SN/T 1682-2010
基本信息
标准号： SN/T 1682-2010
中文名称：蜜蜂欧洲幼虫腐臭病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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下载大小：2512917
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1682-2010.Quarantine protocol for European foulbrood of honey bees.
1范围
SN/T 1682规定了蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断方法。
SN/T 1682适用于蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T 6682分析实验窒用水规格和试验方法
GB/T 18088 出人境动物检疫采样
3诊断原理
蜜蜂欧洲幼虫腐臭病( European foanilrondsf lhomnsr lus)见山蜂员隆蜂球菌(Melissococcus pluto-nius)引起蜜蜂幼虫死亡的一种细菌性传染病,在蜂群迅速牛长时多发,最常见的明显症状是蜜蜂幼虫在巢房封盖前不久死亡。大多数患病幼央元前在巢房低部发生卷曲变形,许多患病幼虫很快被护理工蜂发现,清除，留下空巢房。未被工蜂桥除的感染幼山不久死亡变软.小浅黄色逐渐变成褐色,溶化成半液体状团块,然后干枯,形成深色鳞f.很容易从集方中取出。心前感染的幼虫有一种酸臭味。引起蜜蜂幼虫的死亡也有其他疾病和原因因此野外依抵观察临必症状入能做可靠诊断。
当依据临床症状疑似为欧洲幼出腐st病时，可取忠绩或死亡切虫进行涂片染色镜检,做出初步诊断。在普通光学显微镜下,蜂房蜜单球菌足单个义成串更头尾相接成对求成短链状排列的短披针状球菌,大小为0.5 pmX1.0 μm。确块的诊断品要进行细问分离挤养和染仪镜检鉴定,或用半巢式聚合酶链式反应法(polymerase chain reacton.PCR)对分离比养物进行鉴定他可直接采用半巢式PCR检测患病或死亡幼虫来进行确诊。
1范围
SN/T 1682规定了蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断方法。
SN/T 1682适用于蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T 6682分析实验窒用水规格和试验方法
GB/T 18088 出人境动物检疫采样
3诊断原理
蜜蜂欧洲幼虫腐臭病( European foanilrondsf lhomnsr lus)见山蜂员隆蜂球菌(Melissococcus pluto-nius)引起蜜蜂幼虫死亡的一种细菌性传染病,在蜂群迅速牛长时多发,最常见的明显症状是蜜蜂幼虫在巢房封盖前不久死亡。大多数患病幼央元前在巢房低部发生卷曲变形,许多患病幼虫很快被护理工蜂发现,清除，留下空巢房。未被工蜂桥除的感染幼山不久死亡变软.小浅黄色逐渐变成褐色,溶化成半液体状团块,然后干枯,形成深色鳞f.很容易从集方中取出。心前感染的幼虫有一种酸臭味。引起蜜蜂幼虫的死亡也有其他疾病和原因因此野外依抵观察临必症状入能做可靠诊断。
当依据临床症状疑似为欧洲幼出腐st病时，可取忠绩或死亡切虫进行涂片染色镜检,做出初步诊断。在普通光学显微镜下,蜂房蜜单球菌足单个义成串更头尾相接成对求成短链状排列的短披针状球菌,大小为0.5 pmX1.0 μm。确块的诊断品要进行细问分离挤养和染仪镜检鉴定,或用半巢式聚合酶链式反应法(polymerase chain reacton.PCR)对分离比养物进行鉴定他可直接采用半巢式PCR检测患病或死亡幼虫来进行确诊。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1682—2010
代替SN/T1682--2005
蜜蜂欧洲幼虫腐臭病检疫技术规范Quarantine protocol for European foulbrood of honey bees2010-11-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-05-01实施
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
蜜蜂欧洲幼虫腐臭病检疫技术规范SN/T1682—2010
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)64275323
网址spc.net.cn
中国标准出版社黎皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16印张0.75
字数17千字
2012年10月第一版2012年10月第一次印刷印数1-1600
书号：155066·2-24069
定价16.00元
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1682-—-2005《蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断方法》。SN/T1682—2010
本标准修改采用了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2010版）中2.2.3.B中的诊断技术部分内容，涵盖了镜检、培养方法及聚合酶链反应法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：王振国、陈世松、刘金华、朱战的、蔡阳、苏琳、孟庆峰、朱开元、王建、魏春艳王伟利。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1682—2005。
1范围
蜜蜂欧洲幼虫腐臭病检疫技术规范本标准规定了密蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断方法。：本标准适用于蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断。2规范性引用文件
SN/T1682—2010
下列文件对于本文件的应用是必可少能期的引用文值·仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有而修改单）适财于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验GB/T18088出人境动物检疫采样
3诊断原理
蜜蜂欧洲幼虫腐臭病（EuropeanLuildfols）尼i：蛇蜜蜂球菌（Melissococcuspluto-nius)引起蜜蜂幼虫死亡的一种细菌性传染病，在蜂群迅速长时多发，最常见的明显症状是蜜蜂幼虫在巢房封盖前不久死亡。大多数患病幼出死前在巢房衣部发生卷出变形，许多患病幼虫很快被护理工蜂发现，清除，留下空巢房。未被工蜂再除的感染幼不久死亡变软.浅黄色逐渐变成褐色，溶化成半.很容以从巢房中取出，严重感染的幼虫有一种酸臭味。引起蜜液体状团块，然后干枯，形成深色鳞工可靠诊断。
因此野外依摄观察临压症状不能做蜂幼虫的死亡也有其他疾病和原因当依据临床症状疑似为欧洲幼虫腐桌病时，南取患精或死亡行涂片染色镜检，做出初步诊
力虫进
或成短链状排列的短披针状球
断。在普通光学显微镜下，蜂房蜜蜂球菌星单个成成申或头尾相接成对菌，大小为0.5um×1.0um。确域的诊斯需硬进行细荷分离指养和染件镜检鉴定，或用半巢式聚合酶他可直接采用半巢式PCR检测
链式反应法（polymerascchainreactom.PcR）对分离培养物进行鉴定患病或死亡幼虫来进行确诊。
本标推中采用的半巢式PCR法，是根据峰榜蜜蜂球菌LTRNA基因设计一对引物（MPI和MP2），进行第一次PCR扩增，扩增片段为486bp（参见附录A）。以该扩增基因为模板设计第三条引物（MP3），以MP1和MP3为引物进行第二次PCR扩增，扩增片段为276bp。4设备、材料与试剂
4.1设备
电泳仪、凝胶成像分析系统、高速台式冷冻离心机<最高转速12000r/min以上）、PCR扩增仪、普通光学显微镜、CO2培养箱等。
4.2材料与试剂
试剂配制方法参见附录B.所用水为按照GB/T6682规定的一级水。所用试剂主要为DNA抽提缓冲液、CTAB沉淀液、1.2mol/L氯化钠溶液、三氮甲烷、异丙醇、70%乙醇、TaqDNA聚合酶、10X1
SN/T1682—2010
PCR冲液.dNTPs(含2.5mmol/LdATP.2.5mmol/LdCTP.2.5mmol/LdGTP.2.5mmol/LdTTP），10×氟化镁（25mmo1/）、10μg/ml.RNaseA、10mg/mL溴化乙锭存液、相对分子质量标准品（100bp~1000hp）、琼脂糖（电泳纯），50×TAE电泳缓冲液、蜂房蜜蜂球菌标准菌株(Melissococcus力luton），引物MP15-CTTTGAACGCCTTAGAGA-3、引物MP25'-ATCATCT-GTCCCACCTTA-3，引物MP35\-TTAACCTCGCGGTCTTGCGTCTCTC-3、分离琼脂培养基平板、分离琼脂培养基斜面等。
5样品采集
按GB/T18088规定的方法采样，或直接采集疑似感染的蜜蜂幼虫或蜂巢的病变区域。6实验室诊断
6.1直接镜检法
6.1.1涂片
刚死去的幼虫最适合于诊断。将刚死去的完整幼虫，置载玻片上直接抹成涂片，或用两把锻子夹住虫体中心部位的表皮并拉开，把中肠内容物暴露在载玻片上。挑取少量中肠内容物，加少量灭菌生理盐水制成悬液。取一接种环中肠内容物悬液，置干净载玻片上涂勾，自然风干或置火焰上慢慢干燥。6.1.2染色
进行革兰氏或石炭酸复红等染色。6.1.3镜检
在普通光学显微镜下进行检查，如发现0.5μm×1.0μm大小的单个或成串或头尾相接成对或成短链状排列的短披针状球菌，可以初步诊断为欧洲幼虫腐臭病，确切诊断要进行细菌分离培养或进行半巢式PCR法鉴定。镜检时视野内也可见到末端呈方形的细长杆状菌（参见附录C）。如果用整只幼虫或腐烂分解幼虫制成的悬液进行检查时，可见到杂乱无章排列的细菌，这样就很难区别蜂房蜜蜂球菌。6.2分离培养法
6.2.1分离培养
经镜检或根据临床症状疑为欧洲幼虫腐臭病时，按无菌操作取发病幼虫少许，最好是发病幼虫中肠内容物.加少量无菌生理盐水制成稀释悬液。用接种环取此悬液划线接种于分离琼脂培养基平板（参见附录B）。可疑样品应与标准参考菌株同步培养，以进行质量控制，确保试验结果准确。接种后的培养基置于含5%～10%CO2的庆氧培养箱中，（35土1)℃进行厌氧培养（此厌氧条件是必须的），通常4d内形成可见的白色不透明小菌落。挑取单个可疑菌落，接种分离琼脂培养基斜面，置于含5%～10%CO2的厌氧培养箱中，（35士1)℃厌氧培养，当有细菌明显生长时，将培养管密封，置4℃冰箱可保存6个月。同时挑取菌落进行染色镜检及进行下述的鉴别检测。6.2.2鉴定
其他许多细菌常与蜂房密蜂球菌并存，而造成混淆。腐败细菌在感染蜂房密蜜蜂球菌的幼虫体内大2
SN/T1682—2010
量存在，为单个或链状细长平端杆菌。在特定的培养基中生长时，近似于链球菌，可与蜂房蜜蜂球菌混淆，但在蜂房蜜蜂球的必须培养条件下，生长较差，呈细杆状形态。粪链球菌在形态上与蜂房密蜂球菌极为相似，易混淆。体外培养时，粪链球菌在适宜于蜂房蜜蜂球菌生长条件下生长良好，通过有氧条件下的生长能力可以鉴别，粪链球菌在有氧条件下24h内可形成透明小菌落。在蜜蜂幼虫体内，粪链球菌的数量很少有超过蜂房蜜蜂球菌的，而且在没有蜂房蜜蜂球菌的密蜂幼虫体内，粪链球菌不能繁殖，因此可推断，当有大量粪链球菌在幼虫体内存在时，表明存在欧洲幼虫腐臭病。
在欧洲幼虫腐臭病感染的蜂群中，蜂房芽孢杆菌比粪链球菌更加普適，其芽孢带常超过其他所有细菌，能产生一种特征性的恶臭。在体外蜂房密蜂球菌生长的必要条件下，蜂房芽孢杆菌生长不良，产生一种扩散性生长菌落透明物，以弧形运动覆盖琼脂表面，通过镜检可与蜂房芽孢杆菌区别。对于上述分离培养物，也可直接采用下述半巢式PCR法进行鉴定。6.2.3结果判定
当发现大小为0.5μm×1.0μm，单个或成串或头尾相接成对或成短链状排列的短披针状球菌，并能与蜂房芽孢杆菌、粪链球菌和腐败细菌相区别时，可诊断为蜜蜂欧洲幼虫腐臭病。6.3半巢式PCR法
6.3.1样品核酸提取及纯化
取发病幼虫虫体或虫体中肠内容物悬液少许，或挑取可疑蜂房蜜蜂球菌菌落.加人J.5mLDNA抽提缓冲液并涡旋震荡30s，65℃水浴30min。室温12000r/min离心10min，取上清液800μL，加人5μlLRNaseA（10μg/mL），37℃保温30min。加人等体积的三氧甲烷/异戊醇（24/1，体积比），颠倒混勾1min，室温12000r/min离心10min，取上清液600μl，加人2倍体积的CTAB沉淀液，混勾，室温放置30min。室温12000r/min离心10min，弃上清液。加入800l氯化钠溶液（1.2mol/L）溶解沉淀，待沉淀溶解后室温放置5min，加入等体积三氛甲烷/异戊醇（24/1，体积比），颠倒混勾。室温12000r/min离心10min，取上清液600μL，移入1.5ml的离心管中，加人0.6倍体积的异丙醇，混勾，室温放置30min。4℃，12000r/min离心10min，弃上清液。用70%冷乙醇200μL洗涤沉淀两次，自然干燥后加入50叫l.TE缓冲液（pH8.0）或去离子水溶解核酸沉淀，一20℃保存。也可选用相应的商品化试剂盒提取和纯化样品核酸，按使用说明书进行操作。6.3.2标准菌株对照样品核酸提取及纯化把蜂房密蜂球菌标准菌株接种分离琼脂培养基斜面，置于5%～10%CO2条件下，（35土1）℃庆氧培养，有明显细菌生长时，取菌落进行核酸提取。取蜂房蜜蜂球菌菌落，加人1.5mLDNA抽提缓冲液，按6.3.1方法提取纯化核酸，作为阳性对照模板。
6.3.3PCR检测
6.3.3.1PCR反应体系的建立
用蜂房密蜂球菌核酸作为阳性对照模板、蜜蜂健康虫体核酸作为阴性对照模板，等体积双蒸水代替模板核酸作为空白对照，检测蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因。按照表1所示，加人样品核酸、蜂房蜜蜂球菌核酸、阴性对照样品核酸及其他成分，配制第一轮扩增体系。按照表1所示，加人第一轮扩增产物、蜂房蜜蜂球菌核酸、阴性对照样品核酸及其他成分，配制第二轮扩增体系。3免费标准bzxz.net
SN/T1682—2010
表1蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因的巢式PCR反应体系分
10XPCR缓冲液
dNTP（各2.5mmol/L)
10×氯化镁（25mmol/L）
TaDNA聚合酶(5U/μL)
MP1(20 pmol/μl.)
MP2(20 pmol/μL)
MP3(20pmol/μL)
样品DNA
第一轮PCR扩增产物
双蒸水
PCR反应条件及扩增
第一轮扩增
第二轮扩增
PCR反应循环参数见表2.按照表中规定设置循环参数，进行第一轮和第二轮扩增。美2
扩增轮数
第一轮
第二轮
扩增片段长度
6.3.4PCR扩增产物电泳检测
PC反应参数
反应条件
随少性
72℃.60s
循环数
最终延伸
配制2%琼脂糖凝胶，加人溴化乙锭溶液至终浓度为0.5g/mL。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL～8μL第一轮和第二轮PCR扩增产物分别与适量加样缓冲液混匀，点样。3V/cm～5V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。6.3.5结果判定
对扩增产物进行电泳分析，观察是否出现预期大小的扩增产物条带（第一轮PCR扩增产物长度为486bp），并观察阳性对照、阴性对照及空白对照是否成立。以第一轮扩增产物为模板进行第二轮扩增，第二轮扩增目的产物长度为276bp。SN/T1682—2010
对第二轮扩增产物进行电泳分析，如果阳性对照、阴性对照和空白对照成立，测试样品出现预期大小的目的扩增产物条带，则可诊断为蜜蜂欧洲幼虫腐臭病：如果所有具有代表性的样品均未出现预期大小的扩增产物条带，则可诊断为非蜜蜂欧洲幼虫腐臭病。如需进一步确证，可进行测序分析，相关序列信息参见附录A。
SN/T1682—2010
（资料性附录）
第一轮PCR扩增产物序列
CTTTGAACGCCTTAGAGATAAGGTTTCTCCTTCGGGAGCAAAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAATTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAGAGAGACGCAAGACCGCGAGGTTAAGCAAATCTCATAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATNNGCACGCCGCGGTGAATACGTTCNNGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTAGGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGAT
B.11mol/L.Tris-HCI级冲液(pH8.0)附录B
（资料性附录）
试剂的配制
SN/T1682—2010
称取121.1g三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），溶于800mL水中，搅拌，加入浓盐酸42mL，冷却至室温，用稀盐酸准确调节PH至8.0.加水定容室1I.分装后高压灭菌备用。B.20.5mol/LEDTA(pH8.0):
称取186.1g乙二胺四乙酸二钠（Naz-EDTA·2H，O），加800mL水，用磁力搅拌器剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液pH值至8.0（约需20g氢氧化钠颗粒），然后加水定容至1L，分装后高压灭菌备用。
B.3DNA抽提缓冲液：
1 mol/L Tris-HCI
0.5mol/LEDTA
十六烷基三甲基澳化铵（CTAB）氯化钠
聚乙烯吡略酮-40(PVP-40)
加水定容至1L,分装后高压灭菌备用。B.4CTAB沉淀液：
氯化钠
加水溶解定容至1L.分装后高压灭菌备用。B.51.2mol/L氮化钠溶液：
氯化钠
加水溶解定容至1L，分装后高压灭菌备用。B.6TE缓冲液（Tris-HC)、EDTA缓冲液）：1mol/LTris-HCI缓冲液(pH8.0)
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
加水定容至1L，分装后高压灭菌备用。B.750XTAE电泳缓冲液：
冰醋酸
0.5mol/LEDTA
溶于水后，定容至2L分装后高压灭菌备用。B.8分离琼脂培养基：
酵母浸出物
半胱氨酸或胱氨酸
葡萄糖或果糖
可溶性淀粉
磷酸二氢钾
0.2g~2.0g
加水定容到1L.pH6.6.分装成100mL每瓶，116℃高压灭菌20min。倾注平板或斜面，备用。SN/T1682—2010
附录C
（资料性附录）
三种细菌的形态区别
蜂房蜜蜂球菌（Melissococcusptutonius）：以单个、长链或成丛存在，形态上常与继发感染的粪链球菌相似。见图C.1。
蜂房芽孢杆菌（Bacillusdlei）：其紧殖菌体为（2.0μm~7.0μm）×（0.8μm~1.2μm），有鞭毛，一端出芽，繁殖休和芽孢都比幼虫芽孢杆菌大。见图C.2。腐败细菌（Bacteriumeurydice）：在体内呈细长、末端方形的杆状菌，而在体外某种培养基上则为链状球菌。见图c.3。
书号：155066·2-24069
SN/T1682-2010
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代替SN/T1682--2005
蜜蜂欧洲幼虫腐臭病检疫技术规范Quarantine protocol for European foulbrood of honey bees2010-11-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-05-01实施
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
蜜蜂欧洲幼虫腐臭病检疫技术规范SN/T1682—2010
中国标准出版社出版
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中国标准出版社黎皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16印张0.75
字数17千字
2012年10月第一版2012年10月第一次印刷印数1-1600
书号：155066·2-24069
定价16.00元
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1682-—-2005《蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断方法》。SN/T1682—2010
本标准修改采用了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2010版）中2.2.3.B中的诊断技术部分内容，涵盖了镜检、培养方法及聚合酶链反应法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：王振国、陈世松、刘金华、朱战的、蔡阳、苏琳、孟庆峰、朱开元、王建、魏春艳王伟利。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1682—2005。
1范围
蜜蜂欧洲幼虫腐臭病检疫技术规范本标准规定了密蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断方法。：本标准适用于蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断。2规范性引用文件
SN/T1682—2010
下列文件对于本文件的应用是必可少能期的引用文值·仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有而修改单）适财于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验GB/T18088出人境动物检疫采样
3诊断原理
蜜蜂欧洲幼虫腐臭病（EuropeanLuildfols）尼i：蛇蜜蜂球菌（Melissococcuspluto-nius)引起蜜蜂幼虫死亡的一种细菌性传染病，在蜂群迅速长时多发，最常见的明显症状是蜜蜂幼虫在巢房封盖前不久死亡。大多数患病幼出死前在巢房衣部发生卷出变形，许多患病幼虫很快被护理工蜂发现，清除，留下空巢房。未被工蜂再除的感染幼不久死亡变软.浅黄色逐渐变成褐色，溶化成半.很容以从巢房中取出，严重感染的幼虫有一种酸臭味。引起蜜液体状团块，然后干枯，形成深色鳞工可靠诊断。
因此野外依摄观察临压症状不能做蜂幼虫的死亡也有其他疾病和原因当依据临床症状疑似为欧洲幼虫腐桌病时，南取患精或死亡行涂片染色镜检，做出初步诊
力虫进
或成短链状排列的短披针状球
断。在普通光学显微镜下，蜂房蜜蜂球菌星单个成成申或头尾相接成对菌，大小为0.5um×1.0um。确域的诊斯需硬进行细荷分离指养和染件镜检鉴定，或用半巢式聚合酶他可直接采用半巢式PCR检测
链式反应法（polymerascchainreactom.PcR）对分离培养物进行鉴定患病或死亡幼虫来进行确诊。
本标推中采用的半巢式PCR法，是根据峰榜蜜蜂球菌LTRNA基因设计一对引物（MPI和MP2），进行第一次PCR扩增，扩增片段为486bp（参见附录A）。以该扩增基因为模板设计第三条引物（MP3），以MP1和MP3为引物进行第二次PCR扩增，扩增片段为276bp。4设备、材料与试剂
4.1设备
电泳仪、凝胶成像分析系统、高速台式冷冻离心机<最高转速12000r/min以上）、PCR扩增仪、普通光学显微镜、CO2培养箱等。
4.2材料与试剂
试剂配制方法参见附录B.所用水为按照GB/T6682规定的一级水。所用试剂主要为DNA抽提缓冲液、CTAB沉淀液、1.2mol/L氯化钠溶液、三氮甲烷、异丙醇、70%乙醇、TaqDNA聚合酶、10X1
SN/T1682—2010
PCR冲液.dNTPs(含2.5mmol/LdATP.2.5mmol/LdCTP.2.5mmol/LdGTP.2.5mmol/LdTTP），10×氟化镁（25mmo1/）、10μg/ml.RNaseA、10mg/mL溴化乙锭存液、相对分子质量标准品（100bp~1000hp）、琼脂糖（电泳纯），50×TAE电泳缓冲液、蜂房蜜蜂球菌标准菌株(Melissococcus力luton），引物MP15-CTTTGAACGCCTTAGAGA-3、引物MP25'-ATCATCT-GTCCCACCTTA-3，引物MP35\-TTAACCTCGCGGTCTTGCGTCTCTC-3、分离琼脂培养基平板、分离琼脂培养基斜面等。
5样品采集
按GB/T18088规定的方法采样，或直接采集疑似感染的蜜蜂幼虫或蜂巢的病变区域。6实验室诊断
6.1直接镜检法
6.1.1涂片
刚死去的幼虫最适合于诊断。将刚死去的完整幼虫，置载玻片上直接抹成涂片，或用两把锻子夹住虫体中心部位的表皮并拉开，把中肠内容物暴露在载玻片上。挑取少量中肠内容物，加少量灭菌生理盐水制成悬液。取一接种环中肠内容物悬液，置干净载玻片上涂勾，自然风干或置火焰上慢慢干燥。6.1.2染色
进行革兰氏或石炭酸复红等染色。6.1.3镜检
在普通光学显微镜下进行检查，如发现0.5μm×1.0μm大小的单个或成串或头尾相接成对或成短链状排列的短披针状球菌，可以初步诊断为欧洲幼虫腐臭病，确切诊断要进行细菌分离培养或进行半巢式PCR法鉴定。镜检时视野内也可见到末端呈方形的细长杆状菌（参见附录C）。如果用整只幼虫或腐烂分解幼虫制成的悬液进行检查时，可见到杂乱无章排列的细菌，这样就很难区别蜂房蜜蜂球菌。6.2分离培养法
6.2.1分离培养
经镜检或根据临床症状疑为欧洲幼虫腐臭病时，按无菌操作取发病幼虫少许，最好是发病幼虫中肠内容物.加少量无菌生理盐水制成稀释悬液。用接种环取此悬液划线接种于分离琼脂培养基平板（参见附录B）。可疑样品应与标准参考菌株同步培养，以进行质量控制，确保试验结果准确。接种后的培养基置于含5%～10%CO2的庆氧培养箱中，（35土1)℃进行厌氧培养（此厌氧条件是必须的），通常4d内形成可见的白色不透明小菌落。挑取单个可疑菌落，接种分离琼脂培养基斜面，置于含5%～10%CO2的厌氧培养箱中，（35士1)℃厌氧培养，当有细菌明显生长时，将培养管密封，置4℃冰箱可保存6个月。同时挑取菌落进行染色镜检及进行下述的鉴别检测。6.2.2鉴定
其他许多细菌常与蜂房密蜂球菌并存，而造成混淆。腐败细菌在感染蜂房密蜜蜂球菌的幼虫体内大2
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量存在，为单个或链状细长平端杆菌。在特定的培养基中生长时，近似于链球菌，可与蜂房蜜蜂球菌混淆，但在蜂房蜜蜂球的必须培养条件下，生长较差，呈细杆状形态。粪链球菌在形态上与蜂房密蜂球菌极为相似，易混淆。体外培养时，粪链球菌在适宜于蜂房蜜蜂球菌生长条件下生长良好，通过有氧条件下的生长能力可以鉴别，粪链球菌在有氧条件下24h内可形成透明小菌落。在蜜蜂幼虫体内，粪链球菌的数量很少有超过蜂房蜜蜂球菌的，而且在没有蜂房蜜蜂球菌的密蜂幼虫体内，粪链球菌不能繁殖，因此可推断，当有大量粪链球菌在幼虫体内存在时，表明存在欧洲幼虫腐臭病。
在欧洲幼虫腐臭病感染的蜂群中，蜂房芽孢杆菌比粪链球菌更加普適，其芽孢带常超过其他所有细菌，能产生一种特征性的恶臭。在体外蜂房密蜂球菌生长的必要条件下，蜂房芽孢杆菌生长不良，产生一种扩散性生长菌落透明物，以弧形运动覆盖琼脂表面，通过镜检可与蜂房芽孢杆菌区别。对于上述分离培养物，也可直接采用下述半巢式PCR法进行鉴定。6.2.3结果判定
当发现大小为0.5μm×1.0μm，单个或成串或头尾相接成对或成短链状排列的短披针状球菌，并能与蜂房芽孢杆菌、粪链球菌和腐败细菌相区别时，可诊断为蜜蜂欧洲幼虫腐臭病。6.3半巢式PCR法
6.3.1样品核酸提取及纯化
取发病幼虫虫体或虫体中肠内容物悬液少许，或挑取可疑蜂房蜜蜂球菌菌落.加人J.5mLDNA抽提缓冲液并涡旋震荡30s，65℃水浴30min。室温12000r/min离心10min，取上清液800μL，加人5μlLRNaseA（10μg/mL），37℃保温30min。加人等体积的三氧甲烷/异戊醇（24/1，体积比），颠倒混勾1min，室温12000r/min离心10min，取上清液600μl，加人2倍体积的CTAB沉淀液，混勾，室温放置30min。室温12000r/min离心10min，弃上清液。加入800l氯化钠溶液（1.2mol/L）溶解沉淀，待沉淀溶解后室温放置5min，加入等体积三氛甲烷/异戊醇（24/1，体积比），颠倒混勾。室温12000r/min离心10min，取上清液600μL，移入1.5ml的离心管中，加人0.6倍体积的异丙醇，混勾，室温放置30min。4℃，12000r/min离心10min，弃上清液。用70%冷乙醇200μL洗涤沉淀两次，自然干燥后加入50叫l.TE缓冲液（pH8.0）或去离子水溶解核酸沉淀，一20℃保存。也可选用相应的商品化试剂盒提取和纯化样品核酸，按使用说明书进行操作。6.3.2标准菌株对照样品核酸提取及纯化把蜂房密蜂球菌标准菌株接种分离琼脂培养基斜面，置于5%～10%CO2条件下，（35土1）℃庆氧培养，有明显细菌生长时，取菌落进行核酸提取。取蜂房蜜蜂球菌菌落，加人1.5mLDNA抽提缓冲液，按6.3.1方法提取纯化核酸，作为阳性对照模板。
6.3.3PCR检测
6.3.3.1PCR反应体系的建立
用蜂房密蜂球菌核酸作为阳性对照模板、蜜蜂健康虫体核酸作为阴性对照模板，等体积双蒸水代替模板核酸作为空白对照，检测蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因。按照表1所示，加人样品核酸、蜂房蜜蜂球菌核酸、阴性对照样品核酸及其他成分，配制第一轮扩增体系。按照表1所示，加人第一轮扩增产物、蜂房蜜蜂球菌核酸、阴性对照样品核酸及其他成分，配制第二轮扩增体系。3免费标准bzxz.net
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表1蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因的巢式PCR反应体系分
10XPCR缓冲液
dNTP（各2.5mmol/L)
10×氯化镁（25mmol/L）
TaDNA聚合酶(5U/μL)
MP1(20 pmol/μl.)
MP2(20 pmol/μL)
MP3(20pmol/μL)
样品DNA
第一轮PCR扩增产物
双蒸水
PCR反应条件及扩增
第一轮扩增
第二轮扩增
PCR反应循环参数见表2.按照表中规定设置循环参数，进行第一轮和第二轮扩增。美2
扩增轮数
第一轮
第二轮
扩增片段长度
6.3.4PCR扩增产物电泳检测
PC反应参数
反应条件
随少性
72℃.60s
循环数
最终延伸
配制2%琼脂糖凝胶，加人溴化乙锭溶液至终浓度为0.5g/mL。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL～8μL第一轮和第二轮PCR扩增产物分别与适量加样缓冲液混匀，点样。3V/cm～5V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。6.3.5结果判定
对扩增产物进行电泳分析，观察是否出现预期大小的扩增产物条带（第一轮PCR扩增产物长度为486bp），并观察阳性对照、阴性对照及空白对照是否成立。以第一轮扩增产物为模板进行第二轮扩增，第二轮扩增目的产物长度为276bp。SN/T1682—2010
对第二轮扩增产物进行电泳分析，如果阳性对照、阴性对照和空白对照成立，测试样品出现预期大小的目的扩增产物条带，则可诊断为蜜蜂欧洲幼虫腐臭病：如果所有具有代表性的样品均未出现预期大小的扩增产物条带，则可诊断为非蜜蜂欧洲幼虫腐臭病。如需进一步确证，可进行测序分析，相关序列信息参见附录A。
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（资料性附录）
第一轮PCR扩增产物序列
CTTTGAACGCCTTAGAGATAAGGTTTCTCCTTCGGGAGCAAAGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAATTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAGAGAGACGCAAGACCGCGAGGTTAAGCAAATCTCATAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATNNGCACGCCGCGGTGAATACGTTCNNGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTAGGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGAT
B.11mol/L.Tris-HCI级冲液(pH8.0)附录B
（资料性附录）
试剂的配制
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称取121.1g三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），溶于800mL水中，搅拌，加入浓盐酸42mL，冷却至室温，用稀盐酸准确调节PH至8.0.加水定容室1I.分装后高压灭菌备用。B.20.5mol/LEDTA(pH8.0):
称取186.1g乙二胺四乙酸二钠（Naz-EDTA·2H，O），加800mL水，用磁力搅拌器剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液pH值至8.0（约需20g氢氧化钠颗粒），然后加水定容至1L，分装后高压灭菌备用。
B.3DNA抽提缓冲液：
1 mol/L Tris-HCI
0.5mol/LEDTA
十六烷基三甲基澳化铵（CTAB）氯化钠
聚乙烯吡略酮-40(PVP-40)
加水定容至1L,分装后高压灭菌备用。B.4CTAB沉淀液：
氯化钠
加水溶解定容至1L.分装后高压灭菌备用。B.51.2mol/L氮化钠溶液：
氯化钠
加水溶解定容至1L，分装后高压灭菌备用。B.6TE缓冲液（Tris-HC)、EDTA缓冲液）：1mol/LTris-HCI缓冲液(pH8.0)
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
加水定容至1L，分装后高压灭菌备用。B.750XTAE电泳缓冲液：
冰醋酸
0.5mol/LEDTA
溶于水后，定容至2L分装后高压灭菌备用。B.8分离琼脂培养基：
酵母浸出物
半胱氨酸或胱氨酸
葡萄糖或果糖
可溶性淀粉
磷酸二氢钾
0.2g~2.0g
加水定容到1L.pH6.6.分装成100mL每瓶，116℃高压灭菌20min。倾注平板或斜面，备用。SN/T1682—2010
附录C
（资料性附录）
三种细菌的形态区别
蜂房蜜蜂球菌（Melissococcusptutonius）：以单个、长链或成丛存在，形态上常与继发感染的粪链球菌相似。见图C.1。
蜂房芽孢杆菌（Bacillusdlei）：其紧殖菌体为（2.0μm~7.0μm）×（0.8μm~1.2μm），有鞭毛，一端出芽，繁殖休和芽孢都比幼虫芽孢杆菌大。见图C.2。腐败细菌（Bacteriumeurydice）：在体内呈细长、末端方形的杆状菌，而在体外某种培养基上则为链状球菌。见图c.3。
书号：155066·2-24069
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