标本的采集、运输和保存,标本的处理,苏丹埃博拉病毒和扎伊尔埃博拉病毒常规RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测以及埃博拉病毒基因芯片法等检测方法。
SN/T 1439适用于国境口岸人出境人员埃博拉出血热疑似病例临床标本中的分子生物学检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1埃博拉出血热Ebola hemorrhagic fever; EHF
由埃博拉病毒(Ebolavirus,EBV)引起的一种急性出血性传染病。人主要通过接触病人或感染动物的体液、排泄物、分泌物等而感染,临床表现主要为发热、出血和多脏器损害。埃博拉出血热的病死率高,可达50%~90%。本病于20世纪70年代在非洲首次发现,主要在非洲的乌干达、刚果.加蓬、苏丹、科特迪瓦、利比里亚.南非等国家流行。
3.2埃博拉病毒Ebola virus
又称埃博拉出血热病毒,属丝状病毒科,为单股负链RNA病毒,是至今人类所知的最为恐怖的病毒之一,被世界卫生组织(WHO)列为潜在的生物战剂病原体。可分为四种不同亚型:扎伊尔埃博拉(EBO -Z)、苏丹埃博拉(EBO-S)、科特迪瓦埃博拉(EBO-C)和莱斯顿埃博拉(EBO-R)。前3种亚型可使人和灵长类动物发病。
4缩略语
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RT-PCR:反转录-聚合酶链反应
实时荧光RT-PCR:实时荧光反转录-聚合酶链反应
1范围
SN/T 1439规定了国境口岸埃博拉出血热疑似病例血清标本中埃博拉病毒检测的生物安全要求,标本的采集、运输和保存,标本的处理,苏丹埃博拉病毒和扎伊尔埃博拉病毒常规RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测以及埃博拉病毒基因芯片法等检测方法。
SN/T 1439适用于国境口岸人出境人员埃博拉出血热疑似病例临床标本中的分子生物学检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1埃博拉出血热Ebola hemorrhagic fever; EHF
由埃博拉病毒(Ebolavirus,EBV)引起的一种急性出血性传染病。人主要通过接触病人或感染动物的体液、排泄物、分泌物等而感染,临床表现主要为发热、出血和多脏器损害。埃博拉出血热的病死率高,可达50%~90%。本病于20世纪70年代在非洲首次发现,主要在非洲的乌干达、刚果.加蓬、苏丹、科特迪瓦、利比里亚.南非等国家流行。
3.2埃博拉病毒Ebola virus
又称埃博拉出血热病毒,属丝状病毒科,为单股负链RNA病毒,是至今人类所知的最为恐怖的病毒之一,被世界卫生组织(WHO)列为潜在的生物战剂病原体。可分为四种不同亚型:扎伊尔埃博拉(EBO -Z)、苏丹埃博拉(EBO-S)、科特迪瓦埃博拉(EBO-C)和莱斯顿埃博拉(EBO-R)。前3种亚型可使人和灵长类动物发病。
4缩略语
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RT-PCR:反转录-聚合酶链反应
实时荧光RT-PCR:实时荧光反转录-聚合酶链反应
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1439—2013
代替SN/T1439-2004
国境口岸埃博拉病毒分子
生物学检测方法
Molecular detection methods of Ebola virus at frontier ports2013-03-01发布
中华人民共和国
玉家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1439—2004《国境口岸埃博拉出血热病毒检验规程》。本标准与SN/T1439一2004相比，主要技术变化如下：修改了标准的中英文名称：
SN/T1439—2013
一原标准提供的检测方法，如病毒分离培养、电子显微镜检查、间接免疫荧光试验、免疫印迹试验等都涉及活病毒，必须在BSL-4实验室内才能进行，基本不具备可操作性，因此，本标准结合生物安全要求，将原标准中的方法全面进行了修改。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：黄吉城、李燕、师永霞、郑變、李小波、洪烨、幸芦琴、相大鹏、郭波旋、钟玉清、莫秋华、史咏梅。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1439-—2004。
1范围
国境口岸埃博拉病毒分子
生物学检测方法
SN/T1439—2013
本标准规定了国境口岸埃博拉出血热疑似病例血清标本中埃博拉病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，苏丹埃博拉病毒和扎伊尔埃博拉病毒常规RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测以及埃博拉病毒基因芯片法等检测方法。本标准适用于国境口岸人出境人员埃博拉出血热疑似病例临床标本中的分子生物学检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
Ebola hemorrhagic fever;EHF
埃博拉出血热
由埃博拉病毒（Ebolavirus，EBV)引起的一种急性出血性传染病。人主要通过接触病人或感染动物的体液、排泄物、分泌物等而感染，临床表现主要为发热、出血和多脏器损害。埃博拉出血热的病死率高，可达50%～90%。本病于20世纪70年代在非洲首次发现，主要在非洲的乌干达、刚果、加蓬、苏丹、科特迪瓦、利比里亚、南非等国家流行3.2
埃博拉病毒Ebolavirus
又称埃博拉出血热病毒，属丝状病毒科，为单股负链RNA病毒，是至今人类所知的最为恐怖的病毒之一，被世界卫生组织（WHO)列为潜在的生物战剂病原体。可分为四种不同亚型：扎伊尔埃博拉（EBO-Z）、苏丹埃博拉（EBO-S)、科特迪瓦埃博拉（EBO-C)和莱斯顿埃博拉（EBO-R）。前3种亚型可使人和灵长类动物发病。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件
RT-PCR：反转录-聚合酶链反应
实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的值时所经历的循环数RNA：核糖核酸
FAM:FAM荧光染料，一种荧光报告基团1
SN/T1439—2013
5生物安全要求
埃博拉出血热疑似病例血清标本中相关材料的生物安全要求按GB19489执行.如：埃博拉病毒相关的感染性材料的操作应在生物安全三级（BSL-3或ABSIL-3)实验室内进行；埃博拉病毒相关的灭活材料的操作应在生物安全二级（BSI-2)实验室内进行：埃博拉病毒的病毒培养物运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。6标本的采集，运输和保存
无菌采集疑似病例发病1周内静脉血3ml~5ml.室温静置30min使其凝固，500g离心10min，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中.用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，将血清置手70℃保存7标本的处理免费标准bzxz.net
血清标本直接进行分子生物学核酸的提取，如不能在24h内检测应存放在一70℃C冰箱。8分子生物学检测
8.1 RT-PCR法
主要仪器
本方法使用的主要仪器如下
PCR扩增仪：
一千分之一天平；
—超净工作台：
-Ⅱ级生物安全柜；
高压灭菌锅；
低温高速离心机：最大离心20000电泳仪；
一凝胶成像分析系统：
一旋涡振荡器；
冰箱：4℃.-20℃和-70℃；
一移液器：10μL、20μL、100μL、200μL和1ml：一恒温水浴锅。
8.1.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下：核酸提取试剂：用德国Qiagen公司QIAampViralRNAKit\提取病毒核酸；1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
RT-PCR试剂：德国Qiagen公司OnestepRT-PCRkit\；-DEPC处理的无RNA酶的水；
SN/T1439—2013
电泳缓冲液（TAE）：称取242gTris碱，溶于700mL的重蒸水中，加人100mLo.5mol/LEDTA（pH8.0）、57.1mL冰乙酸，至充分溶解后用水定容至1L，室温储存；DNA染料：SYBRgreen。
-RT-PCR检测的引物，见表1。
表1埃博拉病毒RT-PCR检测的引物引
上游外引物EBOV(P890）
下游外引物EBOV(P1076）
序列（5*-3）
GAGACAACGGAAGCTAATGC
AACGGAAGATCACCATCATG
注：等效的引物或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用8.1.3检测步骤
8.1.3.1核酸提取
吸取140μL血清样本加人溶解的560μL裂解液AVL8.1.3.1.1
8.1.3.1.2
脉冲混勾15s，置于室温10min。短暂离心，加人560乙醇（96%～100%）脉冲混匀8.1.3.1.3
8.1.3.1.4
短暂离心。
扩增片段
预期扩增片段为
8.1.3.1.5将QIAamp旋转柱置于2mL收集管中。吸取8.1.3.1.3中溶液630μL转移至旋转柱上，6000g离心1min，将旋转柱放至于净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。3.1.5。
8.1.3.1.6打开旋转柱盖，重复8..8.1.3.1.7打开旋转柱盖，加人500uL洗液AWl，盖紧盖子，6000g离心1min。将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。8.1.3.1.8打开旋转柱盖，加人500μl洗液AW2.盖紧盖子，20.000g离心3min。将旋转柱放至干净的收集管上，20000g再离心1min。将旋转柱放至于净的1.5mL离心管上，丢弃包含过滤液的收集管。
8.1.3.1.9打开旋转柱盖，加人60μL室温平衡的缓冲液AVE8.1.3.1.10盖紧盖子，室温放置1min。8.1.3.1.116000g离心1min。
8.1.3.1.12收集滤出液，用于RT-PCR扩增。一20℃或一70℃储存RNA。8.1.3.2RT-PCR检测
8.1.3.2.1准备RT-PCR反应液，设25μL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：5XRT-PCR缓冲液5μL,10mmol/LdNTP1μL,10mmol/LEBOV(P890)2μL,10mmolEBOV(P1076)2μL,RTPCREnzymemix1μL，无RNA酶的DEPC水9μL，RNA模板5μuL。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据埃博拉病毒核苷酸序列体外转录的RNA片段；阴性对照模板为不含埃博拉病毒核酸的标本或无RNA酶的水。
8.1.3.2.2将PCR反应管置于PCR扩增仪上进行操作，RT-PCR反应程序为：50℃逆转录30min，95℃预变性15min；94℃变性10s，50℃复性30s.72℃延伸30s.35个循环；72℃延伸5min4℃。3
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凝胶电泳
扩增结束后，在5μL扩增产物中加入1μL6×DNA上样缓冲液，用含1×SYBRgreen的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用凝胶成像系统照相记录结果。8.1.4结果判定
质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照未出现特异性条带；
-阳性对照出现预期187bp大小的扩增条带。8.1.4.2
结果分析
在实验结果有效情况下，如待测样品出现预期187bP大小的扩增条带，则可判断待测样品埃博拉病毒核酸PCR阳性，判断为阳性结果的样品可通过复检和核酸序列测定进行确认。如待测样品中未出现预期大小的扩增产物，则可判断待测样品埃博拉病毒核酸PCR阴性。8.1.5
对于首发病例，必需将PCR扩增产物进行序列测定，确定其碱基组成。使用BLAST分析其与已公布的埃博拉病毒序列的同源性，才能判断扩增产物是否为埃博拉病毒核酸。8.2
实时荧光RT-PCR法
主要仪器
本方法使用的主要仪器如下：
荧光定量PCR仪；
超净工作台：
生物安全柜：
高压灭菌锅；
低温高速离心机：最大离心力20000g；旋涡振荡器：
冰箱：4℃、-20℃和-70℃
移液器：10μL、20μL、100μL、200μL和1mL8.2.2
主要试剂
本方法使用的主要试剂如下：
核酸提取试剂：用德国Qiagen公司QIAampViralRNAKit\提取病毒核酸；-实时荧光RT-PCR通用试剂：Ag-Path-IDTOnestepRT-PCRKit，美国Ambion公司产品\；DEPC处理的无RNA酶的水；
引物和探针：引物和探针序列见表2。2）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。引物/探针名称
EBOV-FP
EBOV-RP1
EBOV-RP2
EBOV-Probe
表2埃博拉病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针序列（5°-3\）
CGGACACACAAAAAGAAAGAA
TGTAAATGTCAATGAGAGGAAAT
TAGTTTGAGTTTGAGGAAAATGAT
FAM-CTT+CCT+CATAGTTATT+CG+CACAC-BHQI注：等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用，EB()V-Probe为TuqMan-LNA探针，探针序列中前面带“+\号的碱基表示LNA修饰碱基。8.2.3核酸提取
见8.1.3.1。
8.2.4加样
SN/T1439—2013
扩增片段
预期扩增片段为
90bp或93bp
准备实时荧光RT-PCR反应液，设20μL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：2XRT-PCR缓冲液10μL10μmol/L.EBOV-FP1.5μL、10μmol/LEBOV-RP11μL、10μmol/LEBOV-RP21μl.5μmol/LEBOV-Probe1.5μL.25XRT-PCREnzymeMix0.8μL、模板RNA4.2μL。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据埃博拉病毒核苷酸序列体外合成的RNA片段，阴性对照模板为不含埃博拉病毒核酸的标本或无RNA酶的水。8.2.5实时荧光RT-PCR扩增反应
在不同的荧光定量PCR仪上，TaqMan探针实时荧光RT-PCR的反应条件略有不同。以ABI7500或StepOnePlus荧光定量PCR仪为例，实时荧光RT-PCR检测扩增程序为：50℃10min，95℃10min；95℃5s，55℃30s（收集荧光信号》，45个循环。如使用其他仪器.应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。
8.2.6结果分析
8.2.6.1阈值确定
阅值确定的方法对所有的样品都是统一的，一般是以荧光PCR反应的前3个～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，以样品扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阅值（Ct值）。8.2.6.2质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照无扩增曲线；
阳性对照Ct值<35并有明显扩增曲线。8.2.6.3结果判定
8.2.6.3.1根据以下条件进行结果判定：-无明显扩增曲线，判断为埃博拉病毒荧光RT-PCR检测阴性；有明显扩增曲线，且Ct值≤40，判断为埃博拉病毒荧光RT-PCR检测阳性；5
SN/T1439--2013
有明显扩增曲线，且408.3.1主要仪器设备
本方法使用的主要仪器如下：
微阵列芯片点样系统；
微阵列芯片扫描仪：
芯片洗涤仪：
芯片杂交仪；
脱色摇床：
基因扩增仪；
低温高速离心机。
8.3.2主要试剂
本方法使用的主要试剂如下：
核酸提取试剂：用德国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸；逆转录试剂RevertAidTMHMinus Reverse Transcriptasephi29DNA聚合酶”
PCR试剂PremixPrimeSTARHs；
核酸共沉剂：
预杂交液、2×杂交液、洗液「、洗液Ⅱ、洗液ⅢEpoxide包被芯片片基：
-Pronto！芯片点样液”；
芯片盖玻片；
随机引物：5-GAGCGAGCACAACTTCTGNNNNNNNNNCY3染料标记的通用序列引物：5-（CY3）GAGCGAGCACAACTTCTG-3；埃博拉病毒基因芯片及阳性、阴性对照探针探针序见表
埃博拉病毒基因芯片探针和对照探针表3
探针名称
EBOV-1
EBOV-2
EBOV-3
EBOV-4
序列（5-3”）
CAACCAGGCAACCTCCACATCACCAAGTCGGGTTCAAACACCAACCAACCACAAGGCAATATGTCATCTA
TCTCAGGAGAACATTGGCTGCTATGCCCGAAGAGGAGACAACGGAAGCTAATGCTGGTCAGTTTCTATCC
CTGCAAGATAAGGGCATCAAACAGGGTGTGTAGCTCTTTCACATATTTGGGCTCCTACTGGGCTAGGGTT
TTCCTAGTGACTCCAACTGTGCAAGGATGGAAGGTTTACTGGGCTGGACTTGAGTTTGATGTCAACCAAA
3）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。6
探针名称
EBOV-5
EBOV-6
EBOV-7
EBOV-8
EBOV-9
EBOV-10
EBOV-1
EBOV-12
EBOV-13
EBOV-14
EBOV-15
EBOV-16
EBOV-17
EBOV-18
EBOV-19
EBOV-20
PC-ADNA
PC-Human18 s
NC-rotovirus
NC-norovirus
表3（续）
序列（5\-3\）
SN/T1439--2013
GAAGGCAAACATTCCACTATGGGTTGTCTATCCTCTCGAAGGCCAACGCCCTGATCCTCCTGGTGAATTT
CAATGTCCGCAGTGTTCAAATGCAAAGCAACCAGGTGGGAAACCATTCGTGTCAGTGGCAGTCAAGAAAC
CCTTCCTCCAGGAGTTCGTTCTTCCGCCAGTCCAACTACCCCAGTATTTCACCTTTGATTTGACAGCACT
GATCCAACTGACTGAGAAGATACGACCATTCCTGATGTGGTGGTTGATCCCGATGATGGAAGCTACGGCG
GCATCATTGGCGTACTGGAGGAGCAGGCACAGAAACAGGAACCGAAAATACTTGGCAAGAGACTCTTCAA
GCCAGGAACCAGGACAGTGACAACACCCAGCCAGAACACTCTTTTGAGGAGATGTATCGCCACATTCTAA
TGGACACGACCACCATGTTCGAGCACGATEATCATCCAGAGAGAATTATCGAGGTGAGTACCGTCAATCA
AGGTGTTGATTTTCAAGAGAGTGCGGACAGTTTCCTTCTCATGCTTTGTCTTCATCATGCGTACCAGGGA
GGTCTGATCTCTGATTGGCTGCTAACAACCAACACTAACCATTTCAACATGCGAACACAACGTGTCAAGG
GATATTGAGAACAATCCAGGATTATGCTACGCATCGCAAATGCAACAAACCAAGCCAAACCCGAAGACGC
GGGCTTGGGCAAGATCAGGCAGAACCTGTTCTCGAAGTATATCAACGATTACACAGTGATAAAGGAGGCA
TGCCACAGGAGTCCACAAGCAACGGTCTAATAACTTCAACAGTAACAGGGATTCTTGGGAGTCTTGGGCT
TTCCTAGTGACTCCAACTGTGCAAGGATGGAAGGTTTAGTGGGCTGGACTTGAGTTTGATGTCAACCAAA
ACGAGGATGATGCTATTAAGGCTAAATTGAAAGATCCGAACGGGAAGGTTCCAGAAAGTGTCAAACAGGC
AACCTCTTGATTTCGGGACCATTGCACTATCCTTAGCAGTTCCTCAGGTATTGGGTGGATTATCCTTCCT
GCCAGTAATGAGCCTACAGGACAAGTTCCTTGCTGTTCTTCAACATGACTGAGGACCCATGATTAGTAGA
TACAAAGTTACCTGTCAAACGGTGCAATGAAGCCAAGTTAGAACTCGTCAGAATGAATATTAT
CAAGACGGACCAGAGCGAAAGCATTTGCCAAGAATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCGG
GAACAATGTTGAGTTGAGCATCGACCGCAGCAGCAAGGACGAGAAGCGGCAATGAAGCCATTTTATTGCC
CATATTTCTCATTTTATGGTGATGATGAGATTGTGTCAACTGACATAGATTTTGACCCAGCCCGCCTCAC
注：等效的探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。SN/T1439—2013
8.3.3基因芯片探针打印
合成好的芯片探针干粉离心后，按合成量用Pronto！芯片点样液稀释成40μmol/L，充分混匀后各吸10μL至384孔板，用微阵列芯片点样系统将探针打印于Epoxide包被芯片片基上，每种探针打印6个点，每个阵列包括阴性对照探针、阳性对照探针和空白点样液，打印好的芯片取出后放人湿度70%的干净密封容器，过夜处理。
8.3.4病毒RNA提取及逆转录
病毒的RNA提取见8.1.3.1。
提取好的RNA取5μL于0.2mL反应管中，加人40μmol/L随机引物1μL，65℃加热5min后立即转到冰中速冻2min，随后加入下列混合液：5X反应缓冲液2μL，RiboLockTMRNase抑制剂0.5μL,dNTPMix(10mmol/L)1μL,RevertAidTMHMinusReverseTranscriptase0.5μL,混勺.离心25℃保温10min后，42℃逆转录1h。8.3.5全基因组扩增
取上述全部10μL逆转录产物，加人DEPC水5.5μL，^DNA（100ng/μL)0.5μL，10X反应缓冲液2μL，dNTPMix(10mmol/L)3μL，94℃加热5min后立即转到冰中速冻2min，补加phi29DNA聚合酶1μL，混匀，离心，30℃保温3h，65℃加热10min使酶失活。8.3.6扩增产物标记
取上述全部20μLphi29DNA聚合酶的全基因组扩增产物，补加下列混合液：PremixPrimeSTARHS50μL，20μmol/LCY3染料标记的通用序列引物4μL，DEPC水26μL，混勾，离心，按98℃10S、50℃5s、72℃90S，进行30个循环PCR扩增标记。8.3.7标记产物纯化
PCR扩增标记的100μL产物全部用核酸共沉剂进行纯化，干燥后室温保存于暗处备用。8.3.8芯片预杂交
将芯片浸人预热至55C的预杂交液（5×SSC，0.1%SDS，0.1mg/mLBSA）中，55C放置2h~3h，室温下用洗液Ⅲ（0.1×SSC）清洗共3次，每次用脱色摇床150g轻摇5min，转至纯水，放置30s离心甩干芯片，然后于洁净处放置待用。8.3.9芯片杂交
在纯化的扩增标记样品沉淀管中加人15μL去离子水和15μL2×杂交液（50%去离子甲酰胺，5×SSC0.1%SDS0.5μg/μL鲑鱼精DNA），振荡混匀，95℃保温5min，然后13000g离心2min，取30μL样品于盖好盖玻片的芯片上。在杂交仪上55℃杂交2h～3h，杂交腔两端各加上250μL含甲酰胺的保湿液，盖好，启动杂交程序进行杂交。8.3.10芯片杂交后清洗
杂交结束后，用镊子从杂交仪上轻轻取出芯片，注意不要触动盖玻片，立即浸人预先预热至55C的洗液I（2XSSC.0.1%SDS)中，上下抽动直至盖玻片滑落，将芯片转至芯片洗涤仪上，用预先设好的程序洗涤：洗液I中静置5min，将洗液I换成洗液Ⅱ（1×SSc），静置2min，再换洗液Ⅱ静置2min，接着换洗液Ⅲ，静置1min，再换液Ⅲ（O.1×SSC)，静置1min，最后取出芯片，离心甩干芯片，待扫描检测。8
芯片扫描
将杂交清洗后的基因芯片放人基因芯片扫描仪进行扫描分析质量控制
结果应同时符合以下3个条件，则可判定为杂交合格。阴性对照探针杂交信号的信噪比均值≤3.5；基因芯片空白对照点杂交信号的信噪比均值≤3.5：—阳性对照探针杂交信号的信噪比均值>5.0。8.3.13
结果判定
在阴性、阳性对照合格的基础上：目标基因探针杂交信号的信噪比均值≥5.0则判定为阳性信号：目标基因探针杂交信号的信噪比均值>3.5并<5.0则判定为可疑阳性：目标基因探针杂交信号的信噪比均值≤3.5则判定为阴性。SN/T1439—2013
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中国标准出版社出版
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中国标准出版社皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张1字数20千字2013年8月第一版
2013年8月第一次印刷
印数1-1600
书号：155066·2-25790
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代替SN/T1439-2004
国境口岸埃博拉病毒分子
生物学检测方法
Molecular detection methods of Ebola virus at frontier ports2013-03-01发布
中华人民共和国
玉家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1439—2004《国境口岸埃博拉出血热病毒检验规程》。本标准与SN/T1439一2004相比，主要技术变化如下：修改了标准的中英文名称：
SN/T1439—2013
一原标准提供的检测方法，如病毒分离培养、电子显微镜检查、间接免疫荧光试验、免疫印迹试验等都涉及活病毒，必须在BSL-4实验室内才能进行，基本不具备可操作性，因此，本标准结合生物安全要求，将原标准中的方法全面进行了修改。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：黄吉城、李燕、师永霞、郑變、李小波、洪烨、幸芦琴、相大鹏、郭波旋、钟玉清、莫秋华、史咏梅。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1439-—2004。
1范围
国境口岸埃博拉病毒分子
生物学检测方法
SN/T1439—2013
本标准规定了国境口岸埃博拉出血热疑似病例血清标本中埃博拉病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，苏丹埃博拉病毒和扎伊尔埃博拉病毒常规RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测以及埃博拉病毒基因芯片法等检测方法。本标准适用于国境口岸人出境人员埃博拉出血热疑似病例临床标本中的分子生物学检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
Ebola hemorrhagic fever;EHF
埃博拉出血热
由埃博拉病毒（Ebolavirus，EBV)引起的一种急性出血性传染病。人主要通过接触病人或感染动物的体液、排泄物、分泌物等而感染，临床表现主要为发热、出血和多脏器损害。埃博拉出血热的病死率高，可达50%～90%。本病于20世纪70年代在非洲首次发现，主要在非洲的乌干达、刚果、加蓬、苏丹、科特迪瓦、利比里亚、南非等国家流行3.2
埃博拉病毒Ebolavirus
又称埃博拉出血热病毒，属丝状病毒科，为单股负链RNA病毒，是至今人类所知的最为恐怖的病毒之一，被世界卫生组织（WHO)列为潜在的生物战剂病原体。可分为四种不同亚型：扎伊尔埃博拉（EBO-Z）、苏丹埃博拉（EBO-S)、科特迪瓦埃博拉（EBO-C)和莱斯顿埃博拉（EBO-R）。前3种亚型可使人和灵长类动物发病。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件
RT-PCR：反转录-聚合酶链反应
实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的值时所经历的循环数RNA：核糖核酸
FAM:FAM荧光染料，一种荧光报告基团1
SN/T1439—2013
5生物安全要求
埃博拉出血热疑似病例血清标本中相关材料的生物安全要求按GB19489执行.如：埃博拉病毒相关的感染性材料的操作应在生物安全三级（BSL-3或ABSIL-3)实验室内进行；埃博拉病毒相关的灭活材料的操作应在生物安全二级（BSI-2)实验室内进行：埃博拉病毒的病毒培养物运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。6标本的采集，运输和保存
无菌采集疑似病例发病1周内静脉血3ml~5ml.室温静置30min使其凝固，500g离心10min，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中.用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，将血清置手70℃保存7标本的处理免费标准bzxz.net
血清标本直接进行分子生物学核酸的提取，如不能在24h内检测应存放在一70℃C冰箱。8分子生物学检测
8.1 RT-PCR法
主要仪器
本方法使用的主要仪器如下
PCR扩增仪：
一千分之一天平；
—超净工作台：
-Ⅱ级生物安全柜；
高压灭菌锅；
低温高速离心机：最大离心20000电泳仪；
一凝胶成像分析系统：
一旋涡振荡器；
冰箱：4℃.-20℃和-70℃；
一移液器：10μL、20μL、100μL、200μL和1ml：一恒温水浴锅。
8.1.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下：核酸提取试剂：用德国Qiagen公司QIAampViralRNAKit\提取病毒核酸；1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
RT-PCR试剂：德国Qiagen公司OnestepRT-PCRkit\；-DEPC处理的无RNA酶的水；
SN/T1439—2013
电泳缓冲液（TAE）：称取242gTris碱，溶于700mL的重蒸水中，加人100mLo.5mol/LEDTA（pH8.0）、57.1mL冰乙酸，至充分溶解后用水定容至1L，室温储存；DNA染料：SYBRgreen。
-RT-PCR检测的引物，见表1。
表1埃博拉病毒RT-PCR检测的引物引
上游外引物EBOV(P890）
下游外引物EBOV(P1076）
序列（5*-3）
GAGACAACGGAAGCTAATGC
AACGGAAGATCACCATCATG
注：等效的引物或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用8.1.3检测步骤
8.1.3.1核酸提取
吸取140μL血清样本加人溶解的560μL裂解液AVL8.1.3.1.1
8.1.3.1.2
脉冲混勾15s，置于室温10min。短暂离心，加人560乙醇（96%～100%）脉冲混匀8.1.3.1.3
8.1.3.1.4
短暂离心。
扩增片段
预期扩增片段为
8.1.3.1.5将QIAamp旋转柱置于2mL收集管中。吸取8.1.3.1.3中溶液630μL转移至旋转柱上，6000g离心1min，将旋转柱放至于净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。3.1.5。
8.1.3.1.6打开旋转柱盖，重复8..8.1.3.1.7打开旋转柱盖，加人500uL洗液AWl，盖紧盖子，6000g离心1min。将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。8.1.3.1.8打开旋转柱盖，加人500μl洗液AW2.盖紧盖子，20.000g离心3min。将旋转柱放至干净的收集管上，20000g再离心1min。将旋转柱放至于净的1.5mL离心管上，丢弃包含过滤液的收集管。
8.1.3.1.9打开旋转柱盖，加人60μL室温平衡的缓冲液AVE8.1.3.1.10盖紧盖子，室温放置1min。8.1.3.1.116000g离心1min。
8.1.3.1.12收集滤出液，用于RT-PCR扩增。一20℃或一70℃储存RNA。8.1.3.2RT-PCR检测
8.1.3.2.1准备RT-PCR反应液，设25μL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：5XRT-PCR缓冲液5μL,10mmol/LdNTP1μL,10mmol/LEBOV(P890)2μL,10mmolEBOV(P1076)2μL,RTPCREnzymemix1μL，无RNA酶的DEPC水9μL，RNA模板5μuL。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据埃博拉病毒核苷酸序列体外转录的RNA片段；阴性对照模板为不含埃博拉病毒核酸的标本或无RNA酶的水。
8.1.3.2.2将PCR反应管置于PCR扩增仪上进行操作，RT-PCR反应程序为：50℃逆转录30min，95℃预变性15min；94℃变性10s，50℃复性30s.72℃延伸30s.35个循环；72℃延伸5min4℃。3
SN/T1439—2013
凝胶电泳
扩增结束后，在5μL扩增产物中加入1μL6×DNA上样缓冲液，用含1×SYBRgreen的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用凝胶成像系统照相记录结果。8.1.4结果判定
质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照未出现特异性条带；
-阳性对照出现预期187bp大小的扩增条带。8.1.4.2
结果分析
在实验结果有效情况下，如待测样品出现预期187bP大小的扩增条带，则可判断待测样品埃博拉病毒核酸PCR阳性，判断为阳性结果的样品可通过复检和核酸序列测定进行确认。如待测样品中未出现预期大小的扩增产物，则可判断待测样品埃博拉病毒核酸PCR阴性。8.1.5
对于首发病例，必需将PCR扩增产物进行序列测定，确定其碱基组成。使用BLAST分析其与已公布的埃博拉病毒序列的同源性，才能判断扩增产物是否为埃博拉病毒核酸。8.2
实时荧光RT-PCR法
主要仪器
本方法使用的主要仪器如下：
荧光定量PCR仪；
超净工作台：
生物安全柜：
高压灭菌锅；
低温高速离心机：最大离心力20000g；旋涡振荡器：
冰箱：4℃、-20℃和-70℃
移液器：10μL、20μL、100μL、200μL和1mL8.2.2
主要试剂
本方法使用的主要试剂如下：
核酸提取试剂：用德国Qiagen公司QIAampViralRNAKit\提取病毒核酸；-实时荧光RT-PCR通用试剂：Ag-Path-IDTOnestepRT-PCRKit，美国Ambion公司产品\；DEPC处理的无RNA酶的水；
引物和探针：引物和探针序列见表2。2）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。引物/探针名称
EBOV-FP
EBOV-RP1
EBOV-RP2
EBOV-Probe
表2埃博拉病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针序列（5°-3\）
CGGACACACAAAAAGAAAGAA
TGTAAATGTCAATGAGAGGAAAT
TAGTTTGAGTTTGAGGAAAATGAT
FAM-CTT+CCT+CATAGTTATT+CG+CACAC-BHQI注：等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用，EB()V-Probe为TuqMan-LNA探针，探针序列中前面带“+\号的碱基表示LNA修饰碱基。8.2.3核酸提取
见8.1.3.1。
8.2.4加样
SN/T1439—2013
扩增片段
预期扩增片段为
90bp或93bp
准备实时荧光RT-PCR反应液，设20μL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：2XRT-PCR缓冲液10μL10μmol/L.EBOV-FP1.5μL、10μmol/LEBOV-RP11μL、10μmol/LEBOV-RP21μl.5μmol/LEBOV-Probe1.5μL.25XRT-PCREnzymeMix0.8μL、模板RNA4.2μL。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据埃博拉病毒核苷酸序列体外合成的RNA片段，阴性对照模板为不含埃博拉病毒核酸的标本或无RNA酶的水。8.2.5实时荧光RT-PCR扩增反应
在不同的荧光定量PCR仪上，TaqMan探针实时荧光RT-PCR的反应条件略有不同。以ABI7500或StepOnePlus荧光定量PCR仪为例，实时荧光RT-PCR检测扩增程序为：50℃10min，95℃10min；95℃5s，55℃30s（收集荧光信号》，45个循环。如使用其他仪器.应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。
8.2.6结果分析
8.2.6.1阈值确定
阅值确定的方法对所有的样品都是统一的，一般是以荧光PCR反应的前3个～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，以样品扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阅值（Ct值）。8.2.6.2质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照无扩增曲线；
阳性对照Ct值<35并有明显扩增曲线。8.2.6.3结果判定
8.2.6.3.1根据以下条件进行结果判定：-无明显扩增曲线，判断为埃博拉病毒荧光RT-PCR检测阴性；有明显扩增曲线，且Ct值≤40，判断为埃博拉病毒荧光RT-PCR检测阳性；5
SN/T1439--2013
有明显扩增曲线，且40
本方法使用的主要仪器如下：
微阵列芯片点样系统；
微阵列芯片扫描仪：
芯片洗涤仪：
芯片杂交仪；
脱色摇床：
基因扩增仪；
低温高速离心机。
8.3.2主要试剂
本方法使用的主要试剂如下：
核酸提取试剂：用德国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸；逆转录试剂RevertAidTMHMinus Reverse Transcriptasephi29DNA聚合酶”
PCR试剂PremixPrimeSTARHs；
核酸共沉剂：
预杂交液、2×杂交液、洗液「、洗液Ⅱ、洗液ⅢEpoxide包被芯片片基：
-Pronto！芯片点样液”；
芯片盖玻片；
随机引物：5-GAGCGAGCACAACTTCTGNNNNNNNNNCY3染料标记的通用序列引物：5-（CY3）GAGCGAGCACAACTTCTG-3；埃博拉病毒基因芯片及阳性、阴性对照探针探针序见表
埃博拉病毒基因芯片探针和对照探针表3
探针名称
EBOV-1
EBOV-2
EBOV-3
EBOV-4
序列（5-3”）
CAACCAGGCAACCTCCACATCACCAAGTCGGGTTCAAACACCAACCAACCACAAGGCAATATGTCATCTA
TCTCAGGAGAACATTGGCTGCTATGCCCGAAGAGGAGACAACGGAAGCTAATGCTGGTCAGTTTCTATCC
CTGCAAGATAAGGGCATCAAACAGGGTGTGTAGCTCTTTCACATATTTGGGCTCCTACTGGGCTAGGGTT
TTCCTAGTGACTCCAACTGTGCAAGGATGGAAGGTTTACTGGGCTGGACTTGAGTTTGATGTCAACCAAA
3）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。6
探针名称
EBOV-5
EBOV-6
EBOV-7
EBOV-8
EBOV-9
EBOV-10
EBOV-1
EBOV-12
EBOV-13
EBOV-14
EBOV-15
EBOV-16
EBOV-17
EBOV-18
EBOV-19
EBOV-20
PC-ADNA
PC-Human18 s
NC-rotovirus
NC-norovirus
表3（续）
序列（5\-3\）
SN/T1439--2013
GAAGGCAAACATTCCACTATGGGTTGTCTATCCTCTCGAAGGCCAACGCCCTGATCCTCCTGGTGAATTT
CAATGTCCGCAGTGTTCAAATGCAAAGCAACCAGGTGGGAAACCATTCGTGTCAGTGGCAGTCAAGAAAC
CCTTCCTCCAGGAGTTCGTTCTTCCGCCAGTCCAACTACCCCAGTATTTCACCTTTGATTTGACAGCACT
GATCCAACTGACTGAGAAGATACGACCATTCCTGATGTGGTGGTTGATCCCGATGATGGAAGCTACGGCG
GCATCATTGGCGTACTGGAGGAGCAGGCACAGAAACAGGAACCGAAAATACTTGGCAAGAGACTCTTCAA
GCCAGGAACCAGGACAGTGACAACACCCAGCCAGAACACTCTTTTGAGGAGATGTATCGCCACATTCTAA
TGGACACGACCACCATGTTCGAGCACGATEATCATCCAGAGAGAATTATCGAGGTGAGTACCGTCAATCA
AGGTGTTGATTTTCAAGAGAGTGCGGACAGTTTCCTTCTCATGCTTTGTCTTCATCATGCGTACCAGGGA
GGTCTGATCTCTGATTGGCTGCTAACAACCAACACTAACCATTTCAACATGCGAACACAACGTGTCAAGG
GATATTGAGAACAATCCAGGATTATGCTACGCATCGCAAATGCAACAAACCAAGCCAAACCCGAAGACGC
GGGCTTGGGCAAGATCAGGCAGAACCTGTTCTCGAAGTATATCAACGATTACACAGTGATAAAGGAGGCA
TGCCACAGGAGTCCACAAGCAACGGTCTAATAACTTCAACAGTAACAGGGATTCTTGGGAGTCTTGGGCT
TTCCTAGTGACTCCAACTGTGCAAGGATGGAAGGTTTAGTGGGCTGGACTTGAGTTTGATGTCAACCAAA
ACGAGGATGATGCTATTAAGGCTAAATTGAAAGATCCGAACGGGAAGGTTCCAGAAAGTGTCAAACAGGC
AACCTCTTGATTTCGGGACCATTGCACTATCCTTAGCAGTTCCTCAGGTATTGGGTGGATTATCCTTCCT
GCCAGTAATGAGCCTACAGGACAAGTTCCTTGCTGTTCTTCAACATGACTGAGGACCCATGATTAGTAGA
TACAAAGTTACCTGTCAAACGGTGCAATGAAGCCAAGTTAGAACTCGTCAGAATGAATATTAT
CAAGACGGACCAGAGCGAAAGCATTTGCCAAGAATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCGG
GAACAATGTTGAGTTGAGCATCGACCGCAGCAGCAAGGACGAGAAGCGGCAATGAAGCCATTTTATTGCC
CATATTTCTCATTTTATGGTGATGATGAGATTGTGTCAACTGACATAGATTTTGACCCAGCCCGCCTCAC
注：等效的探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。SN/T1439—2013
8.3.3基因芯片探针打印
合成好的芯片探针干粉离心后，按合成量用Pronto！芯片点样液稀释成40μmol/L，充分混匀后各吸10μL至384孔板，用微阵列芯片点样系统将探针打印于Epoxide包被芯片片基上，每种探针打印6个点，每个阵列包括阴性对照探针、阳性对照探针和空白点样液，打印好的芯片取出后放人湿度70%的干净密封容器，过夜处理。
8.3.4病毒RNA提取及逆转录
病毒的RNA提取见8.1.3.1。
提取好的RNA取5μL于0.2mL反应管中，加人40μmol/L随机引物1μL，65℃加热5min后立即转到冰中速冻2min，随后加入下列混合液：5X反应缓冲液2μL，RiboLockTMRNase抑制剂0.5μL,dNTPMix(10mmol/L)1μL,RevertAidTMHMinusReverseTranscriptase0.5μL,混勺.离心25℃保温10min后，42℃逆转录1h。8.3.5全基因组扩增
取上述全部10μL逆转录产物，加人DEPC水5.5μL，^DNA（100ng/μL)0.5μL，10X反应缓冲液2μL，dNTPMix(10mmol/L)3μL，94℃加热5min后立即转到冰中速冻2min，补加phi29DNA聚合酶1μL，混匀，离心，30℃保温3h，65℃加热10min使酶失活。8.3.6扩增产物标记
取上述全部20μLphi29DNA聚合酶的全基因组扩增产物，补加下列混合液：PremixPrimeSTARHS50μL，20μmol/LCY3染料标记的通用序列引物4μL，DEPC水26μL，混勾，离心，按98℃10S、50℃5s、72℃90S，进行30个循环PCR扩增标记。8.3.7标记产物纯化
PCR扩增标记的100μL产物全部用核酸共沉剂进行纯化，干燥后室温保存于暗处备用。8.3.8芯片预杂交
将芯片浸人预热至55C的预杂交液（5×SSC，0.1%SDS，0.1mg/mLBSA）中，55C放置2h~3h，室温下用洗液Ⅲ（0.1×SSC）清洗共3次，每次用脱色摇床150g轻摇5min，转至纯水，放置30s离心甩干芯片，然后于洁净处放置待用。8.3.9芯片杂交
在纯化的扩增标记样品沉淀管中加人15μL去离子水和15μL2×杂交液（50%去离子甲酰胺，5×SSC0.1%SDS0.5μg/μL鲑鱼精DNA），振荡混匀，95℃保温5min，然后13000g离心2min，取30μL样品于盖好盖玻片的芯片上。在杂交仪上55℃杂交2h～3h，杂交腔两端各加上250μL含甲酰胺的保湿液，盖好，启动杂交程序进行杂交。8.3.10芯片杂交后清洗
杂交结束后，用镊子从杂交仪上轻轻取出芯片，注意不要触动盖玻片，立即浸人预先预热至55C的洗液I（2XSSC.0.1%SDS)中，上下抽动直至盖玻片滑落，将芯片转至芯片洗涤仪上，用预先设好的程序洗涤：洗液I中静置5min，将洗液I换成洗液Ⅱ（1×SSc），静置2min，再换洗液Ⅱ静置2min，接着换洗液Ⅲ，静置1min，再换液Ⅲ（O.1×SSC)，静置1min，最后取出芯片，离心甩干芯片，待扫描检测。8
芯片扫描
将杂交清洗后的基因芯片放人基因芯片扫描仪进行扫描分析质量控制
结果应同时符合以下3个条件，则可判定为杂交合格。阴性对照探针杂交信号的信噪比均值≤3.5；基因芯片空白对照点杂交信号的信噪比均值≤3.5：—阳性对照探针杂交信号的信噪比均值>5.0。8.3.13
结果判定
在阴性、阳性对照合格的基础上：目标基因探针杂交信号的信噪比均值≥5.0则判定为阳性信号：目标基因探针杂交信号的信噪比均值>3.5并<5.0则判定为可疑阳性：目标基因探针杂交信号的信噪比均值≤3.5则判定为阴性。SN/T1439—2013
SN/T1439-2013
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
国境口岸埃博拉病毒分子
生物学检测方法
SN/T1439—2013
中国标准出版社出版
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中国标准出版社皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张1字数20千字2013年8月第一版
2013年8月第一次印刷
印数1-1600
书号：155066·2-25790
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