SN/T 2120-2008
基本信息
标准号： SN/T 2120-2008
中文名称：流行性溃疡综合症检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 2120-2008.Protocol of quarantine for epizootic ulcerative syndrome.
1范围
SN/T 2120规定了各种淡水与半咸水鱼流行性溃疡综合症的诊断方法。
SN/T 2120适用于各种淡水与半咸水鱼流行性溃疡综合症的检疫。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682 - -2008, ISO 3696: 1987 ,MOD)
3概述
流行性溃疡综合症( Epizootic Ulcerative Syndrome)是由丝囊霉菌(A phanomyces invadans或者A.piscicida)引起的野生及养殖的淡水与半咸水鱼类的季节性流行病，也叫做红点病(RSD).霉菌性肉芽肿(MG)、霉菌性溃疡(UM),主要特征是在体表出现溃疡，骨骼肌中形成典型的霉菌性肉芽肿,简称EUS(参见附录A)。
4试剂和材料
4.1 水:用于PCR(包括核酸抽提)的水要用DEPC处理,以除去DNA酶和RNA酶,其余用水应符合GB/T 6682一级水的规格。
4.2Taq酶:-20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。
4.3 dNTPs:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L。
4.4 引物:一对引物,浓度为40μmol/L。
1范围
SN/T 2120规定了各种淡水与半咸水鱼流行性溃疡综合症的诊断方法。
SN/T 2120适用于各种淡水与半咸水鱼流行性溃疡综合症的检疫。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682 - -2008, ISO 3696: 1987 ,MOD)
3概述
流行性溃疡综合症( Epizootic Ulcerative Syndrome)是由丝囊霉菌(A phanomyces invadans或者A.piscicida)引起的野生及养殖的淡水与半咸水鱼类的季节性流行病，也叫做红点病(RSD).霉菌性肉芽肿(MG)、霉菌性溃疡(UM),主要特征是在体表出现溃疡，骨骼肌中形成典型的霉菌性肉芽肿,简称EUS(参见附录A)。
4试剂和材料
4.1 水:用于PCR(包括核酸抽提)的水要用DEPC处理,以除去DNA酶和RNA酶,其余用水应符合GB/T 6682一级水的规格。
4.2Taq酶:-20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。
4.3 dNTPs:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L。
4.4 引物:一对引物,浓度为40μmol/L。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2120—2008
流行性溃疡综合症检疫技术规范Protocol of quarantine for epizootic ulcerative syndrome2008-09-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-03-16实施
SN/T2120—2008
本标准修改采用国际兽疫局（OIE》《水生动物疾病诊断手册》2006版中第2.1.10章，对PCR中样品处理以及试验条件进行了调整和优化。本标准的附录B是规范性附录，附录A是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。，本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：史秀杰、邱杨、何俊强、刘、高隆英、杨锦舜、江育林。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1范围
流行性溃疡综合症检疫技术规范本标准规定了各种淡水与半咸水鱼流行性溃疡综合症的诊断方法。本标准适用于各种淡水与半咸水鱼流行性溃疡综合症的检疫。2规范性引用文件
SN/T2120—2008
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682--2008，ISO3696：1987，MOD）3
流行性溃疡综合症（EpizooticUlcerativeSyndrome）是由丝囊霉菌（Aphanomycesinvadans或者A.piscicida)引起的野生及养殖的淡水与半咸水鱼类的季节性流行病，也叫做红点病（RSD）、霉菌性肉芽肿（MG)、霉菌性溃疡（UM)，主要特征是在体表出现溃疡，骨骼肌中形成典型的霉菌性肉芽肿，简称EUS(参见附录A）。
4试剂和材料
4.1水：用于PCR(包括核酸抽提)的水要用DEPC处理，以除去DNA酶和RNA酶，其余用水应符合GB/T6682一级水的规格。
4.2Tag酶：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4.3dNTPs：含dCTP.dGTP、dATP、dTTP各1ommoL/L4.4引物：一对引物，浓度为40μmol/L。序列为：
FP1:5'-AAG-GCT-TGT-GCT-GAG-CTC-ACA-CTC-3\FP2:5'-GAT-GGC-TAA-GGT-TTC-AGT-ATG-TAG-3'扩增丝囊霉菌ITS1rDNA基因中的98bp的DNA片断。扩增产物的参考序列：
aaggcttgtg ctgagctcac actcggctag ccgaaggttt51
cgatgtactt ttaatccctt
taaactacat
actgaaacct
4.5无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。4.610%福尔马林。
酒精：70%、80%.95%及无水酒精。二甲苯。
4.9中性树脂。
石蜡。
1Harris氏苏木精染液。
20.5%伊红酒精溶液。
31%盐酸酒精溶液。
cgcaagaaac
tagccatc
SN/T-2120—2008
器材和设备
手术刀和镊子。
载玻片和盖玻片。
培养血。
恒温培养箱。
普通冰箱和低温冰箱。
倒置显微镜。
研钵。
离心机和离心管。
微量移液器及吸头。
PCR扩增仪。
电泳仪。
紫外观察灯或凝胶成像仪。
标本缸。
包埋机。
切片机。
流行性溃疡综合症的诊断
诊断原则
EUS的诊断基于出现临床症状后，并通过组织病理检查观察到特征性的霉菌性肉芽肿，或者从患病组织分离到丝囊霉菌（Aphanomycesinuadans或者A.piscicida）。6.2组织病理检查
取有溃疡症状的活的或濒死的病鱼，用10%的福尔马林固定病鱼的皮肤和肌肉（<1cm），包括坏死部位的边缘和四周的组织。固定好的组织按照常规石蜡切片方法制作切片，用苏木精-伊红（H&E）或一般的霉菌染色（如用Grocotts染色）后封片，显微镜下观察。6.3丝囊霉菌Aphanomycesinvadans（或A.piscicida）的分离取有溃疡症状的活的或濒死的病鱼，用无菌刀片从溃疡的边缘横切2片下来。用烧红的刀片消毒暴露的肌肉表面，用无菌小刀从溃疡下部切一圆形2mm2～4mm2的小块，放到加有100IU/mL青霉素和10μg/mL喹酸的GP肉汤（见附录B.第B.i章）平板中，工具不要碰到鱼的外表面。在25℃下培养接种物并在12h内用倒置显微镜镜检。将出现的菌丝重复转移到加有100IU/mL青霉素和10μg/mL链霉素的新鲜的GP琼脂（见附录B第B.2章）平板中，直到培养物纯净为止。霉菌分离物可以于10℃下在GP琼脂平板中保存7d，或者于25℃下在GY琼脂（见附录B第B.3章）平板中保存1个月。
6.4丝霉菌Aphanomyces invadans（或A.piscicida)的鉴定6.4.1诱导次级游走孢子
取6.3中带有生长活力菌丝的一小团琼脂（直径约3mm～4mm），放到含有GPY肉汤（见附录B第B.4章）的平血中，于20℃培养4d。在5个含有灭菌池塘水的平皿中依次洗涤培养物，洗脱琼脂，再将培养物放到新的灭菌池塘水中20℃过夜。12h后如果能形成原代孢囊群落，在倒置显微镜下观察。6.4.2PCR鉴定
6.4.2.1样品处理
取6.41GPY肉汤中分离到的霉菌菌丝，加人液氮后研磨成粉末，取50mg转人1.5mL的离心管中，用CTAB-酚-三氯甲烷-异戊醇抽提法抽提DNA。加CTAB(见附录B第B.6章)900μL，摇匀后，2
SN/T21202008
25℃作用2.5h。加600μL酚-三氯甲烷-异戊醇（见附录B第B.8章），充分混合30s，12000r/min离心5min，取上层水相（约800μL）。加700μL三氯甲烷-异戊醇（见附录B第B.7章），用力混合30s12000r/min离心5min，取上层水相（约600μL）。加1.5倍体积一20℃预冷的无水乙醇，混匀后一20℃过夜以沉淀核酸（在不能及时进行PCR检测的情况下，可置于1.5倍体积无水乙醇中，长期保存）；15000r/min离心30min，小心弃上清液，立即用滤纸吸干（应尽量充分吸干），37℃干燥约30min；加11μL水溶解，吹打20下，一80℃冻融一次，做PCR模板。6.4.2.2PCR扩增
PCR反应混合物总体积100μL：含10μLTag酶用10倍浓缩缓冲液、10μL氯化镁（MgCl2）2μLdNTP混合物、引物各2.5μL、1uLTag酶和62μL水，然后加人10μL待测样品DNA作为模板。如果PCR仪没有热盖还需要加人50μL矿物油。混匀后稍离心，再将反应管置于PCR扩增仪。先95℃变性3min，然后95℃30s→68℃30s→72℃30s；35次循环，再72℃5min。6.4.2.3设立对照
在6.4.2.2中设立阳性对照、阴性对照、空白对照。取已知的丝囊霉菌Aphanomycesinuadans（或A.piscicida)(由指定单位提供）和其他非丝囊霉菌属的霉菌，用6.4.2.1中的方法制备PCR模板，分别设立阳性对照和阴性对照：用10μL水作为PCR模板，设立空白对照。6.4.2.4琼脂糖电泳
用TBE缓冲液（见附录B第B.9章）配制1.5%的琼脂糖（含0.5μg/mLEB)板，约0.5cm厚。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μLPCR扩增产物和2μL上样缓冲液（见附录B第B.11章），混匀后加人样品孔。30mA电泳约0.5h，当溴酚蓝到达底部时停止。在电泳时设立DNA标准分子量Marker作对照。用紫外灯或凝胶成像仪观察核酸带。6.5结果判定
6.5.1组织病理检查
组织切片染色后，观察到在骨骼肌中有丝囊霉菌Aphanomycesinuadans（或A.piscicida）菌丝和典型的霉菌性肉芽肿（参见附录A的图A.1），可确诊是流行性溃疡综合症。6.5.2诱导次级游走孢子
经诱导的霉菌在倒置显微镜下观察，出现能游动的次级游走孢子（参见附录A的图A.2），可确认是丝囊霉菌Aphanomycesinvadans（或A.piscicida）。6.5.3PCR结果判定
PCR后阳性对照出现一条98bp的DNA片段，阴性对照和空白对照没有该扩增带。待测样品PCR后在相应的98bp的DNA位置上有带，取PCR扩增产物测序，同参考序列进行比较，符合的可判断结果为阳性，可确认是丝囊霉菌Aphanomycesinuadans（或A.piscicida）。无扩增带或扩增带的大小不是98 bp的为阴性。
SN/T21202008
附录A
（资料性附录）
流行性溃疡综合症
流行性溃疡综合症（EpizooticUlcerativeSyndrome）是由丝囊霉菌（Aphanomycesinuadans或者A.piscicida)引起的野生及养殖的淡水与半水鱼类的季节性流行病，也叫做红点病(RSD)、霉菌性肉芽肿（MG）、霉菌性溃疡（UM），主要特征是在体表出现溃疡，骨骼肌中形成典型的霉菌性肉芽肿，简称EUS。
该病于1971首次报道在日本养殖的香鱼（Plecoglossusaltivelis）中流行，随后又于1972年在澳大利亚东部的半咸水鱼灰巢（Mugilcephalus)发现该病。疾病迅速扩散，从巴布亚新几内亚进人东南亚到南亚，现已进人西亚，到达巴基斯坦。在美国爆发的鲱鱼（Brevoortiatyrannus）溃疡病和亚洲的EUS非常相似。已经确诊有50多种鱼会对这种病有抗性。引起EUS的霉菌病毒和寄生虫在疾病的爆发
成进一
步的损伤。
的淡水鱼（包括在稻田
面上，有时变得不停地游动，在体表溃疡，并常伴有棕色的坏死，在于IS的侵害
但有些重要的养殖品种如罗非鱼、遮目鱼、鲤鱼等sinvadans或者A.piscicida);弹状氏阴性菌会引起病鱼的继发感染而对病鱼造降雨之后爆发。爆发时，各种野生和养殖有狼高的死
病鱼早期不吃食，鱼体发黑，病鱼漂浮在水鳃盖和尾部可见红斑。在后期会出现较大的红色或灰色的浅部块的损伤。
和香部有大
会死亡。对于特别敏感的鱼，损伤会和硬组织的坏死，使活鱼的脑部暴露出来。除了乌和鱼外，大多数鱼在这个阶段就展加深，以至到达身体较深的部位，或者造成头盖骨软组织丝囊霉菌经游走孢子在水体中水平传播。只有游走孢子可以感染有损伤的鱼的皮肤，并入侵组织长出菌丝闭水体里爆发，通过石灰消毒用水、鉴于EUS在水产养殖业中造成的巨大患病鱼肌肉中典型霉菌性肉芽肿图A.1
在自然水域中很难控制该病。若该病在小水体和封鱼等方法，可以有效地降低死亡率和控制该病。E将其列人鱼类疫病检疫名录中。和图A.2bzxZ.net
患病鱼肌肉中典型霉菌性肉芽肿图A.2
丝囊霉菌菌丝
SN/T2120—2008
SN/T2120—2008
GP(葡萄糖/蛋白陈）肉汤
葡萄糖
蛋白陈
硫酸镁（MgSO.·7H2）
磷酸二氢钾（KHPO）
氯化钙（CaCl2·2H2O)
氯化铁（FeCl·6HzO)
氯化锰（MnClz·4H,O）
硫酸铜（CuSO·5H.O）
硫酸锌（ZnSO.·7H.O)
高压灭菌过的池塘水
GP(葡萄糖/蛋白陈)琼脂
GP肉汤
GY（葡萄糖/酵母）琼脂
葡萄糖
酵母提取物
高压灭菌过的池塘水
附录B
（规范性附录）
试剂配制
B.4-GPY（葡萄糖/蛋白陈/酵母）肉汤GP肉汤
酵母提取物
高压灭菌过的池塘水
将池塘水/湖泊水过滤后加入2倍的无菌水后高压灭菌，pH为6~B.6CTAB溶液
按CTAB2%，氯化钠(NaCI)1.4mol/LEDTA20.0mmol/L,Tris-HCI20.0mmol/LpH=7.5配制。用前加巯基乙醇至终浓度为0.25%。B.7
三氯甲烷-异戊醇
将两者按24：1的比例混合，密闭避光保存。B.8酚-三氯甲烷-异戊醇
用1mol/LTris饱和过的重蒸酚，和三氯甲烷-异戊酚等体积混合，密闭避光保存。6
TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）
用5.0mol/L的盐酸（HCI)调pH到8.0。B.10EB
SN/T 2120—2008
用水配制成10.0mg/mL的浓缩液。用时每10.0mL电泳液或琼脂中加1.0μL。B.11
上样缓冲液
每100.0mL溶液中含：溴酚蓝0.25g，蔗糖40.0g。SN/T2120-2008
中华人民共和国出人境检验检疫行业标推
流行性溃疡综合症检疫技术规范SN/T2120—2008
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷事
开本880×12301/16
2008年11月第一版
印张0.75
字数14千字
2008年11月第一次印刷
印数1-—2000
书号：1550662-19207
定价12.00元
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流行性溃疡综合症检疫技术规范Protocol of quarantine for epizootic ulcerative syndrome2008-09-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-03-16实施
SN/T2120—2008
本标准修改采用国际兽疫局（OIE》《水生动物疾病诊断手册》2006版中第2.1.10章，对PCR中样品处理以及试验条件进行了调整和优化。本标准的附录B是规范性附录，附录A是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。，本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：史秀杰、邱杨、何俊强、刘、高隆英、杨锦舜、江育林。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1范围
流行性溃疡综合症检疫技术规范本标准规定了各种淡水与半咸水鱼流行性溃疡综合症的诊断方法。本标准适用于各种淡水与半咸水鱼流行性溃疡综合症的检疫。2规范性引用文件
SN/T2120—2008
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682--2008，ISO3696：1987，MOD）3
流行性溃疡综合症（EpizooticUlcerativeSyndrome）是由丝囊霉菌（Aphanomycesinvadans或者A.piscicida)引起的野生及养殖的淡水与半咸水鱼类的季节性流行病，也叫做红点病（RSD）、霉菌性肉芽肿（MG)、霉菌性溃疡（UM)，主要特征是在体表出现溃疡，骨骼肌中形成典型的霉菌性肉芽肿，简称EUS(参见附录A）。
4试剂和材料
4.1水：用于PCR(包括核酸抽提)的水要用DEPC处理，以除去DNA酶和RNA酶，其余用水应符合GB/T6682一级水的规格。
4.2Tag酶：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4.3dNTPs：含dCTP.dGTP、dATP、dTTP各1ommoL/L4.4引物：一对引物，浓度为40μmol/L。序列为：
FP1:5'-AAG-GCT-TGT-GCT-GAG-CTC-ACA-CTC-3\FP2:5'-GAT-GGC-TAA-GGT-TTC-AGT-ATG-TAG-3'扩增丝囊霉菌ITS1rDNA基因中的98bp的DNA片断。扩增产物的参考序列：
aaggcttgtg ctgagctcac actcggctag ccgaaggttt51
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4.5无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。4.610%福尔马林。
酒精：70%、80%.95%及无水酒精。二甲苯。
4.9中性树脂。
石蜡。
1Harris氏苏木精染液。
20.5%伊红酒精溶液。
31%盐酸酒精溶液。
cgcaagaaac
tagccatc
SN/T-2120—2008
器材和设备
手术刀和镊子。
载玻片和盖玻片。
培养血。
恒温培养箱。
普通冰箱和低温冰箱。
倒置显微镜。
研钵。
离心机和离心管。
微量移液器及吸头。
PCR扩增仪。
电泳仪。
紫外观察灯或凝胶成像仪。
标本缸。
包埋机。
切片机。
流行性溃疡综合症的诊断
诊断原则
EUS的诊断基于出现临床症状后，并通过组织病理检查观察到特征性的霉菌性肉芽肿，或者从患病组织分离到丝囊霉菌（Aphanomycesinuadans或者A.piscicida）。6.2组织病理检查
取有溃疡症状的活的或濒死的病鱼，用10%的福尔马林固定病鱼的皮肤和肌肉（<1cm），包括坏死部位的边缘和四周的组织。固定好的组织按照常规石蜡切片方法制作切片，用苏木精-伊红（H&E）或一般的霉菌染色（如用Grocotts染色）后封片，显微镜下观察。6.3丝囊霉菌Aphanomycesinvadans（或A.piscicida）的分离取有溃疡症状的活的或濒死的病鱼，用无菌刀片从溃疡的边缘横切2片下来。用烧红的刀片消毒暴露的肌肉表面，用无菌小刀从溃疡下部切一圆形2mm2～4mm2的小块，放到加有100IU/mL青霉素和10μg/mL喹酸的GP肉汤（见附录B.第B.i章）平板中，工具不要碰到鱼的外表面。在25℃下培养接种物并在12h内用倒置显微镜镜检。将出现的菌丝重复转移到加有100IU/mL青霉素和10μg/mL链霉素的新鲜的GP琼脂（见附录B第B.2章）平板中，直到培养物纯净为止。霉菌分离物可以于10℃下在GP琼脂平板中保存7d，或者于25℃下在GY琼脂（见附录B第B.3章）平板中保存1个月。
6.4丝霉菌Aphanomyces invadans（或A.piscicida)的鉴定6.4.1诱导次级游走孢子
取6.3中带有生长活力菌丝的一小团琼脂（直径约3mm～4mm），放到含有GPY肉汤（见附录B第B.4章）的平血中，于20℃培养4d。在5个含有灭菌池塘水的平皿中依次洗涤培养物，洗脱琼脂，再将培养物放到新的灭菌池塘水中20℃过夜。12h后如果能形成原代孢囊群落，在倒置显微镜下观察。6.4.2PCR鉴定
6.4.2.1样品处理
取6.41GPY肉汤中分离到的霉菌菌丝，加人液氮后研磨成粉末，取50mg转人1.5mL的离心管中，用CTAB-酚-三氯甲烷-异戊醇抽提法抽提DNA。加CTAB(见附录B第B.6章)900μL，摇匀后，2
SN/T21202008
25℃作用2.5h。加600μL酚-三氯甲烷-异戊醇（见附录B第B.8章），充分混合30s，12000r/min离心5min，取上层水相（约800μL）。加700μL三氯甲烷-异戊醇（见附录B第B.7章），用力混合30s12000r/min离心5min，取上层水相（约600μL）。加1.5倍体积一20℃预冷的无水乙醇，混匀后一20℃过夜以沉淀核酸（在不能及时进行PCR检测的情况下，可置于1.5倍体积无水乙醇中，长期保存）；15000r/min离心30min，小心弃上清液，立即用滤纸吸干（应尽量充分吸干），37℃干燥约30min；加11μL水溶解，吹打20下，一80℃冻融一次，做PCR模板。6.4.2.2PCR扩增
PCR反应混合物总体积100μL：含10μLTag酶用10倍浓缩缓冲液、10μL氯化镁（MgCl2）2μLdNTP混合物、引物各2.5μL、1uLTag酶和62μL水，然后加人10μL待测样品DNA作为模板。如果PCR仪没有热盖还需要加人50μL矿物油。混匀后稍离心，再将反应管置于PCR扩增仪。先95℃变性3min，然后95℃30s→68℃30s→72℃30s；35次循环，再72℃5min。6.4.2.3设立对照
在6.4.2.2中设立阳性对照、阴性对照、空白对照。取已知的丝囊霉菌Aphanomycesinuadans（或A.piscicida)(由指定单位提供）和其他非丝囊霉菌属的霉菌，用6.4.2.1中的方法制备PCR模板，分别设立阳性对照和阴性对照：用10μL水作为PCR模板，设立空白对照。6.4.2.4琼脂糖电泳
用TBE缓冲液（见附录B第B.9章）配制1.5%的琼脂糖（含0.5μg/mLEB)板，约0.5cm厚。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μLPCR扩增产物和2μL上样缓冲液（见附录B第B.11章），混匀后加人样品孔。30mA电泳约0.5h，当溴酚蓝到达底部时停止。在电泳时设立DNA标准分子量Marker作对照。用紫外灯或凝胶成像仪观察核酸带。6.5结果判定
6.5.1组织病理检查
组织切片染色后，观察到在骨骼肌中有丝囊霉菌Aphanomycesinuadans（或A.piscicida）菌丝和典型的霉菌性肉芽肿（参见附录A的图A.1），可确诊是流行性溃疡综合症。6.5.2诱导次级游走孢子
经诱导的霉菌在倒置显微镜下观察，出现能游动的次级游走孢子（参见附录A的图A.2），可确认是丝囊霉菌Aphanomycesinvadans（或A.piscicida）。6.5.3PCR结果判定
PCR后阳性对照出现一条98bp的DNA片段，阴性对照和空白对照没有该扩增带。待测样品PCR后在相应的98bp的DNA位置上有带，取PCR扩增产物测序，同参考序列进行比较，符合的可判断结果为阳性，可确认是丝囊霉菌Aphanomycesinuadans（或A.piscicida）。无扩增带或扩增带的大小不是98 bp的为阴性。
SN/T21202008
附录A
（资料性附录）
流行性溃疡综合症
流行性溃疡综合症（EpizooticUlcerativeSyndrome）是由丝囊霉菌（Aphanomycesinuadans或者A.piscicida)引起的野生及养殖的淡水与半水鱼类的季节性流行病，也叫做红点病(RSD)、霉菌性肉芽肿（MG）、霉菌性溃疡（UM），主要特征是在体表出现溃疡，骨骼肌中形成典型的霉菌性肉芽肿，简称EUS。
该病于1971首次报道在日本养殖的香鱼（Plecoglossusaltivelis）中流行，随后又于1972年在澳大利亚东部的半咸水鱼灰巢（Mugilcephalus)发现该病。疾病迅速扩散，从巴布亚新几内亚进人东南亚到南亚，现已进人西亚，到达巴基斯坦。在美国爆发的鲱鱼（Brevoortiatyrannus）溃疡病和亚洲的EUS非常相似。已经确诊有50多种鱼会对这种病有抗性。引起EUS的霉菌病毒和寄生虫在疾病的爆发
成进一
步的损伤。
的淡水鱼（包括在稻田
面上，有时变得不停地游动，在体表溃疡，并常伴有棕色的坏死，在于IS的侵害
但有些重要的养殖品种如罗非鱼、遮目鱼、鲤鱼等sinvadans或者A.piscicida);弹状氏阴性菌会引起病鱼的继发感染而对病鱼造降雨之后爆发。爆发时，各种野生和养殖有狼高的死
病鱼早期不吃食，鱼体发黑，病鱼漂浮在水鳃盖和尾部可见红斑。在后期会出现较大的红色或灰色的浅部块的损伤。
和香部有大
会死亡。对于特别敏感的鱼，损伤会和硬组织的坏死，使活鱼的脑部暴露出来。除了乌和鱼外，大多数鱼在这个阶段就展加深，以至到达身体较深的部位，或者造成头盖骨软组织丝囊霉菌经游走孢子在水体中水平传播。只有游走孢子可以感染有损伤的鱼的皮肤，并入侵组织长出菌丝闭水体里爆发，通过石灰消毒用水、鉴于EUS在水产养殖业中造成的巨大患病鱼肌肉中典型霉菌性肉芽肿图A.1
在自然水域中很难控制该病。若该病在小水体和封鱼等方法，可以有效地降低死亡率和控制该病。E将其列人鱼类疫病检疫名录中。和图A.2bzxZ.net
患病鱼肌肉中典型霉菌性肉芽肿图A.2
丝囊霉菌菌丝
SN/T2120—2008
SN/T2120—2008
GP(葡萄糖/蛋白陈）肉汤
葡萄糖
蛋白陈
硫酸镁（MgSO.·7H2）
磷酸二氢钾（KHPO）
氯化钙（CaCl2·2H2O)
氯化铁（FeCl·6HzO)
氯化锰（MnClz·4H,O）
硫酸铜（CuSO·5H.O）
硫酸锌（ZnSO.·7H.O)
高压灭菌过的池塘水
GP(葡萄糖/蛋白陈)琼脂
GP肉汤
GY（葡萄糖/酵母）琼脂
葡萄糖
酵母提取物
高压灭菌过的池塘水
附录B
（规范性附录）
试剂配制
B.4-GPY（葡萄糖/蛋白陈/酵母）肉汤GP肉汤
酵母提取物
高压灭菌过的池塘水
将池塘水/湖泊水过滤后加入2倍的无菌水后高压灭菌，pH为6~B.6CTAB溶液
按CTAB2%，氯化钠(NaCI)1.4mol/LEDTA20.0mmol/L,Tris-HCI20.0mmol/LpH=7.5配制。用前加巯基乙醇至终浓度为0.25%。B.7
三氯甲烷-异戊醇
将两者按24：1的比例混合，密闭避光保存。B.8酚-三氯甲烷-异戊醇
用1mol/LTris饱和过的重蒸酚，和三氯甲烷-异戊酚等体积混合，密闭避光保存。6
TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）
用5.0mol/L的盐酸（HCI)调pH到8.0。B.10EB
SN/T 2120—2008
用水配制成10.0mg/mL的浓缩液。用时每10.0mL电泳液或琼脂中加1.0μL。B.11
上样缓冲液
每100.0mL溶液中含：溴酚蓝0.25g，蔗糖40.0g。SN/T2120-2008
中华人民共和国出人境检验检疫行业标推
流行性溃疡综合症检疫技术规范SN/T2120—2008
中国标准出版社出版
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷事
开本880×12301/16
2008年11月第一版
印张0.75
字数14千字
2008年11月第一次印刷
印数1-—2000
书号：1550662-19207
定价12.00元
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