SN/T 1617-2017
基本信息
标准号： SN/T 1617-2017
中文名称：可可肿枝病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：9920393
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1617-2017.Detection and identification of Cacao swollen shoot virus.
1范围
SN/T 1617规定了可可肿枝病毒的检测方法。
SN/T 1617适用于进境植物材料中可可肿枝病毒的检疫检测。
2可可肿枝病毒基本信 息
学名:Cacao swollen shootvirus
缩写:CSSV
中文名:可可肿枝病毒
异名:Theobroma virus 1 ;Marmor theobromae ;T heobromavirus inflans。
分类地位:花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae);杆菌状DNA病毒属( Badnavirus)。
CSSV的其他信息参见附录A。
3方法原理
CSSV的蛋白和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据CSSV与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA);依据CSSV的基因组特征建立PCR、实时荧光PCR;通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有CSSV。
4仪器、用具及试剂
4.1仪器设备
酶联检测仪、天平(感量0.001g)、PCR仪、电泳仪、实时荧光PCR仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅等。
4.2用具
可调移液器(200 pL、20 μL、2 μL)、可调移液器头、酶联板、离心管、指型管、研钵等。
4.3试剂
酶联测定试剂(见附录B)、聚合酶链式反应检测试剂(见附录C)。
1范围
SN/T 1617规定了可可肿枝病毒的检测方法。
SN/T 1617适用于进境植物材料中可可肿枝病毒的检疫检测。
2可可肿枝病毒基本信 息
学名:Cacao swollen shootvirus
缩写:CSSV
中文名:可可肿枝病毒
异名:Theobroma virus 1 ;Marmor theobromae ;T heobromavirus inflans。
分类地位:花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae);杆菌状DNA病毒属( Badnavirus)。
CSSV的其他信息参见附录A。
3方法原理
CSSV的蛋白和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据CSSV与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA);依据CSSV的基因组特征建立PCR、实时荧光PCR;通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有CSSV。
4仪器、用具及试剂
4.1仪器设备
酶联检测仪、天平(感量0.001g)、PCR仪、电泳仪、实时荧光PCR仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅等。
4.2用具
可调移液器(200 pL、20 μL、2 μL)、可调移液器头、酶联板、离心管、指型管、研钵等。
4.3试剂
酶联测定试剂(见附录B)、聚合酶链式反应检测试剂(见附录C)。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1617—2017
代替SN/T1617—2005
可可肿枝病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Cacao swollen shoot virus2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1617—2017
本标准代替SN/T1617—2005《可可肿枝病毒检测方法》，与SN/T1617—2005相比，主要技术变化如下：
一完善了原标准的检测方法，增加实时荧光PCR检测方法；完善了原标准的基因组内容；
删除了原标准中的免疫诱捕PCR方法，增加了PCR方法；修改了原标准中结果判断；
修改了原标准中附录。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国中山出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局本标准主要起草人：魏梅生、陈定虎、相宁、李桂芬、吴翠萍、郭京泽。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1617—2005。
1范围
可可肿枝病毒检疫鉴定方法
本标准规定了可可肿枝病毒的检测方法。本标准适用于进境植物材料中可可肿枝病毒的检疫检测，2可可肿枝病毒基本信息
学名：Cacaoswollen shootvirus缩写：CSSV
中文名：可可肿枝病毒
异名：Theobroma virus l;Marmor theobromaeTheobromavirus inflans
SN/T1617-2017
分类地位：花椰菜花叶病毒科（Caulimouiridae）：杆菌状DNA病毒属（Badnavirus）。CSSV的其他信息参见附录
3方法原理
CSSV的蛋白和基因组特征是该病检疫鉴定的依据。根据 CSSV与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA)：依据CSSV的基因组特征建立PCR实时荧光PCR；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有CSSV4仪器，用具及试剂
4.1仪器设备
酶联检测仪、天平（感量0.001g）、PCR仪、电泳仪、实时荧光PCR仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅等。
4.2用具
可调移液器（200μL、20μL、2μL）、可调移液器头、酶联板、离心管、指型管、研钵等。4.3试剂
酶联测定试剂(见附录B)、聚合酶链式反应检测试剂(见附录C)。5检测方法
5.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定见附录B。
SN/T1617—2017
2聚合酶链式反应（PCR）检测
见附录C。
3实时荧光PCR检测
见附录D。
生物学测定
参见附录E。
6结果判定
样品检测流程及结果判定按下述原则进行。若DAS-ELISA检测结果为阳性时：PCR的检测结果为阳性，则判定样品携带CSSV；或采用实时荧光PCR进行检测，若检测结果为阳性，则判定样品携带CSSV。若DAS-ELISA检测结果为阴性时：PCR的检测结果为阴性，则判定样品不携带CSSV：检测结果为阳性，则对产物进行测序，测定的序列为CSSV序列，则判定样品携带CSSV。必要时可进行生物学传毒测定，并进行复验。7样品保存与复核
7.1样品保存
鉴于可可肿枝病毒为检疫性有害生物，应做好以下准备，并在一周内接受复核。病毒要有活体样品存在，其他样品应妥善保存于一80℃冰箱中，以备复核。结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。生物学测定需有鉴别寄主的症状照片，酶联测定需有酶联板反应的照片和原始数据，PCR检测需有电泳结果照片.实时荧光PCR检测应有荧光曲线图。7.3复核
由指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
可可肿枝病毒其他信息
SN/T1617—2017
重要的自然寄主有可可（Theobromacacao），厚皮可乐果（Colachlamydantha），吉贝（Ceibapentandra）大可乐果变近无毛变种（Colagiganteanvar.glabrescens）和一种苹婆属植物Sterculiatragacantha。人工接种还可侵染木棉科（Bombacaceae）、树科（Tiliaciae）、梧桐科（Sterculiaceae），锦葵科（Malvaceae）等3o种植物，其中猴面包树（Adansniadigitata）和Colacordifolia易感病。A.2病害症状
A.2.1肿枝
生长较快的枝条节，节间和未梢发生肿大，一些分离物还能使根部，特别是根尖产生肿大，有时侧根坏死。肿茎和肿根症状中，次生木质部和韧皮部都有所增加，但木质部不发生坏死。A.2.2叶片bZxz.net
叶片上的症状最初表现出明脉，形成网纹状，接着沿叶脉变红，随着叶片变绿而坚硬，红脉逐渐消火，有的叶片则产生褪绿，叶片褪绿斑部分组织不分化，其中有小型退化的叶绿体，细胞间隙缩小。A.2.3果实
幼嫩的果英，形成墨绿或浅绿的斑驳，后期则发展成深红色大理石状纹。受侵果英呈圆形比正常的果荚小，其中可可豆的重量只有健康的一半，可可豆比正常的要扁平，子叶呈灰白色A.3分布
分布于加纳、科特迪瓦尼日利亚，多哥，塞拉利昂、斯里兰卡，印度尼西亚。A.4传播途径
可可肿枝病毒可通过嫁接、机械接种和多种粉传播。在自然状况下，CSSV主要通过粉来传播，粉传播最主要的种有尼兰粉（Planococcoidesnjalensis）、肯尼亚咖啡粉（Planococcuskenyae）、橘粉（Planococcuscitri）和热带弗氏粉（Ferrisiairgata）。若虫和雌成虫是有效的传毒介体，但雄成虫不传播病毒，粉的传毒机制比较接近于半持久性，但尼兰粉若虫在饲毒后蜕皮仍有保毒能力。
A.5粒体形态
可可肿枝病毒粒体杆菌状，长度为121nm~130nm，宽为28nm3
SN/T1617—2017
基因组
病毒基因组为双链环状DNA，有2个不连续区，基因组全序列为7006bp～7297bp。具有5个开放式阅读框架（ORF），分别为ORFI、ORF2、ORF3、ORFX和ORFY。它们分别编码16.7kDa蛋白、14.4kDa核酸结合蛋白、211kDa多聚蛋白（细胞间移动蛋白、外壳蛋白的RNA结合区域、天冬氨酰蛋白酶、反转录酶、核糖核酸酶H)、13kDa和14kDa蛋白。B.1试材
酶联板的要求
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
使用质量有保证厂商生产的酶联板B.1.2包被抗体
特异性的可可肿枝病毒抗体。
酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的可可肿枝病毒抗体B.1.4底物
对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。
B.1.5样品抽提缓冲液（pH7.4）PBST
亚硫酸钠（NaSO）
聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW24000叠氮化钠（NaNa）
4℃储存。
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO）
碳酸氢钠（NaHCO）
叠氮化钠（NaN）
蒸馏水定容至1L，4℃储荐。
B.1.7PBST缓冲液（洗条缓冲液PH7.4）氯化钠（NaCI）
磷酸氢二钠（NazHPO,）
磷酸二氢钾（KHPO）
氯化钾（KCD）
吐温-20（Tween-20）
蒸馏水定容至1L。
酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）
SN/T1617—2017
SN/T1617-—2017
牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW24000~40000）叠氮化钠（NaN.）
4℃储存。
B.1.9底物（pNPP)缓冲液（pH9.8）氯化镁（MgClz）
叠氮化钠（NaNa）
二乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用HCI调pH值至9.8，蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.2程序
B.2.1包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加人酶联板的孔中，100μL/孔，加盖，37℃孵育2h，清空孔中溶液，PBST洗涤3次，每次3min。
B.2.2样品制备
待测样品按1：10（质量：体积，加人抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000r/min离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B.2.3加样
加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，100μL/孔，加盖，4℃冰箱孵育过夜，取出的酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3min。B.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加人到酶联板中，100μL/孔，加盖，37℃孵育4h，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3min。B.2.5加底物
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），按100μL/孔，加人到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.6读数
在不同的时间内如30min、1h、2h或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值，或用肉眼观察显色情况。
B.3结果判断
B.3.1对照孔的OD4os值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值<0.15，当阴性对照孔的OD405值<0.05时，按0.05计算；阳性对照OD40s值/阴性对照OD40s值>5～10；孔的重复性基本一致。6
2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：B.3.2
SN/T1617—2017
样品OD4o5值/阴性对照ODao5值>2，判为阳性；样品OD40s值/阴性对照OD405值在阅值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证；样品OD4o5值/阴性对照ODaos值<2，判为阴性。3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判断。B.3.3
SN/T1617—2017
C.1试剂
C.1.1核酸提取试剂
商品化的植物DNA提取试剂盒
C.1.23mol/L醋酸钠（pH5.2)
附录C
（规范性附录）
PCR检测
称取408.1g含3个分子结晶水的乙酸钠，溶于800mL水中，用冰乙酸调至pH5.2，定容至1L，分装高压灭菌。
C.1.350×TAE
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰醋酸
乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H,O)242g
加蒸馏水至1L。用时加蒸馏水稀释至1×TAE。C.1.46×加样缓冲液
0.25%溴酚蓝。
40%蔗糖蒸馏水溶液。
C.2实验步骤
C.2.1核酸提取
按商品化的试剂盒说明书操作。C.2.2引物
正向引物（CSSV-f)：5'-AACCTTGAGTACCTTGACCT-3反向引物（CSSV-r）：5'-TCATTGACCAACCCACTGGTCAAG-3PCR产物大小为375bp。
C.2.3PCR反应
反应体系：20μL；在0.2mLPCR管中加入10×PCR缓冲液（含Mg+）2μL，dNTPs(10mmol/L）0.6μL，CSSV正向及反向引物（均为20μmol/L)各0.5μL，TaqDNA聚合酶（2U/μL)1μL，模板2μL和灭菌的ddHzO13.4μL。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应程序：95℃15min；94℃30s.56℃90s.72℃60s，35个循环；60℃30min。反应结束后，取5uLPCR产物进行琼脂糖电泳。8
C.2.4琼脂糖电泳
C.2.4.1制备凝胶
将TAE和电泳级琼脂糖按1.5%配好，在微波炉中熔化混勾，冷却至55℃左右。C.2.4.2加溴化乙锭
SN/T1617—2017
加人溴化乙锭浓度为0.5g/mL，混匀，倒入已封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加人足够量的TAE（缓冲液没过凝胶表面约1mm）。C.2.4.3加样
用适量的（约1μL～2μL)6×加样缓冲液分别与5μL样品混合，然后将其和适合的DNA分子量标准物分别加人到样品孔中。
C.2.4.4电泳
接通电源使DNA向阳极移动。当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，关闭电源。将整个胶置于紫外透射仪上观察。C.3结果判断
通过观察，若有相应大小的产物带出现，即S
SN/T1617—2017
D.1试剂
核酸提取试剂同C.1.1。
引物探针
附录D
（规范性附录）
实时荧光PCR检测
上游引物（CSSV-F)：5'-CCTTAAGAGGCTAACCAAGC-3下游引物（CSSV-R)：5'-GGGCTATCTCTTCTACTAGTC-3TaqMan探针(CSSV-Probe)：5'-FAM-TTCCGAGAAAACAAACCACTGTCTGAA-TAMRA-3D.3
核酸提取
方法同C.2.1。
D.4实时荧光PCR反应
反应体系：0.2mL离心管中加人10×PCR缓冲液（含有Mg2+）2.5μL，dNTP（10mmol/L)1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL,CSSV-F(10μmol/L)0.4μL,CSSV-R(10μmol/L)0.4μL,CSSVProbe(10μmol/L)0.6μL,ROXReferenceDyeI0.4μL，模板DNA2μL，补灭菌的ddHzO至20μL。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应程序：95℃10s，95℃15s，60℃60s，共40个循环。D.5结果判定
在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值≤30并出现典型扩增曲线的条件下：
待测样品的Ct值≥40时，判定CSSV阴性。待测样品的Ct值≤35时，判定CSSV阳性。待测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试；如果重新测试的Ct值≥40，判定CSSV阴性：如果重新测试的Ct值小于40而大于35，且分离曲线明显时，则判定结果为阳性。10
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代替SN/T1617—2005
可可肿枝病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Cacao swollen shoot virus2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1617—2017
本标准代替SN/T1617—2005《可可肿枝病毒检测方法》，与SN/T1617—2005相比，主要技术变化如下：
一完善了原标准的检测方法，增加实时荧光PCR检测方法；完善了原标准的基因组内容；
删除了原标准中的免疫诱捕PCR方法，增加了PCR方法；修改了原标准中结果判断；
修改了原标准中附录。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国中山出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局本标准主要起草人：魏梅生、陈定虎、相宁、李桂芬、吴翠萍、郭京泽。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1617—2005。
1范围
可可肿枝病毒检疫鉴定方法
本标准规定了可可肿枝病毒的检测方法。本标准适用于进境植物材料中可可肿枝病毒的检疫检测，2可可肿枝病毒基本信息
学名：Cacaoswollen shootvirus缩写：CSSV
中文名：可可肿枝病毒
异名：Theobroma virus l;Marmor theobromaeTheobromavirus inflans
SN/T1617-2017
分类地位：花椰菜花叶病毒科（Caulimouiridae）：杆菌状DNA病毒属（Badnavirus）。CSSV的其他信息参见附录
3方法原理
CSSV的蛋白和基因组特征是该病检疫鉴定的依据。根据 CSSV与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA)：依据CSSV的基因组特征建立PCR实时荧光PCR；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有CSSV4仪器，用具及试剂
4.1仪器设备
酶联检测仪、天平（感量0.001g）、PCR仪、电泳仪、实时荧光PCR仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅等。
4.2用具
可调移液器（200μL、20μL、2μL）、可调移液器头、酶联板、离心管、指型管、研钵等。4.3试剂
酶联测定试剂(见附录B)、聚合酶链式反应检测试剂(见附录C)。5检测方法
5.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定见附录B。
SN/T1617—2017
2聚合酶链式反应（PCR）检测
见附录C。
3实时荧光PCR检测
见附录D。
生物学测定
参见附录E。
6结果判定
样品检测流程及结果判定按下述原则进行。若DAS-ELISA检测结果为阳性时：PCR的检测结果为阳性，则判定样品携带CSSV；或采用实时荧光PCR进行检测，若检测结果为阳性，则判定样品携带CSSV。若DAS-ELISA检测结果为阴性时：PCR的检测结果为阴性，则判定样品不携带CSSV：检测结果为阳性，则对产物进行测序，测定的序列为CSSV序列，则判定样品携带CSSV。必要时可进行生物学传毒测定，并进行复验。7样品保存与复核
7.1样品保存
鉴于可可肿枝病毒为检疫性有害生物，应做好以下准备，并在一周内接受复核。病毒要有活体样品存在，其他样品应妥善保存于一80℃冰箱中，以备复核。结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。生物学测定需有鉴别寄主的症状照片，酶联测定需有酶联板反应的照片和原始数据，PCR检测需有电泳结果照片.实时荧光PCR检测应有荧光曲线图。7.3复核
由指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
可可肿枝病毒其他信息
SN/T1617—2017
重要的自然寄主有可可（Theobromacacao），厚皮可乐果（Colachlamydantha），吉贝（Ceibapentandra）大可乐果变近无毛变种（Colagiganteanvar.glabrescens）和一种苹婆属植物Sterculiatragacantha。人工接种还可侵染木棉科（Bombacaceae）、树科（Tiliaciae）、梧桐科（Sterculiaceae），锦葵科（Malvaceae）等3o种植物，其中猴面包树（Adansniadigitata）和Colacordifolia易感病。A.2病害症状
A.2.1肿枝
生长较快的枝条节，节间和未梢发生肿大，一些分离物还能使根部，特别是根尖产生肿大，有时侧根坏死。肿茎和肿根症状中，次生木质部和韧皮部都有所增加，但木质部不发生坏死。A.2.2叶片bZxz.net
叶片上的症状最初表现出明脉，形成网纹状，接着沿叶脉变红，随着叶片变绿而坚硬，红脉逐渐消火，有的叶片则产生褪绿，叶片褪绿斑部分组织不分化，其中有小型退化的叶绿体，细胞间隙缩小。A.2.3果实
幼嫩的果英，形成墨绿或浅绿的斑驳，后期则发展成深红色大理石状纹。受侵果英呈圆形比正常的果荚小，其中可可豆的重量只有健康的一半，可可豆比正常的要扁平，子叶呈灰白色A.3分布
分布于加纳、科特迪瓦尼日利亚，多哥，塞拉利昂、斯里兰卡，印度尼西亚。A.4传播途径
可可肿枝病毒可通过嫁接、机械接种和多种粉传播。在自然状况下，CSSV主要通过粉来传播，粉传播最主要的种有尼兰粉（Planococcoidesnjalensis）、肯尼亚咖啡粉（Planococcuskenyae）、橘粉（Planococcuscitri）和热带弗氏粉（Ferrisiairgata）。若虫和雌成虫是有效的传毒介体，但雄成虫不传播病毒，粉的传毒机制比较接近于半持久性，但尼兰粉若虫在饲毒后蜕皮仍有保毒能力。
A.5粒体形态
可可肿枝病毒粒体杆菌状，长度为121nm~130nm，宽为28nm3
SN/T1617—2017
基因组
病毒基因组为双链环状DNA，有2个不连续区，基因组全序列为7006bp～7297bp。具有5个开放式阅读框架（ORF），分别为ORFI、ORF2、ORF3、ORFX和ORFY。它们分别编码16.7kDa蛋白、14.4kDa核酸结合蛋白、211kDa多聚蛋白（细胞间移动蛋白、外壳蛋白的RNA结合区域、天冬氨酰蛋白酶、反转录酶、核糖核酸酶H)、13kDa和14kDa蛋白。B.1试材
酶联板的要求
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
使用质量有保证厂商生产的酶联板B.1.2包被抗体
特异性的可可肿枝病毒抗体。
酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的可可肿枝病毒抗体B.1.4底物
对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。
B.1.5样品抽提缓冲液（pH7.4）PBST
亚硫酸钠（NaSO）
聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW24000叠氮化钠（NaNa）
4℃储存。
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO）
碳酸氢钠（NaHCO）
叠氮化钠（NaN）
蒸馏水定容至1L，4℃储荐。
B.1.7PBST缓冲液（洗条缓冲液PH7.4）氯化钠（NaCI）
磷酸氢二钠（NazHPO,）
磷酸二氢钾（KHPO）
氯化钾（KCD）
吐温-20（Tween-20）
蒸馏水定容至1L。
酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）
SN/T1617—2017
SN/T1617-—2017
牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW24000~40000）叠氮化钠（NaN.）
4℃储存。
B.1.9底物（pNPP)缓冲液（pH9.8）氯化镁（MgClz）
叠氮化钠（NaNa）
二乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用HCI调pH值至9.8，蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.2程序
B.2.1包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加人酶联板的孔中，100μL/孔，加盖，37℃孵育2h，清空孔中溶液，PBST洗涤3次，每次3min。
B.2.2样品制备
待测样品按1：10（质量：体积，加人抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000r/min离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B.2.3加样
加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，100μL/孔，加盖，4℃冰箱孵育过夜，取出的酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3min。B.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加人到酶联板中，100μL/孔，加盖，37℃孵育4h，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3min。B.2.5加底物
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），按100μL/孔，加人到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.6读数
在不同的时间内如30min、1h、2h或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值，或用肉眼观察显色情况。
B.3结果判断
B.3.1对照孔的OD4os值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值<0.15，当阴性对照孔的OD405值<0.05时，按0.05计算；阳性对照OD40s值/阴性对照OD40s值>5～10；孔的重复性基本一致。6
2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：B.3.2
SN/T1617—2017
样品OD4o5值/阴性对照ODao5值>2，判为阳性；样品OD40s值/阴性对照OD405值在阅值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证；样品OD4o5值/阴性对照ODaos值<2，判为阴性。3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判断。B.3.3
SN/T1617—2017
C.1试剂
C.1.1核酸提取试剂
商品化的植物DNA提取试剂盒
C.1.23mol/L醋酸钠（pH5.2)
附录C
（规范性附录）
PCR检测
称取408.1g含3个分子结晶水的乙酸钠，溶于800mL水中，用冰乙酸调至pH5.2，定容至1L，分装高压灭菌。
C.1.350×TAE
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰醋酸
乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H,O)242g
加蒸馏水至1L。用时加蒸馏水稀释至1×TAE。C.1.46×加样缓冲液
0.25%溴酚蓝。
40%蔗糖蒸馏水溶液。
C.2实验步骤
C.2.1核酸提取
按商品化的试剂盒说明书操作。C.2.2引物
正向引物（CSSV-f)：5'-AACCTTGAGTACCTTGACCT-3反向引物（CSSV-r）：5'-TCATTGACCAACCCACTGGTCAAG-3PCR产物大小为375bp。
C.2.3PCR反应
反应体系：20μL；在0.2mLPCR管中加入10×PCR缓冲液（含Mg+）2μL，dNTPs(10mmol/L）0.6μL，CSSV正向及反向引物（均为20μmol/L)各0.5μL，TaqDNA聚合酶（2U/μL)1μL，模板2μL和灭菌的ddHzO13.4μL。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应程序：95℃15min；94℃30s.56℃90s.72℃60s，35个循环；60℃30min。反应结束后，取5uLPCR产物进行琼脂糖电泳。8
C.2.4琼脂糖电泳
C.2.4.1制备凝胶
将TAE和电泳级琼脂糖按1.5%配好，在微波炉中熔化混勾，冷却至55℃左右。C.2.4.2加溴化乙锭
SN/T1617—2017
加人溴化乙锭浓度为0.5g/mL，混匀，倒入已封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加人足够量的TAE（缓冲液没过凝胶表面约1mm）。C.2.4.3加样
用适量的（约1μL～2μL)6×加样缓冲液分别与5μL样品混合，然后将其和适合的DNA分子量标准物分别加人到样品孔中。
C.2.4.4电泳
接通电源使DNA向阳极移动。当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，关闭电源。将整个胶置于紫外透射仪上观察。C.3结果判断
通过观察，若有相应大小的产物带出现，即S
SN/T1617—2017
D.1试剂
核酸提取试剂同C.1.1。
引物探针
附录D
（规范性附录）
实时荧光PCR检测
上游引物（CSSV-F)：5'-CCTTAAGAGGCTAACCAAGC-3下游引物（CSSV-R)：5'-GGGCTATCTCTTCTACTAGTC-3TaqMan探针(CSSV-Probe)：5'-FAM-TTCCGAGAAAACAAACCACTGTCTGAA-TAMRA-3D.3
核酸提取
方法同C.2.1。
D.4实时荧光PCR反应
反应体系：0.2mL离心管中加人10×PCR缓冲液（含有Mg2+）2.5μL，dNTP（10mmol/L)1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL,CSSV-F(10μmol/L)0.4μL,CSSV-R(10μmol/L)0.4μL,CSSVProbe(10μmol/L)0.6μL,ROXReferenceDyeI0.4μL，模板DNA2μL，补灭菌的ddHzO至20μL。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。反应程序：95℃10s，95℃15s，60℃60s，共40个循环。D.5结果判定
在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值≤30并出现典型扩增曲线的条件下：
待测样品的Ct值≥40时，判定CSSV阴性。待测样品的Ct值≤35时，判定CSSV阳性。待测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试；如果重新测试的Ct值≥40，判定CSSV阴性：如果重新测试的Ct值小于40而大于35，且分离曲线明显时，则判定结果为阳性。10
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