SN/T 1618-2017
基本信息
标准号： SN/T 1618-2017
中文名称：李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1618-2017.Detection and identification of Prunus necrotic ringspot virus.
1范围
SN/T 1618规定了植物检疫中李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法。
SN/T 1618适用于植物材料中李属坏死环斑病毒的检疫鉴定。
2基本信息
学名:Prunus necrotic ringspot virus
缩写:PNRSV
分类地位:雀麦花叶病毒科( Bromovirus),等轴不稳环斑病毒属( Ilarvirus)。
该病毒的其他信息参见附录A。
3方法原理
根据李属坏死环斑病毒与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行ELISA检测;根据该病毒核酸序列进行PCR特异性检测,通过电泳条带大小进行结果判定;根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过检测荧光信号进行结果判定。
4仪器设备及试剂
4.1仪器设备
酶标仪、天平(感量,1/10 000 g)、pH计、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。
微量移液器(2 pμL,10 μL、20 μL、.100 μL、200 μL、1 000 pL)、酶联板、研钵、离心管、花盆、消毒土等。
4.2试剂
酶联免疫吸附测定试剂见附录B中B.1,RT-PCR检测试剂见附录C中C.1,实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D中D.1
1范围
SN/T 1618规定了植物检疫中李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法。
SN/T 1618适用于植物材料中李属坏死环斑病毒的检疫鉴定。
2基本信息
学名:Prunus necrotic ringspot virus
缩写:PNRSV
分类地位:雀麦花叶病毒科( Bromovirus),等轴不稳环斑病毒属( Ilarvirus)。
该病毒的其他信息参见附录A。
3方法原理
根据李属坏死环斑病毒与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行ELISA检测;根据该病毒核酸序列进行PCR特异性检测,通过电泳条带大小进行结果判定;根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过检测荧光信号进行结果判定。
4仪器设备及试剂
4.1仪器设备
酶标仪、天平(感量,1/10 000 g)、pH计、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。
微量移液器(2 pμL,10 μL、20 μL、.100 μL、200 μL、1 000 pL)、酶联板、研钵、离心管、花盆、消毒土等。
4.2试剂
酶联免疫吸附测定试剂见附录B中B.1,RT-PCR检测试剂见附录C中C.1,实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D中D.1
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1618—2017
代替SN/T1618—2005
李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Prunus necrotic ringspot virus2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准代替SN/T1618—2005《李属坏死环斑病毒检测方法》。本标准与SN/T1618—2005相比，主要技术变化如下：增加了实时荧光RT-PCR检测方法本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：李桂芬、魏梅生、张永江、马洁、孔君。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1618—2005。
SN/T1618—2017
1范围
李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法本标准规定了植物检疫中李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法。本标准适用于植物材料中李属坏死环斑病毒的检疫鉴定。2基本信息
学名：Prunus necrotic ringspot virus缩写：PNRSV
分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromouirus），等轴不稳环斑病毒属（Ilaruirus）。该病毒的其他信息参见附录A。
3方法原理
SN/T1618—2017
根据李属坏死环斑病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行ELISA检测；根据该病毒核酸序列进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定；根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过检测荧光信号进行结果判定。仪器设备及试剂
4.1仪器设备
酶标仪、天平（感量，1/10000g）、pH计、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。微量移液器（2μL、10μL20μL、100μL、200μL、1000μL）、酶联板、研钵、离心管、花盆、消毒土等。4.2试剂
酶联免疫吸附测定试剂见附录B中B.1,RT-PCR检测试剂见附录C中C.1，实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D中D.1。
样品制备
木本寄主植物选其幼叶，果肉组织和花，草本植物选其叶子。有症状的样品编号单独检测，没有症状的样品分组（1015为1组）并编号检测。6
检测方法
酶联免疫吸附测定
见附录B。
SN/T1618—2017
6.2RT-PCR检测
见附录C。
实时荧光RT-PCR检测
见附录D。
结果判定
样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行首先采用DAS-ELISA进行初步筛检若DAS-ELISA检测结果为阳性时
RT-PCR的检测结果为阳性，则判定样品携带PNRSV；或采用实时荧光RT-PCR进行检测，若检测结果为阳性，则判定样品携带PNRSV。若DAS-ELISA检测结果为阴性时，RT-PCR的检测结果为阴性，则判定样品不携带PNRSV；检测结果为阳性，则对产物进行测序，测定的序列为PNRSV序列，则判定样品携带PNRSV。8样品保存
经检测确定携带李属坏死环斑病毒的样品（叶片、花、果实）一80℃保存一年，做好标记和登记工作。
9结果记录与资料保存
完整的记录包括：样品的来源、时间、地点、方法和结果等并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR检测需要有反应原始数据。
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
李属坏死环斑病毒背景资料
SN/T1618—2017
李属坏死环斑病毒病寄主范围十分广泛，自然和人工条件下，病毒可侵染的寄主达21科双子叶植物，其中可侵染的木本植物有：李属的欧洲李（P）桃属的桃（Amygdaluspersica）、楼属的欧洲甜樱桃（Cerasusavium）、樱属的欧洲酸樱桃（Cerasusuulgaris）、杏属的杏（Armeniacavul-garis）、苹果属的苹果（Maluspumila）、蔷薇属的月季花（Rosa chinensis）、悬钩子属的椭圆悬钩子（Ru-busellipticus）、秋海棠属的秋海棠（Begonia侵染的草本植物有啤酒花（Humuluslupulus）烟草（Nicotianutabacum）、西瓜（CitrullusLanatus）、南瓜（Cucurbitetamoschata），甜瓜（Cucumis
melo）、西葫芦（Cucurbitapepo），菜豆（Phaseolusgaris）、豌豆（Pisumsatiuum），豇豆（Vignaun-guiculata），草木犀（Melilotusofficinalis）、葛苣（Lactuca(Liliumbrownii）等。
A.2病害症状
）向日葵（Helianthusannuus）、百合病害症状因分离物、栽培种和环境条件不同而不同。病毒的一些分离物不引起症状，仅仅在接种指一些分离物在系统侵染的当年在幼叶上产生坏死斑示植物或用血清学等方法检测时才能发现被侵染和孔洞，但在以后的年份里，在叶子和果实上很少出现症状：另一些分离物在侵染当年产生坏死反应，随后是慢性的褪绿、斑驳和坏死、叶子耳突、畸形、延迟水果成熟，水果上有斑点症状。如在甜樱桃上出现了从无症状到严重皱缩花叶症状，慢性症状包括状因病毒分离物不同而不同。在月季上症状
、叶扭曲，水果
子上的褪绿点
延迟成熟几天至几周，症
浸染很音
多不成形的花，被侵染的植株通常无活力。在
A.3分布地区
分布地区广泛，如欧洲各国和美国都有发生A.4传播方式
遍·症
犬有花叶
开花延迟、秋天落叶早、产生更产生褪绿线和环斑
机械接种传播、花粉传播、种子传播，也可通过无性繁殖的苗木、组培苗等的运输进行长距离传播A.5粒体形态
等轴对称球状体，直径23nm～27nm，有些粒体为准等轴球状到短棒状（轴比为1.01～1.5）；有些株系的粒体呈明显的棒状（轴比大于2.2）：有些棒状粒体达70nm。棒状粒体的有无及比例因株系而异。
SN/T1618—2017
基因组
正单链RNA，3分体基因组，RNA-1长3.662kb，RNA-2长2.507kb，RNA-3长1.887kbB.1试剂
包被抗体
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）特异性的李属坏死环斑病毒抗体。B.1.2
酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的李属坏死环斑病毒抗体。底物
对硝基苯磷酸二钠（pNPP）。
1×PBST缓冲液（pH7.4）
氯化钠（NaCI)
磷酸二氢钾（KH2PO）
磷酸氢二钠（NazHPO）
氯化钾（KCI）
吐温-20（Tween-20）
溶于900mL蒸馏水中，并定容至1000mL，4℃储存。5样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸钠（NazSO）
聚乙烯基吡略烷酮（PVP，MW24000~40000）8.0g
溶于900mL的1×PBST中，并用1×PBST定容至1000mL，4℃储存。B.1.6
包被缓冲液（pH9.6）下载标准就来标准下载网
碳酸钠（NazCO）
碳酸氢钠（NaHCO）
溶于900mL蒸馏水中，并定容至1000mL，4℃储存。B.1.7
酶标抗体稀释缓冲液（PH7.4）
牛血清白蛋白（BSA）
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW24000~40000）1.59g
溶于900mL1×PBST中，并用1XPBST定容至1000mL，4℃储存。3底物缓冲液（pH9.8）
二乙醇胺
SN/T16182017
SN/T1618—2017
氯化镁（MgCl）
溶于800mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCI）调pH至9.8，定容至1000mL，4℃储存。B.2实验步骤
B.2.1包被抗体
按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，加人到酶联板孔中，每孔100L。酶联板加盖或用保鲜膜包好，37℃C孵育2h。清空孔中溶液，用1×PBST加满各孔，3min后倒掉孔中溶液在吸水纸上拍干。再重复2次上述洗板过程。B.2.2样品制备与加样
待测样品按1：10加人样品抽提缓冲液，在研钵中研磨：2000r/min离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照做相应处理或按说明书进行。按100L/孔分别加入制备好的检测样品、阴性对照和阳性对照：酶联板加盖或用保鲜膜包好.4℃孵育过夜。酶联板用自来水彻底冲洗，
再用1×PBST洗涤3次，每次3minB.2.3加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加人到酶联板中，100μL/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好，37℃孵育4h。酶联板用自来水彻底冲洗，再用1×PBST洗涤3次，每次3min。B.2.4加底物
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1m/mL（现配现用）100μL/孔加人到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.5读数
在不同的时间内如30min，60min.90min、120min或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值。B.3结果判定
B.3.1质量控制要求
对照孔的ODos值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔）应在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值<0.15，当阴性对照孔的OD405值0.05时，按0.05计算：阳性对照OD405值/阴性对照OD405值>5：同一样品的重复性基本一致。B.3.2结果判定
在满足B.3.1的质量控制要求后，结果原则上可判定如下：样品ODa05值/阴性对照OD405值>2，判为阳性：样品OD405值/阴性对照OD405值在2左右，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证：样品OD45值/阴性对照OD%值<2，判为阴性若不满足B.3.1的质量控制要求，则不能进行结果判定。C.1试剂
C.1.1核酸提取试剂
Trizol或合格的RNA提取试剂盒。C.1.2电泳缓冲液TAE（50×）
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰乙酸（CHO2）
乙二胺四乙酸二钠（Naz2EDTA·2H,O）附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
双蒸水定容至1000mL，用时稀释至1×TAE。C.2检测步骤
C.2.1核酸提取
SN/T1618—2017
称取0.1g样品加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人灭菌的l.5mL离心管中，加人1mL的TrizoL试剂，剧烈震荡3min；4℃12000r/min离心10甲烷，猛烈震荡15s4℃12000rmin离心15
异丙醇，混匀；室温静置10min：4℃122000r/mi
min；将上清液移人一新离心管中，加人0.5mL三氯n小心吸取上层无色水相到新离心管中；加人等体积离心
10min·充上清液，加
人1mL75%的冷乙醇洗
于30μLDEPC-H0中，
室温下充分干燥后溶
涤沉淀：4℃10000r/min离心10min弃乙醇沉淀于一20℃保存备用。
注：此处以0.1g样品为例进行核酸提取，则时如样品量有变化，加人的试剂可安比例调整：或者按照商品化实际检酒
RNA提取试剂盒进行操作。
C.2.2引物序列
上游引物H83：5'-TGGTCCCACTCAGAGCTCAACAAAG-3下游引物C537：5'-ACGCGCAAAAGTGTCGAAATCTAAA-3预期扩增产物大小：455bp
C.2.3反转录
反应体系：20μL；在0.2mLPCR管中加人总RNA1μL，dNTPs(10mmol/L)1μL,DEPC-HzO10μL，引物C537（20μmol/L）2μL，70℃保温5min；冰上放置5min：再加人5×反转录缓冲液4μLRNasin（40U/μL)1μL，M-MLV(200U/μL)1μL，42℃保温1h，得到cDNA后用作PCR的模板C.2.4PCR扩增
反应体系：20μL：在0.2mLPCR管中加人10×PCR缓冲液（含Mg2+）2μLdNTPs（10mmol/L）0.6μL，正向引物及反向引物（均为20μmol/L）各0.5μL，Tag酶（2U/μL)1μL，模板2μL和DEPCHzO13.4μL。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。7
SN/T1618—2017
反应程序：94℃40s，60℃1min，72℃1min，35次循环，72℃10min。注：如采用商品化一步法RT-PCR检测试剂盒，可按照说明书进行操作，将步骤C.2.3和C.2.4合并进行。C.2.5PCR产物琼脂糖凝胶电泳
制备1%的琼脂糖凝胶，按比例混勾电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNAMarker作为分子量标记，进行电泳。电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA条带，并拍摄记录。
C.3结果判定
阳性对照在455bp左右处有条带，阴性对照和空白对照无特异性条带，待测样品出现与阳性对照一致的条带，判定为阳性。
阳性对照在455bp左右处有条带，阴性对照、空白对照及待测样品无特异性条带，判定结果为阴性。
D.1试剂
核酸提取试剂同C.1.1。
附录D
（规范性附录）
实时荧光RT-PCR检测
TaqManOne-stepRT-PCRMixture。D.2
引物探针
上游引物PNRSV-F：5'-AATGCCCTGTCTAGGAAGGGGTT-3下游引物PNRSV-R：5'-CGCAAAAGTGTCGAAATCTAAATC-3SN/T1618—2017
探针PNRSV-Probe：5'-FAM-GGTTCTTGAAGGACCAACCGAGAGG-TAMRA-3核酸提取
方法同C.2.1。
实时荧光RT-PCR反应
反应体系：0.2mL离心管中加人2XOneStepRT-PCR缓冲液Ⅲ10μL，ExTaqHS(5U/μL）O.4μL,PrimeScriptRTEnzymeMixII0.4μL,PNRSV-F(1oμmol/L)o.4μL,PNRSV-R(1oμmol/L)o.4μLPNRSV-Probe(loμmol/L)0.6μL.ROXReferenceDyeIO.4μL,模板RNA2μL.补DEPC-HzO至20μL。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应程序：42℃10min；95℃10s；95℃15s，62℃1min，共45个循环。D.5结果判定
在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值<30并出现典刑扩增曲线的条件下：
待测样品的Ct值≥4O时，判定PNRSV阴性。待测样品的Ct值<35时，判定PNRSV阳性。待测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试；如果重新测试的Ct值≥40，判定PNRSV阴性；如果重新测试的Ct值小于40而大于35，且分离曲线明显时，则判定结果为阳性。9
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代替SN/T1618—2005
李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Prunus necrotic ringspot virus2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准代替SN/T1618—2005《李属坏死环斑病毒检测方法》。本标准与SN/T1618—2005相比，主要技术变化如下：增加了实时荧光RT-PCR检测方法本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：李桂芬、魏梅生、张永江、马洁、孔君。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1618—2005。
SN/T1618—2017
1范围
李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法本标准规定了植物检疫中李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法。本标准适用于植物材料中李属坏死环斑病毒的检疫鉴定。2基本信息
学名：Prunus necrotic ringspot virus缩写：PNRSV
分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromouirus），等轴不稳环斑病毒属（Ilaruirus）。该病毒的其他信息参见附录A。
3方法原理
SN/T1618—2017
根据李属坏死环斑病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行ELISA检测；根据该病毒核酸序列进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定；根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过检测荧光信号进行结果判定。仪器设备及试剂
4.1仪器设备
酶标仪、天平（感量，1/10000g）、pH计、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。微量移液器（2μL、10μL20μL、100μL、200μL、1000μL）、酶联板、研钵、离心管、花盆、消毒土等。4.2试剂
酶联免疫吸附测定试剂见附录B中B.1,RT-PCR检测试剂见附录C中C.1，实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D中D.1。
样品制备
木本寄主植物选其幼叶，果肉组织和花，草本植物选其叶子。有症状的样品编号单独检测，没有症状的样品分组（1015为1组）并编号检测。6
检测方法
酶联免疫吸附测定
见附录B。
SN/T1618—2017
6.2RT-PCR检测
见附录C。
实时荧光RT-PCR检测
见附录D。
结果判定
样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行首先采用DAS-ELISA进行初步筛检若DAS-ELISA检测结果为阳性时
RT-PCR的检测结果为阳性，则判定样品携带PNRSV；或采用实时荧光RT-PCR进行检测，若检测结果为阳性，则判定样品携带PNRSV。若DAS-ELISA检测结果为阴性时，RT-PCR的检测结果为阴性，则判定样品不携带PNRSV；检测结果为阳性，则对产物进行测序，测定的序列为PNRSV序列，则判定样品携带PNRSV。8样品保存
经检测确定携带李属坏死环斑病毒的样品（叶片、花、果实）一80℃保存一年，做好标记和登记工作。
9结果记录与资料保存
完整的记录包括：样品的来源、时间、地点、方法和结果等并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR检测需要有反应原始数据。
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
李属坏死环斑病毒背景资料
SN/T1618—2017
李属坏死环斑病毒病寄主范围十分广泛，自然和人工条件下，病毒可侵染的寄主达21科双子叶植物，其中可侵染的木本植物有：李属的欧洲李（P）桃属的桃（Amygdaluspersica）、楼属的欧洲甜樱桃（Cerasusavium）、樱属的欧洲酸樱桃（Cerasusuulgaris）、杏属的杏（Armeniacavul-garis）、苹果属的苹果（Maluspumila）、蔷薇属的月季花（Rosa chinensis）、悬钩子属的椭圆悬钩子（Ru-busellipticus）、秋海棠属的秋海棠（Begonia侵染的草本植物有啤酒花（Humuluslupulus）烟草（Nicotianutabacum）、西瓜（CitrullusLanatus）、南瓜（Cucurbitetamoschata），甜瓜（Cucumis
melo）、西葫芦（Cucurbitapepo），菜豆（Phaseolusgaris）、豌豆（Pisumsatiuum），豇豆（Vignaun-guiculata），草木犀（Melilotusofficinalis）、葛苣（Lactuca(Liliumbrownii）等。
A.2病害症状
）向日葵（Helianthusannuus）、百合病害症状因分离物、栽培种和环境条件不同而不同。病毒的一些分离物不引起症状，仅仅在接种指一些分离物在系统侵染的当年在幼叶上产生坏死斑示植物或用血清学等方法检测时才能发现被侵染和孔洞，但在以后的年份里，在叶子和果实上很少出现症状：另一些分离物在侵染当年产生坏死反应，随后是慢性的褪绿、斑驳和坏死、叶子耳突、畸形、延迟水果成熟，水果上有斑点症状。如在甜樱桃上出现了从无症状到严重皱缩花叶症状，慢性症状包括状因病毒分离物不同而不同。在月季上症状
、叶扭曲，水果
子上的褪绿点
延迟成熟几天至几周，症
浸染很音
多不成形的花，被侵染的植株通常无活力。在
A.3分布地区
分布地区广泛，如欧洲各国和美国都有发生A.4传播方式
遍·症
犬有花叶
开花延迟、秋天落叶早、产生更产生褪绿线和环斑
机械接种传播、花粉传播、种子传播，也可通过无性繁殖的苗木、组培苗等的运输进行长距离传播A.5粒体形态
等轴对称球状体，直径23nm～27nm，有些粒体为准等轴球状到短棒状（轴比为1.01～1.5）；有些株系的粒体呈明显的棒状（轴比大于2.2）：有些棒状粒体达70nm。棒状粒体的有无及比例因株系而异。
SN/T1618—2017
基因组
正单链RNA，3分体基因组，RNA-1长3.662kb，RNA-2长2.507kb，RNA-3长1.887kbB.1试剂
包被抗体
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）特异性的李属坏死环斑病毒抗体。B.1.2
酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的李属坏死环斑病毒抗体。底物
对硝基苯磷酸二钠（pNPP）。
1×PBST缓冲液（pH7.4）
氯化钠（NaCI)
磷酸二氢钾（KH2PO）
磷酸氢二钠（NazHPO）
氯化钾（KCI）
吐温-20（Tween-20）
溶于900mL蒸馏水中，并定容至1000mL，4℃储存。5样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸钠（NazSO）
聚乙烯基吡略烷酮（PVP，MW24000~40000）8.0g
溶于900mL的1×PBST中，并用1×PBST定容至1000mL，4℃储存。B.1.6
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碳酸钠（NazCO）
碳酸氢钠（NaHCO）
溶于900mL蒸馏水中，并定容至1000mL，4℃储存。B.1.7
酶标抗体稀释缓冲液（PH7.4）
牛血清白蛋白（BSA）
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW24000~40000）1.59g
溶于900mL1×PBST中，并用1XPBST定容至1000mL，4℃储存。3底物缓冲液（pH9.8）
二乙醇胺
SN/T16182017
SN/T1618—2017
氯化镁（MgCl）
溶于800mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCI）调pH至9.8，定容至1000mL，4℃储存。B.2实验步骤
B.2.1包被抗体
按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，加人到酶联板孔中，每孔100L。酶联板加盖或用保鲜膜包好，37℃C孵育2h。清空孔中溶液，用1×PBST加满各孔，3min后倒掉孔中溶液在吸水纸上拍干。再重复2次上述洗板过程。B.2.2样品制备与加样
待测样品按1：10加人样品抽提缓冲液，在研钵中研磨：2000r/min离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照做相应处理或按说明书进行。按100L/孔分别加入制备好的检测样品、阴性对照和阳性对照：酶联板加盖或用保鲜膜包好.4℃孵育过夜。酶联板用自来水彻底冲洗，
再用1×PBST洗涤3次，每次3minB.2.3加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加人到酶联板中，100μL/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好，37℃孵育4h。酶联板用自来水彻底冲洗，再用1×PBST洗涤3次，每次3min。B.2.4加底物
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1m/mL（现配现用）100μL/孔加人到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.5读数
在不同的时间内如30min，60min.90min、120min或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值。B.3结果判定
B.3.1质量控制要求
对照孔的ODos值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔）应在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值<0.15，当阴性对照孔的OD405值0.05时，按0.05计算：阳性对照OD405值/阴性对照OD405值>5：同一样品的重复性基本一致。B.3.2结果判定
在满足B.3.1的质量控制要求后，结果原则上可判定如下：样品ODa05值/阴性对照OD405值>2，判为阳性：样品OD405值/阴性对照OD405值在2左右，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证：样品OD45值/阴性对照OD%值<2，判为阴性若不满足B.3.1的质量控制要求，则不能进行结果判定。C.1试剂
C.1.1核酸提取试剂
Trizol或合格的RNA提取试剂盒。C.1.2电泳缓冲液TAE（50×）
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰乙酸（CHO2）
乙二胺四乙酸二钠（Naz2EDTA·2H,O）附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
双蒸水定容至1000mL，用时稀释至1×TAE。C.2检测步骤
C.2.1核酸提取
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称取0.1g样品加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人灭菌的l.5mL离心管中，加人1mL的TrizoL试剂，剧烈震荡3min；4℃12000r/min离心10甲烷，猛烈震荡15s4℃12000rmin离心15
异丙醇，混匀；室温静置10min：4℃122000r/mi
min；将上清液移人一新离心管中，加人0.5mL三氯n小心吸取上层无色水相到新离心管中；加人等体积离心
10min·充上清液，加
人1mL75%的冷乙醇洗
于30μLDEPC-H0中，
室温下充分干燥后溶
涤沉淀：4℃10000r/min离心10min弃乙醇沉淀于一20℃保存备用。
注：此处以0.1g样品为例进行核酸提取，则时如样品量有变化，加人的试剂可安比例调整：或者按照商品化实际检酒
RNA提取试剂盒进行操作。
C.2.2引物序列
上游引物H83：5'-TGGTCCCACTCAGAGCTCAACAAAG-3下游引物C537：5'-ACGCGCAAAAGTGTCGAAATCTAAA-3预期扩增产物大小：455bp
C.2.3反转录
反应体系：20μL；在0.2mLPCR管中加人总RNA1μL，dNTPs(10mmol/L)1μL,DEPC-HzO10μL，引物C537（20μmol/L）2μL，70℃保温5min；冰上放置5min：再加人5×反转录缓冲液4μLRNasin（40U/μL)1μL，M-MLV(200U/μL)1μL，42℃保温1h，得到cDNA后用作PCR的模板C.2.4PCR扩增
反应体系：20μL：在0.2mLPCR管中加人10×PCR缓冲液（含Mg2+）2μLdNTPs（10mmol/L）0.6μL，正向引物及反向引物（均为20μmol/L）各0.5μL，Tag酶（2U/μL)1μL，模板2μL和DEPCHzO13.4μL。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。7
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反应程序：94℃40s，60℃1min，72℃1min，35次循环，72℃10min。注：如采用商品化一步法RT-PCR检测试剂盒，可按照说明书进行操作，将步骤C.2.3和C.2.4合并进行。C.2.5PCR产物琼脂糖凝胶电泳
制备1%的琼脂糖凝胶，按比例混勾电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNAMarker作为分子量标记，进行电泳。电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA条带，并拍摄记录。
C.3结果判定
阳性对照在455bp左右处有条带，阴性对照和空白对照无特异性条带，待测样品出现与阳性对照一致的条带，判定为阳性。
阳性对照在455bp左右处有条带，阴性对照、空白对照及待测样品无特异性条带，判定结果为阴性。
D.1试剂
核酸提取试剂同C.1.1。
附录D
（规范性附录）
实时荧光RT-PCR检测
TaqManOne-stepRT-PCRMixture。D.2
引物探针
上游引物PNRSV-F：5'-AATGCCCTGTCTAGGAAGGGGTT-3下游引物PNRSV-R：5'-CGCAAAAGTGTCGAAATCTAAATC-3SN/T1618—2017
探针PNRSV-Probe：5'-FAM-GGTTCTTGAAGGACCAACCGAGAGG-TAMRA-3核酸提取
方法同C.2.1。
实时荧光RT-PCR反应
反应体系：0.2mL离心管中加人2XOneStepRT-PCR缓冲液Ⅲ10μL，ExTaqHS(5U/μL）O.4μL,PrimeScriptRTEnzymeMixII0.4μL,PNRSV-F(1oμmol/L)o.4μL,PNRSV-R(1oμmol/L)o.4μLPNRSV-Probe(loμmol/L)0.6μL.ROXReferenceDyeIO.4μL,模板RNA2μL.补DEPC-HzO至20μL。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应程序：42℃10min；95℃10s；95℃15s，62℃1min，共45个循环。D.5结果判定
在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值<30并出现典刑扩增曲线的条件下：
待测样品的Ct值≥4O时，判定PNRSV阴性。待测样品的Ct值<35时，判定PNRSV阳性。待测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试；如果重新测试的Ct值≥40，判定PNRSV阴性；如果重新测试的Ct值小于40而大于35，且分离曲线明显时，则判定结果为阳性。9
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