SN/T 1501-2015.Quarantine protocol for tularemia.
1范围
SN/T 1501规定了野兔热(土拉杆菌病)的临床诊断、土拉杆菌的显微镜检查.细菌培养.聚合酶链反应、试管凝集试验和动物试验等技术要求。
SN/T 1501适用于进出口动物及其产品中野兔热的检疫。
2规范性引用文件 .
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安 全通用要求
SN/T 1088布 氏杆菌检疫技术规范
SN/T 1193基因检 验实验室技术要求
SN/T 2025动物检疫实验室生物安 全操作规范
3生物安全和防污染措施
野兔热是农业部规定的二类动物疫病,其病原为土拉杆菌,该菌的大量活菌操作和动物感染试验需在生物安全3级实验室进行,样本的病原菌分离纯化、生化试验、免疫学试验、PCR的核酸提取、涂片、显微镜观察等的样本检测操作需在生物安全2级实验室进行,非感染材料的实验可在生物安全1级实验室进行。检验过程的生物安全措施应符合GB19489和SN/T2025,检验过程的基因防污染措施应符合SN/T 1193。
4临床诊断
野兔热简介参见附录A,野兔热的发病症状与病理变化参见附录B。
5实验室诊断
5.1样品采集
5.1.1对死亡 或濒死动物,无菌采取病变器官内外炎性、纤维素性或出血性渗出物、全血及肝、脾、骨髓、肾、肺、淋巴结等样品。对活动物,采集全血、淋巴结或淋巴液、穿刺液等样品。对动物产品,可采集内脏组织、淋巴结、骨髓、肉或皮毛等样品。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1501—2015
代替SN/T1501—2004
野兔热检疫技术规范
Quarantineprotocol fortularemia2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1501—2004《野免热病原分离鉴定操作规程》。本标准与SN/T1501相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：一增加临床诊断；
增加聚合酶链反应(PCR)和荧光聚合酶链反应(荧光PCR)：删除了细菌生化试验，具体内容在附录A中介绍。SN/T1501—2015
本标准修改采用OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2008版）（ManualofDiagnosticTestsandVaccines forTerrestrialAnimals)中第2.1.18章。本标准与OIE第2.1.18章相比，主要技术差异如下：-本标准等同采用OIE规定的病原分离鉴定和试管凝集试验：本标准增加了OIE中提及但没有详细操作规程的聚合酶链反应（PCR）和荧光聚合酶链反应（荧光PCR)的具体试验步骤：
本标准未采纳OIE中提及但没有详细操作规程的免疫荧光（FAT）和酶联免疫吸附试验(ELISA)。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国山西出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局。本标准主要起草人：唐泰山、高峰、廉慧锋、张吉红、黄素文、方绍庆、张常印、张睿、王凯民、姜焱、陈国强、祝长青。
1范围
野兔热检疫技术规范
SN/T1501-2015
本标准规定了野兔热（土拉杆菌病)的临床诊断、土拉杆菌的显微镜检查、细菌培养、聚合酶链反应、试管凝集试验和动物试验等技术要求。本标准适用于进出口动物及其产品中野兔热的检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1088布氏杆菌检疫技术规范SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T2025
动物检疫实验室生物安全操作规范3生物安全和防污染措施
野免热是农业部规定的二类动物疫病，其病原为土拉杆菌，该菌的大量活菌操作和动物感染试验需在生物安全3级实验室进行，样本的病原菌分离纯化、生化试验、免疫学试验，PCR的核酸提取、涂片、显微镜观察等的样本检测操作需在生物安全2级实验室进行，非感染材料的实验可在生物安全1级实验室进行。检验过程的生物安全措施应符合GB19489和SN/T2025，检验过程的基因防污染措施应符合SN/T1193。
4临床诊断
野免热简介参见附录A，野兔热的发病症状与病理变化参见附录B。5实验室诊断
5.1样品采集
5.1.1对死亡或濒死动物，无菌采取病变器官内外炎性、纤维素性或出血性渗出物、全血及肝、脾、骨髓、肾、肺、淋巴结等样品。对活动物，采集全血、淋巴结或淋巴液、穿刺液等样品。对动物产品，可采集内脏组织、淋巴结、骨髓、肉或皮毛等样品。5.1.2疑似样本的采集需要做好生物安全防护，样品的采集和包装应采用无菌器具，样本采集后应密封，冷藏并立即用最快的方式运送到实验室。5.1.3以细菌培养诊断动物感染土拉杆菌时，样品的选择应以观察到的临床症状或检观察到病理变化为依据，最有用的样品包括肝、脾、骨髓、肾、肺、淋巴结和血液。土拉杆菌在低温条件下存活时间较1
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长，阳光直射，紫外线，60C高温和常规消毒剂可很快将其杀死，它们在产品不同部位的分布与特殊加工工艺造成的物理化学条件、包装运输保存条件等有关。5.1.4严重污染或含菌量少的样本，进行动物接种可提高检出率，但除非绝对必要，尽量避免使用动物试验。
5.2显微镜检查
5.2.1试剂
3%盐酸酒精、结晶紫染色液，革兰氏碘液、沙黄复染液，配制方法见附录C。5.2.2主要设备和材料
显微镜，酒精灯、载玻片，盖玻片。5.2.3试验程序
5.2.3.1涂片制备
肝、脾、骨髓、肾、肺等组织样本压片，渗出液、血液等液体样本直接涂片，细菌培养物直接涂片。5.2.3.2革兰氏染色
涂片自然干燥后用3%盐酸酒精固定5min，水洗、干燥后作革兰氏染色镜检。滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。滴加95%乙醇脱色，约15s30s，直至染液被洗掉，不要过分脱色，水洗。滴加沙黄复染液，复染1min。水洗，风干，镜检。5.2.4结果判定
土拉杆菌为革兰氏阴性菌，革兰氏染色后菌体染成红色。若发现到革兰氏染色阴性，无芽胞、无鞭毛、大小0.2μm～0.7um，以椭圆形为主的多形态球杆菌，可作出疑似土拉杆菌阳性诊断，否者判为显微镜检查阴性。
5.3毛细管沉淀试验
5.3.1试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。生理盐水（配制方法见附录C)，乙醚。土拉杆菌标准菌株（由指定单位提供）。土拉杆菌阳性血清（由指定单位提供）。无菌石英砂，无菌研钵，毛细管，无菌玻璃试管。主要设备
微量可调移液器，离心机，37℃恒温箱。5.3.3试验方法
取脾、肝和骨髓等组织，按照1：3～1：5的量（质量比）加人生理盐水，并加人适量无菌石英砂，在研钵内充分研磨，然后将组织混悬液转移至无菌玻璃试管中，加人2倍量（体积比)的乙醚，充分振摇，室温静置4h～5h，再次振摇，室温静置过夜。吸取水相于2000r/min离心30min，取上清100μL，加入2
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到预加有100μL土拉杆菌阳性血清的毛细管中，37℃下静置3h后，4℃过夜，观察是否出现沉淀环。同时用土拉杆菌标准菌株和生理盐水分别做阳性对照和阴性对照。5.3.4结果判定
结果判定如下：
a）土拉杆菌标准菌株的阳性对照出现沉淀环，生理盐水的阴性对照不出现沉淀环，结果成立。被检样本不出现沉淀环的，判为病理样品毛细管沉淀试验阴性。b）
被检样本出现沉淀环的，判为病理样品毛细管沉淀试验阳性。可用细菌分离鉴定、PCR或荧c）
光PCR方法对结果进一步确认。
5.4细菌培养
5.4.1试剂
弗朗西斯培养基、麦康凯和查平氏（McCoyandChapin）培养基、改良Thayer-Marin琼脂、GBCA培养基，配制方法见附录C。
5.4.2主要设备
显微镜、普通培养箱或二氧化碳培养箱等。5.4.3样品培养
无菌采取样本，接种于弗朗西斯培养基、McCoyandChapin培养基、改良Thayer-Marin琼脂或GBCA培养基，置于普通培养箱或二氧化碳培养箱（5%二氧化碳）37℃培养。污染样本还可采用选择性培养基，即在胱氨酸心肌琼脂（DIFCO)中加入5%脱纤兔血、青霉素至终浓度100U/mL、硫酸多粘菌素B至终浓度100U/mL、环已酰亚胺（每升培养基中加人1%的贮藏溶液0.1mL）。注：胱氨酸心肌琼脂(DIFCO)为商品化培养基，也可采用其他等效产品。5.4.4培养物形态观察
土拉杆菌在弗朗西斯培养基和改良Thayer-Martin琼脂上生长良好，形成粘稠、乳白色、融合的菌落，在McCoyandChapin培养基上形成细小，凸起、圆形的透明菌落。土拉杆菌在普通培养基上不生长，只有极个别的菌株在初次分离时能在血琼脂上生长，只有在加入胱氨酸、半胱氨酸血液或卵黄的培养基中生长。样本培养48h后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和生化试验。该菌不运动，无芽孢，两极着色，培养24h后菌体形态均勾一致，老龄培养菌则具多形性。5.4.5结果判定
对具有土拉杆菌形态的菌落进行革兰氏染色，革兰氏染色阴性且细菌形态与土拉杆菌相似的，判定为土拉杆菌细菌培养疑似阳性。分离细菌进一步用PCR或荧光PCR，凝集试验或动物接种试验鉴定为阳性的，判定为土拉杆菌细菌分离培养阳性。否者，判定为土拉杆菌细菌分离培养阴性。分离培养物培养3周后如无可疑菌落生长，判定为土拉杆菌细菌分离培养阴性。5.5聚合酶链反应（PCR）
5.5.1试剂
5.5.1.1：除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。5.5.1.2实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格），Tag酶，PCR缓冲液（与Tag酶匹配），氯化3
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镁（MgCl2，25mmol/L），dNTPs（dATP，dCTP，dGTP，dTTP，各2.5mmol/L），酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比25：24：1），三氯甲烷，异丙醇（-20℃预冷），琼脂糖，DNA相对分子量标准物MarkerDL2000。
5.5.1.3生理盐水、DNA提取液、75%乙醇、TE溶液（pH8.0）、电泳缓冲液（1×TBE或1XTAE)、溴化乙锭溶液（10mg/mL）、上样缓冲液，配制方法见附录C。5.5.1.4土拉杆菌标准菌株或其DNA（由指定单位提供）。5.5.1.5引物。
上游引物：5*-TACCAGTTGGAAACGACTGT-3”下游引物：5*-CCTTTTTGAGTTTCGGTCC-3”5.5.2设备和材料
PCR扩增仪，生物安全柜，凝胶成像系统，消毒灭菌锅，制冰机，核酸蛋白分析仪，高速冷冻离心机（转速≥8000r/min），台式小型离心机（转速≥13000r/min），低温冰箱，超纯水器（或双蒸水器），旋涡振荡器，微量可调移液器，PCR反应管。5.5.3样品前处理
组织等固体状样本加人少量生理盐水后，充分匀浆，制成10%～20%（质量浓度）的悬浮液备用；液体样本充分混匀后直接取用；样本的细菌分离培养液充分混勾后，取1mL加到1.5mL离心管中，10000r/min离心3min，弃去上清，加人200μL生理盐水，充分悬浮后备用。5.5.4模板DNA制备
5.5.4.1样本模板DNA的制备
取以上制备的样本悬浮液200μL，加人750μLDNA提取液，65℃温浴30min，加酚/三氯甲烷/异戊醇500pL，振荡混匀，13000r/min离心5min，吸取上清液加人等体积的三氯甲烷，振荡混匀，13000r/min离心5min，吸取500μL上清液与400μL的异丙醇充分混合，13000r/min离心5min，75%乙醇冲洗沉淀一次，13000r/min离心5min，弃去上清，沉淀干燥后溶于30μLTE溶液中，立即用于检测或短期保存于-20℃。
也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化细菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作。
5.5.4.2细菌模板DNA的制备
用一次性器具从分离平板上挑取5个菌落，转人盛有30μL灭菌超纯水的离心管中，煮沸5min，转人冰水浴中5min，13000r/min离心3min，吸取上清液备用。5.5.4.3·对照设立
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照与空白对照。阳性对照为土拉杆菌标准菌株DNA，阴性对照为没有交叉反应的非阳性菌株，空白对照为无菌水。由于操作土拉杆菌培养物的生物安全级别较高，不易获得其土拉杆菌标准菌株及其DNA，阳性对照可采用扩增基因的阳性克隆分子DNA或含目标核酸序列的人工合成的DNA。样本出现阳性结果时，需对样本的扩增产物进行测序分析。5.5.5反应体系
10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs（10mmol/L)2μL氯化镁（25mmol/L)2μL引物（20μmol/L）SN/T1501—2015
各0.5μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL)0.25μL、模板DNA5μL~10μL(约50ng～100ng），用灭菌的超纯水补足反应体积至25μL。也可使用等效商品化PCR反应预混液。5.5.6反应条件
95℃预变性7min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，进行40个循环；72℃延伸10min；4℃保存反应产物。反应体系与条件可以根据仪器型号或反应预混液类型进行等效评估，并作适当的参数调整。
5.5.7PCR产物电泳
称取1.5g琼脂糖，加入100mL电泳缓冲液加热溶解，加人漠化乙锭溶液至终浓度为1μg/mL，制胶，PCR扩增产物与适量加样缓冲液混合，点样，同时加Marker、阴性对照和阳性对照，5V/cm电压电泳30min~40min，凝胶成像系统观察并记录结果。5.5.8结果判定
结果判定如下：
阳性对照出现1124bp目的条带，阴性对照和空白对照均未出现目的条带，试验成立：a）
被检样本出现1124bp目的条带，判为PCR阳性；b）
被检样本未出现1124bp目的条带，判为PCR阴性；c）
为进一步确证该样品中含有土拉杆菌病原，须对PCR产物进行测序，PCR产物参考序列参见d)
附录D。
5.6荧光聚合酶链反应（荧光PCR)5.6.1试剂
5.6.1.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。5.6.1.2实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格），Tag酶，PCR缓冲液（与Tag酶匹配），氯化镁（MgClz，25mmol/L），dNTPs（dATP，dCTP，dGTP，dTTP，各2.5mmol/L），酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比25：24：1），三氯甲烷，异丙醇（一20℃预冷）。5.6.1.3生理盐水、DNA提取液、75%乙醇、TE溶液（pH8.0），配制方法见附录C。5.6.1.4土拉杆菌标准菌株或其DNA（由指定单位提供）。5.6.1.5引物和探针。
上游引物：5\-TTGGTAGATCAGTTGGTGGGATAAC-3\下游引物：5'-TGAGTTTTACCTTCTGACAACAATATTTC-3”TaqMan探针:5'-FAM-AAAATCCATGCTATGACTGATGCTTTAGGTAATCCA-TAMRA-35.6.2设备和材料
荧光PCR扩增仪，生物安全柜，凝胶成像系统，消毒灭菌锅，制冰机，核酸蛋白分析仪，高速冷冻离心机（转速≥8000r/min），台式小型离心机（转速≥13000r/min），低温冰箱，超纯水器（或双蒸水器），旋涡振荡器，微量可调移液器，无DNase/RNase的光学PCR反应管（板）或PCR玻璃毛细管。5.6.3样品前处理
样品前处理同5.5.3。
SN/T1501—2015
模板DNA制备
样本模板DNA的制备、细菌模板DNA的制备、对照设立同5.5.4。5.6.5反应体系
10×PCR缓冲液2.5μL、dNTPs（各2.5mmol/L）3μL、MgClz（25mmol/L)5.5μL引物(20μmol/L)各0.5μL、TaqMan探针（10μmol/L)0.6μL、TagDNA聚合酶(5U/μL)0.25μL、DNA5μL～10μL（约50ng～100μg），用灭菌的超纯水补足反应体积至25μL。如果使用PCR玻璃毛细管进行荧光PCR反应，则需要在反应体系中加人牛血清白蛋白(BSA，5μg/μL)1μL。也可使用等效商品化荧光PCR反应预混液。
5.6.6反应条件
95℃预变性10min：95℃变性10s，60℃退火延伸1min，同时收集荧光信号，进行45个循环。反应体系与条件可以根据仪器型号或反应预混液类型进行等效评估，进行适当的参数调整。5.6.7结果判定
读取检测结果时，阈值设定以刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，不同仪器可根据设备噪音情况进行调整
a）阳性对照出现典型的扩增曲线，且Ct值≤30；阴性对照和空白对照无扩增曲线，Ct值≥40或未检出；试验成立：
被检样本Ct值≥40或无扩增曲线，判为荧光PCR阴性；b）
被检样本Ct值<35，判为荧光PCR阳性；被检样本Ct值>35，且<40，则样品应重复检测：重测结果Ct值≥40或无扩增曲线的判为阴d)
性，Ct值<40的判为荧光PCR阳性；为进一步确证该样品中含有土拉杆菌病原，须对PCR产物进行测序，PCR产物参考序列参见e)
附录D。
5.7试管凝集试验
试剂和材料
生理盐水、96%乙醇、结晶紫染色液，配制方法见附录C。甲醛：分析纯。
土拉杆菌标准菌株或标准土拉杆菌试管凝集抗原（由指定单位提供）。5.7.1.3
土拉杆菌阳性血清和阴性血清(由指定单位提供）。5.7.1.5玻璃管：规格为13mm×100mm，圆底，洁净。5.7.1.6
载玻片：洁净。
5.7.2主要设备
微量移液器、37℃恒温箱、4℃冰箱、振摇器。5.7.3抗原制备
将土拉杆菌在弗朗西斯培养基上培养5d～6d后（幼龄培养物的抗原性差），收获的细菌悬浮于96%酒精中，细菌悬液于室温下保存1d～7d；细菌沉淀物用生理盐水洗涤3次后，用等体积的生理盐6
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水悬浮，加入结晶紫染色液至结晶紫终浓度为0.25%，37℃染色24h以上，最长不超过7d。抗原沉淀物用生理盐水悬浮，制成初始的抗原悬液。用生理盐水将初始的抗原悬液做2倍倍比稀释，每个梯度的稀释液分别与土拉杆菌阳性血清和阴性血清在载玻片做凝集试验，快速出现肉眼清晰可见的凝集反应的抗原稀释度为最佳抗原浓度。将初始的抗原悬液用生理盐水稀释至最佳抗原浓度，加甲醛至终浓度为0.5%，制成试管凝集抗原，于4℃冰箱备用。如有标准土拉杆菌试管凝集抗原，则不需要制备抗原，可直接进行试管凝集试验。5.7.4试验程序
每份被检血清用4支试管，标记检验编号后，在第2～4管各加入生理盐水0.1mL，然后在第1～2管各加入被检血清0.1mL；将第2管中的液体充分均匀后，从第2管吸取0.1mL加人到第3管；混合均勾后，从第3管吸取0.1mL加人到第4管；混合均勾后，从第4管弃去0.1mL；分别在第1～4管各加人抗原0.9mL，第1～4管的最终血清的稀释度依次为1：10.1：20.1：40、1：80。振摇20min或37℃水浴1h后，于室温下过夜，用肉眼或放大镜观察。以下为试管凝集试验，见表1。表1土拉杆菌试管凝集试验
抗原滴度
生理盐水/μL
被检血清/μL
抗源/uL
判定举例
5.7.5对照设立
振摇20min或37c水浴1h后，于室温下过夜。+ +
奔去100
阴性血清的稀释方法与被检血清相同，阳性血清的最高稀释度应超过其效价滴度，抗原的加人方法与被检血清相同。
5.7.6判定
5.7.6.1判定方法
：菌体抗原不被凝集，液体混浊，无透明度，管底无伞状沉淀，但由于菌体自然下沉，出现圆点状沉淀，振荡时复呈均匀混浊状态。十：有凝集，液体透明不明显（25%清亮），管底有少许不明显的伞状沉淀，十十：凝集显著，液体透明中等（50%清亮），管底有中等量的伞状沉淀。十十十：儿乎完全凝集，液体几乎透明（75%清亮），管底有明显的伞状沉淀，振荡时呈小或大的絮片状。
十十十十：完全凝集，液体完全透明（100%清亮），管底出现大片的伞状沉淀，振荡时呈大絮片状，但可打成小絮片状。
出现十十以上凝集现象的最高血清稀释度为血清凝集价。SN/T1501—2015
2结果判定
结果判定如下：
阴性对照和抗原对照不出现凝集，阳性血清均出现凝集或其凝集价达到其标准效价士1个滴a)
度，试验成立；否者，应重做试验；b）
样本不出现凝集的判为试管凝集试验阴性：样本出现凝集的，按照SN/T1088中的布氏杆菌试管凝集试验排除布氏杆菌交叉反应后，判为试管凝集试验阳性。
5.8动物试验
5.8.1主要试剂与材料
生理盐水.配制方法见附录C
5.8.1.2试验用小鼠：清洁级青年小鼠或以上级别。5.8.1.3医用剪刀、镊子、手术刀等解剖器具。5.8.1.4手套、生物安全防护服等。5.8.1.5注射器：洁净、无菌。bzxZ.net
5.8.2主要设备
高速冷冻离心机（转速≥10000r/min），振摇器，生物安全柜，生物安全笼具。5.8.3动物接种
严重污染的病料样本加入少量生理盐水斤，充分匀浆，制成10%～20%（质量浓度）的悬浮液，灭菌纱布过滤后，以0.2mL/只剂量腹腔或皮下注射接种小鼠，每个样本至少接种3只，连续观察14d，如实验小鼠出现死亡或临床症状，按照5.1的方法采取病料后，按照5.2、5.4的方法进行涂片染色镜检和细菌分离鉴定。
5.8.4细菌接种
分离细菌培养18h～24h后，于10000r/min离心5min，弃去上清，加入等体积生理盐水，充分悬浮后，腹腔或皮下注射接种小鼠，0.2mL/只，每个样本至少接种3只，连续观察14d。5.8.5结果判定
小鼠不出现死亡的，判为土拉杆菌动物试验阴性。小鼠出现死亡的，特别是在2d～10d内死亡的，同时做解剖检查、涂片染色镜检和病理学检查。解剖检查可见接种部位水肿，有时伴有出血现象，局部淋巴结肿大且出现脉周炎，脾肿大并有散在小结节，肝脏肿大，但无坏死灶；用肝、脾和心血涂片染色镜检，可见大量成堆排列、形态典型的疑似土拉杆菌；病理学检查可见局部淋巴结发炎、淋巴结囊性水肿，淋巴细胞浸润，周边微小脓肿，血管充血，形成血栓，坏死区融合形成多处脓肿灶，脓肿内可能有巨浆细胞、巨噬细胞。如果解剖检查、涂片染色镜检和病理学检查发现以上特征性指标，判定为土拉杆菌动物试验阳性，否者判为土拉杆菌动物试验阴性。6综合判定
6.1临床诊断符合第4章的规定发病症状和病理变化，按5.4进行细菌分离鉴定为阳性的，可判定为土8
拉杆菌感染。
SN/T1501—2015
6.2临床诊断符合第4章的规定发病症状和病理变化，按5.5进行PCR或按5.6进行荧光PCR检测结果阳性且经过序列分析证明为土拉杆菌特征性序列的，可判定为土拉杆菌感染。6.3患畜没有明显发病症状和病理变化，但病原学检测符合5.4或5.5或5.6的、或血清学检测符合5.7的，可判定为土拉杆菌感染。
SN/T1501—2015
附录A
（资料性附录）
野兔热简介
A.1野免热（Tularemia），又称土拉杆菌病，是一种由土拉弗朗西斯氏菌（Francisellatularensis，常称为土拉杆菌）引起的人畜共患病，主要感染兔（家免和野免兔）和啮齿类动物（特别是田鼠、松鼠、香鼠等小型啮齿动物）以及河狸。多种哺乳动物、鸟类、两栖动物和无脊椎动物有感染的报道。家养动物中，猫可能带菌。家禽自然发病的报道以火鸡较多，鸡、鸭、鹅很少，但可成为传染源。人也可受到感染。A.2土拉杆菌为革兰氏阴性菌，无芽胞、无鞭毛，不能运动，大小0.2m～0.7μm，以椭圆形为主的多形态球杆菌。细菌涂片呈现为非常细小的点状革兰氏阴性杆菌，由于太小常难以确定为病原菌，也可采用May-Grunwald-Giemsa或酚硫堇染色法染色观察，美蓝染色时呈两极着色。该菌最适生长温度为37℃，严格需氧，生长时需要胱氨酸，分解葡萄糖、果糖、甘露糖迟缓产酸不产气，可由半胱氨酸或胱氨酸产生H.S。在石蕊牛乳中培养2周生长微弱并呈弱酸性反应，触酶弱阳性，氧化酶阴性，不水解明胶，不产生哚。甲基红和VP试验阴性，不还原硝酸盐，可还原美蓝，A.3根据土拉杆菌的培养特性、流行病学特征、毒力和是否发酵甘油，临床上可以将其分为A和B两个型。A型，即土拉热弗朗西斯杆菌土拉热型，与北美地区的兔类发病有关，主要通过蜱，蝇的叮咬或直接接触感染动物而传播，该菌对人和家免具有极强的致病性，能发酵甘油。B型，即土拉热弗朗西斯杆菌古北型，主要发于水生啮齿动物（海狸、麝鼠），北美北部的野鼠以及欧亚大陆北部的兔类（野免）和啮齿类动物，主要通过直接接触和蚊虫叮咬传播，也能通过食人污染水、食物而传播，该菌对人和家兔的致病性较小，不能发酵甘油。除媒介传播外，土拉杆菌也可经接触感染的动物及污染的物品或食人未煮熟的病畜肉以及污染的水而引起传播。A.4土拉杆菌致人感染的剂量很低，加之感染动物后从粪尿中排菌，且该菌在气溶胶状态存活率极高，人接触本菌后发生感染的风险很高，极易发生细菌扩散和实验室感染。因此，当处理感染性病料、操作活菌和动物试验时，应注意采取特别生物安全防护措施，包括配戴手套、眼罩、口罩等，设施应满足有关生物安全要求。卫生部规定土拉杆菌的大量活菌操作和动物感染试验需在生物安全3级实验室进行，常规样本检测需在生物安全2级实验室进行，非感染材料的实验可在生物安全1级实验室进行，A.5野免热的诊断方法包括病原鉴定和血清学试验。病原鉴定有显微镜检查、免疫荧光（FAT）、细菌分离、动物试验、聚合酶链反应（PCR）和荧光聚合酶链反应（荧光PCR）等方法；血清学方法主要是凝集试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）等，必要时，血清学阳性结果需排除与流产布氏杆菌（Brucellaabor-tus），马耳他布氏杆菌（Brucellamelitensis）以及军团菌（Legionellasp.）的交叉反应。易感动物感染土拉杆菌后常在产生抗体前已经死亡，血清学方法对其的诊断价值有限。对土拉杆菌有较强抵抗力的动物（如绵羊、牛，猪，狗，驼鹿或鸟类）感染后能产生特异性抗体，可用血清学方法进行检测，特别是对野生动物的血清学监测。野免热的实验室诊断主要还是依靠病原鉴定，病理材料直接涂片染色镜检时，病料中菌数很多，可能因其太小而难以与沉淀的染料区分开，免疫荧光（FAT)方法可以对目标菌进行特异性鉴别，但其诊断试剂不易获得。A.6细菌分离时常常会出现杂菌大量繁殖的现象，从死亡的动物和尸体内分离到土拉杆菌有一定难度，可以通过将感染性组织或培养物接种小鼠或豚鼠进行动物试验，但动物接种危险性极大，需要在具有符合要求的生物安全装置及生物安全笼具的条件下进行。因此，PCR和荧光PCR方法对野免热诊断是一种较好的选择，其可用于病料的直接检测或分高到的可疑菌株的鉴定，当出现阳性结果后，可向OIE参考实验室等机构购买特异性试剂做进一步诊断或将样本送国家指定实验室进一步复核。10
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