SN/T 1146.2-2009
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标准简介
SN/T 1146.2-2009.Molecular detection of Tobacco ringspot virus.
1范围
SN/T 1146.2规定了烟草环斑病毒分子生物学检测的基本原则和方法
SN/T 1146.2适用于无性繁殖材料、组培苗、鳞球茎和种子苗木中携带的烟草环斑病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准.
SN/T1146烟草环斑病毒检疫鉴定方法
3原理
3.1烟草环斑病毒学名及分类地位
中文名:烟草环斑病毒
英文名:Tobacco ringspot virus
缩写:TRSV
分类地位:豇豆花叶病毒科(Comoviridae),线虫传多面体病毒属(Nepovirus)。
3.2烟草环斑病毒基 因组
基因组含两条ssRNA. RNA-1长7. 514 kb;RNA-2长3.929 kb,外壳蛋白基因1. 548 kb.
其他资料参见附录A.
4仪器设备、用具和试剂
4.1仪器设备
PCR仪、实时荧光定量PCR仪、超净工作台、电子天平(1/10 000 g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、高速冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器。
4.2用具
可调式微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5 000μL)及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管和研钵等。
1范围
SN/T 1146.2规定了烟草环斑病毒分子生物学检测的基本原则和方法
SN/T 1146.2适用于无性繁殖材料、组培苗、鳞球茎和种子苗木中携带的烟草环斑病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准.
SN/T1146烟草环斑病毒检疫鉴定方法
3原理
3.1烟草环斑病毒学名及分类地位
中文名:烟草环斑病毒
英文名:Tobacco ringspot virus
缩写:TRSV
分类地位:豇豆花叶病毒科(Comoviridae),线虫传多面体病毒属(Nepovirus)。
3.2烟草环斑病毒基 因组
基因组含两条ssRNA. RNA-1长7. 514 kb;RNA-2长3.929 kb,外壳蛋白基因1. 548 kb.
其他资料参见附录A.
4仪器设备、用具和试剂
4.1仪器设备
PCR仪、实时荧光定量PCR仪、超净工作台、电子天平(1/10 000 g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、高速冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器。
4.2用具
可调式微量移液器(2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5 000μL)及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管和研钵等。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1146.2—2009
烟草环斑病毒分子生物学检测方法Molecular detection of Tobacco ringspot virus2009-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
微码防
2010-03-16实施
本标准的附录B、附录C和附录D均为规范性附录，附录A为资料性附录。本标准由认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1146.2--2009
本标准由中华人民共和国上海出人境检验检疫局负责起草、中国检验检疫科学研究院参加起草。本标准主要起草人：杨翠云，于翠、魏梅生，高辉、乔艳艳。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1范围
烟草环斑病毒分子生物学检测方法本标准规定了烟草环斑病毒分子生物学检测的基本原则和方法。SN/T1146.2—2009
本标准适用于无性繁殖材料、组培苗、鳞球茎和种子苗木中携带的烟草环斑病毒的检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN/T1146烟草环斑病毒检疫鉴定方法3原理
3.1烟草环斑病毒学名及分类地位中文名：烟草环斑病毒
英文名：Tobacco ringspot virus缩写：TRSV
分类地位：豇豆花叶病毒科（Comoviridae），线虫传多面体病毒属（Nepovirus）。3.2烟草环斑病毒基因组
基因组含两条ssRNA。RNA-1长7.514kb；RNA-2长3.929kb，外壳蛋白基因1.548kb。其他资料参见附录A。
仪器设备、用具和试剂
4.1仪器设备
PCR仪，实时荧光定量PCR仪，超净工作台，电子天平（1/10000g），电泳仪、电泳槽，凝胶成像系统、水浴锅、高速冷冻离心机、一80℃C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器。4.2用具
可调式微量移液器（2μL10μL100μl200μL］000μl、5000L）及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管和研钵等。4.3试剂
RT-PCR试剂(见附录B）、IC-RT-PCR试剂(见附录C)和实时荧光RT-PCR试剂(见附录D)。5病霉检测
抽样与制样方法按照SN/T1146规定的方法执行。采用RT-PCR(见附录B)、IC-RT-PCR(见附录C)和实时荧光RT-PCR(见附录D)进行病毒检测。6结果判定
样品经RT-PCR、IC-RT-PCR和实时荧光RT-PCR三种方法之一检测为阴性时，证明样品不携带烟草环斑病毒。
样品经RT-PCR和IC-RT-PCR检测为阳性，需要进行序列测定，如果序列测定结果证实与所检测1
SN/T1146.2—2009
的烟草环斑病毒病毒一致，可判定样品携带烟草环斑病毒。样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，也可判定样品携带烟草环斑病毒。7样品保存和结果记录
7.1样品保存
经检验确定携带烟草环斑病毒的样品，应在适合的条件下妥善保存。如种子保存在干燥条件下，其他情况的取实验样品保存在20℃冰箱中，有条件的保存在一80℃冰箱中更好。做好登记和标记工作。
7.2结果记录
记录包括：样品来源，种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。RTPCR和IC-RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析，实时荧光RT-PCR应有扩增曲线图片。2
A.1名称
中文名：烟草环斑病毒
英文名：Tobacco ringspotvirus缩写：TRSV
附录A
（资料性附录）
烟草环斑病毒简介
分类地位：豇豆花叶病毒科（Cornoviridae），线虫传多面体病毒属（Nepouirus）。A.2寄主范围
SN/T1146.2—2009
自然侵染寄主有豆类、瓜类、薯类、花卉和果树等。常见寄主范围很广，可侵染54科246种植物，的有大豆、马铃薯、甘薯、烟草、西瓜、黄瓜、甜派、西葫芦、胡萝下、莴苣、莱豆、豇豆、茄子、菠菜、香石竹、唐苔蒲、百合、水仙花、鸢尾、天竺葵、李属、苹果、葡萄、甜樱桃、越桔、白蜡树等。A.3为害症状
TRSV影响寄主植物的整个生长期。一因寄主不同可产生不同的症状，造成叶片系统褪绿斑，坏死环斑，茎坏死条纹，危害严重时导致植株矮化，结果少和果实变小。有的症状在后期可恢复，无症带毒。A.4分布地区
欧洲：丹麦、前苏联、波兰、捷克、匈牙利、德国、奥地利、瑞生、荷兰、比利时、英国、爱尔兰、法国、西班牙、葡葡牙、意大利前南斯拉夫、罗马尼亚、保加利亚、希腊、土耳其非洲：摩洛哥、尼日利亚、扎伊东、马拉维美洲：美国、加拿大、古巴、多米尼加、巴西亚洲：日本、印度尼西亚、伊朗、中国大洋洲：澳大利亚、新西兰
A.5传播方式
A.5.1介体传播
传毒介体主要是美洲剑线虫（Xiphinemaamericanum），另外烟蓟马（Thripstabaci），叶螨（Tet-ranychussp.），墨西哥黑蝗（Melanophusmericanes）、赤腔黑蝗（Melanophusfemurrubrum）、烟草跳甲（Epitrixhirtipennis）和桃蚜（Myzuspersicae）也可以传毒。A.5.2种子传毒
种传寄主很多，如大豆、甜瓜、莴苣、豇豆、千日红、马铃薯和天竺葵等都可种传，其中大豆种传率高达40%~100%，甜瓜3%~7%，紅豆82%。A.5.3无性繁殖材料传毒
通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播。3
SN/T1146.2-—2009
A.6粒体形态
病毒粒体为等轴多面体球状颗粒，直径约28nm。A.7
基因组
病毒基因组含两条ssRNA。RNA-1长7.514kb：RNA-2长3.929kb，外壳蛋白基因1.548kb。B.1试剂
附录B
（规范性附录）
RT-PCR方法
B.1.1核酸提取试剂为商品化Trizol试剂。B.1.250XTAE
冰乙酸
0.5mol/L.EDTA100ml
用时加蒸馏水稀释至1×TAE。
B.2实验步骤
B.2.1引物设计
根据已报道的TRSVCP基因的保守序列设计2对特异性引物：第一对序列为：TRSVF-1:5\-GATGCAAAGAAAGGAAAGC-3TRSVR-1:5\-AGATATGGACAACATGGAG-3扩增片段大小为576bp。
第二对序列为：TRSVF-2：5-ATGTGTGCTGTGACAGTTG-3*TRSVR-2:5*-TTAAAACAAAGTGGCGGAGCG-3*扩增片段大小为1548bp(CP基因全长）。B.2.2RNA提取
SN/T1146.2-2009
B.2.2.1取0.1g样品，液氢研细，加人1mLTrizol混句，倒人1.5mL离心管中。B.2.2.2加人0.2mL三氯甲烷，猛烈震荡15s，4℃11000z/min离心10min，小心吸取上层无色水相到新离心管中
B.2.2.3加人等体积异丙醇，混勾，-20℃静置10min，4℃12000r/min离心15min，保留沉淀。B.2.2.4加人1mL75%冷乙醇，悉浮沉淀，4℃8000r/min离心10min，干燥沉淀。B.2.2.5加入30μLDEPC-H2O，溶解沉淀（必要时，55℃～60℃水浴10min，加速溶解），存于一80℃备用。
B.2.3反转录
利用提取的RNA在PCR管中进行反转录。反转录体系20μL,其中2μL模板RNA，1μL反向引物（20μmol/L)，4μl.5×AMV酶buffer2μLdNTP(10mmol/L），1μLAMV反转录酶（5U/μL）1μLRNA酶抑制剂(40U/μL).9μLDEPC-H2O。42C反应1h。B.2.4PCR扩增
PCR反应体系见表B.1，每个样品设2个平行处理。检测时以含烟草环斑病毒材料的cDNA或含有烟草环斑病毒目标片断的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。PCR反应条件设置如下：
第对引物：94℃4min94℃45s.48℃45s.72℃45s30个循环：72℃10min延伸第二对引物：94℃4min94℃45s，52℃45s.72℃90s30个循环：72℃10min延伸。注：为了提检测TRSV的灵敏度，可以利用两对引物进行巢式RT-PCR，首先用长片段引物第一轮扩增15个循环后，取PCR产物稀释500倍～1000倍，用短片段引物进行第二轮扩增30个循环。5
SN/T1146.2--2009
PCR缓冲液
氯化镁（MgCl2）
正向引物
反向引物
补水至
B.2.5琼脂糖凝胶电泳检测
B.2.5.1制备凝胶
表B.1PCR反应体系
贮备液浓度
25mmol/L
10mmol/L
20μmol/L
20μmol/L
5U/μL
终浓度
2.0mmol/L
0.4mmol/E.
0.2μmol/1.
0.2μmol/L.
1.5U/1est
用1×TAE配制1.5%琼脂糖凝胶，加热溶化后冷却至55℃左右B.2.5.2加溴化乙锭
加样量/uL
将溴化乙锭（EB)加人到配制好的凝胶中，EB终浓度为0.5μg/mL。将凝胶倒人凝胶槽中，插上样品梳子。冷却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加入1×TAE缓冲液要没过凝胶表面约1mm。B.2.5.3加样
将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔.同时设计PCR的阴性对照和阳性对照，并加入分子量标准物（Marker）。
B.2.5.4电泳
接通电源，以3V/cm~5V/cm电场强度进行电泳，0.5h后观察结果。B.2.6结果观察
电泳结束后，将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察。记录结果。B.3结果判断
通过观察，在576bp和1548bp两个位点正，阳性对照应出现相应条带，阴性和空白对照不会出现相应条带，此时如果检测样品在上述两个位点上呈现出条带应被判为阳性，否则应被判为阴性。如果是阳性可通过测序的方式进一步确认。如果,PCR产物序列与烟草环斑病毒的序列同源，则可判定样品为烟草环斑病毒阳性，若序列不同源，则可判定样品为烟草环斑病毒阴性。c.1试剂
C.1.1TRSV抗体
C.1.2包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（Na2CO）
碳酸氢钠（NaHCO,）
叠氰钠(NaN）
附录C
（规范性附录）
IC-RT-PCR方法
溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容至1L。C.1.3PBST缓冲液(pH7.4)
氯化钠（NaCI)）
磷酸二氢钾（KH2PO）
磷酸氢二钠（Na2HPO.）
氯化钾（KCI)）
叠氮钠（NaNs）
吐温20(Tween-20)
溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容室1LC.T.4样品抽提缓冲液（pH7.4）亚硫酸钠（Na2SO）
聚乙烯基吡略烷酮(PVP)
溶于PBST中，并用PBST定容至让C.2实验步骤
引物设计
见附录B。
C.2.2抗体吸附
SN/T1146.2—2009
将TRSV抗体用包被缓冲液作适量稀释，吸取200μI.包被PCR管，37℃，孵育2h；用PBST洗3次，取样品50mg，加人样品抽提缓冲液进行研磨，吸取100μL包被PCR管，4℃过夜（或37℃，孵育2h）：PBST洗3次，DEPC-H2O洗1次，短暂离心后吸去管底余液。C.2.3反转录
直接在吸附了病毒的PCR管中进行反转录。反转录体系总体积20μL，其中1μl。反向引物（20μmol/L），4L5×AMV酶buffer2μLdNTP(1ommol/L）11μLDEPC-H2O.稍离心混匀后置85℃变性5min，迅速置冰上2min~3min，然后加人1μLAMV反转录酶（5U/μL），lμLRNA酶抑制剂（40U/μL），42℃反应1h。C.2.4PCR扩增和琼脂糖凝胶检测操作方法见附录B。
SN/T1146.2—2009
结果判断
通过观察，在576bp和1548bp两个位点上，阳性对照应出现相应条带，阴性和空白对照不会出现相应条带，此时如果检测样品在上述两个位点上呈现出条带应被判为阳性，否则应被判为阴性。如果是阳性可通过测序的方式进一步确认。如果PCR产物序列与烟草环斑病毒的序列同源，则可判定样品为烟草环斑病毒阳性，若序列不同源，则可判定样品为烟草环斑病毒阴性。8
D.1实验步骤
D.1.1引物设计
附录D
（规范性附录）
实时荧光RT-PCR方法
SN/T1146.2—2009
根据国际基因库中已公布的TRSVCP基因的保守序列，设计了1对特异性引物和探针，引物序列：bzxZ.net
TRSV-5P:5'-TCCATGTTGTCCATATCTTA-3TRSV-3P.5-AGAAGAAACACTCTTGACACT-3探针序列：
5-Fam-CCGCTTATAGTGCCAGACCA-Tamra-3D.1.2RNA提取及反转录
操作方法见附录B。
D.1.3实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表D.1，每个样品设2个平行处理。并设阳性对照，阴性对照和空白对照，以含有烟草环斑病毒的cDNA为阳性对照；以健康植物材料或线虫传多面体病毒属其他病毒的cDNA作为阴性对照；以水代替DNA模板作为空白对照。每种对照各做2个平行管。表D.1实时荧光PCR反应体系
PCR缓冲液
氧化镁（MgCla）
正向引物
反向引物
Taq酶
补水至
D.1.4实时荧光PCR反应参数
贮备液浓度
25mmol/L
10mmol/L
20pmol/L
20pmol/L
5U/μL
20pmol/L
终浓度
3.0mmol/L
0.2mmol/L
0.24μmol/L
0.24μmol/L
2U/test
0.4μmal/L
加样量/μl
反应条件：预变性94℃5min，94℃15$，55℃405.72℃40s，共40个循环。点击运行，进行PCR反应，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出△Rn（荧光信号增加值）与循环数之间关系的图像。
D.2结果判定
待测样品的Ct值为40时，则判定未检测到烟草环斑病毒。待测样品的Ct值小于或等于35时，则判定检测到烟草环斑病毒。待测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值为40时，则判定未检测到烟草环斑病毒。如果重新测试的Ct值小于40而大于35时，则判定检测到烟草环斑病毒。9
SN/T1146.2-2009
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
烟草环斑病毒分子生物学检测方法SN/T1146.2—2009
中国标雁出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社案皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16印张1字数16千字2009年12月第一版 2009年12月第一次印刷印数1—2000
书号：155066·2-20146定价18.00元0
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烟草环斑病毒分子生物学检测方法Molecular detection of Tobacco ringspot virus2009-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
微码防
2010-03-16实施
本标准的附录B、附录C和附录D均为规范性附录，附录A为资料性附录。本标准由认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1146.2--2009
本标准由中华人民共和国上海出人境检验检疫局负责起草、中国检验检疫科学研究院参加起草。本标准主要起草人：杨翠云，于翠、魏梅生，高辉、乔艳艳。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1范围
烟草环斑病毒分子生物学检测方法本标准规定了烟草环斑病毒分子生物学检测的基本原则和方法。SN/T1146.2—2009
本标准适用于无性繁殖材料、组培苗、鳞球茎和种子苗木中携带的烟草环斑病毒的检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN/T1146烟草环斑病毒检疫鉴定方法3原理
3.1烟草环斑病毒学名及分类地位中文名：烟草环斑病毒
英文名：Tobacco ringspot virus缩写：TRSV
分类地位：豇豆花叶病毒科（Comoviridae），线虫传多面体病毒属（Nepovirus）。3.2烟草环斑病毒基因组
基因组含两条ssRNA。RNA-1长7.514kb；RNA-2长3.929kb，外壳蛋白基因1.548kb。其他资料参见附录A。
仪器设备、用具和试剂
4.1仪器设备
PCR仪，实时荧光定量PCR仪，超净工作台，电子天平（1/10000g），电泳仪、电泳槽，凝胶成像系统、水浴锅、高速冷冻离心机、一80℃C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器。4.2用具
可调式微量移液器（2μL10μL100μl200μL］000μl、5000L）及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管和研钵等。4.3试剂
RT-PCR试剂(见附录B）、IC-RT-PCR试剂(见附录C)和实时荧光RT-PCR试剂(见附录D)。5病霉检测
抽样与制样方法按照SN/T1146规定的方法执行。采用RT-PCR(见附录B)、IC-RT-PCR(见附录C)和实时荧光RT-PCR(见附录D)进行病毒检测。6结果判定
样品经RT-PCR、IC-RT-PCR和实时荧光RT-PCR三种方法之一检测为阴性时，证明样品不携带烟草环斑病毒。
样品经RT-PCR和IC-RT-PCR检测为阳性，需要进行序列测定，如果序列测定结果证实与所检测1
SN/T1146.2—2009
的烟草环斑病毒病毒一致，可判定样品携带烟草环斑病毒。样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，也可判定样品携带烟草环斑病毒。7样品保存和结果记录
7.1样品保存
经检验确定携带烟草环斑病毒的样品，应在适合的条件下妥善保存。如种子保存在干燥条件下，其他情况的取实验样品保存在20℃冰箱中，有条件的保存在一80℃冰箱中更好。做好登记和标记工作。
7.2结果记录
记录包括：样品来源，种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。RTPCR和IC-RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析，实时荧光RT-PCR应有扩增曲线图片。2
A.1名称
中文名：烟草环斑病毒
英文名：Tobacco ringspotvirus缩写：TRSV
附录A
（资料性附录）
烟草环斑病毒简介
分类地位：豇豆花叶病毒科（Cornoviridae），线虫传多面体病毒属（Nepouirus）。A.2寄主范围
SN/T1146.2—2009
自然侵染寄主有豆类、瓜类、薯类、花卉和果树等。常见寄主范围很广，可侵染54科246种植物，的有大豆、马铃薯、甘薯、烟草、西瓜、黄瓜、甜派、西葫芦、胡萝下、莴苣、莱豆、豇豆、茄子、菠菜、香石竹、唐苔蒲、百合、水仙花、鸢尾、天竺葵、李属、苹果、葡萄、甜樱桃、越桔、白蜡树等。A.3为害症状
TRSV影响寄主植物的整个生长期。一因寄主不同可产生不同的症状，造成叶片系统褪绿斑，坏死环斑，茎坏死条纹，危害严重时导致植株矮化，结果少和果实变小。有的症状在后期可恢复，无症带毒。A.4分布地区
欧洲：丹麦、前苏联、波兰、捷克、匈牙利、德国、奥地利、瑞生、荷兰、比利时、英国、爱尔兰、法国、西班牙、葡葡牙、意大利前南斯拉夫、罗马尼亚、保加利亚、希腊、土耳其非洲：摩洛哥、尼日利亚、扎伊东、马拉维美洲：美国、加拿大、古巴、多米尼加、巴西亚洲：日本、印度尼西亚、伊朗、中国大洋洲：澳大利亚、新西兰
A.5传播方式
A.5.1介体传播
传毒介体主要是美洲剑线虫（Xiphinemaamericanum），另外烟蓟马（Thripstabaci），叶螨（Tet-ranychussp.），墨西哥黑蝗（Melanophusmericanes）、赤腔黑蝗（Melanophusfemurrubrum）、烟草跳甲（Epitrixhirtipennis）和桃蚜（Myzuspersicae）也可以传毒。A.5.2种子传毒
种传寄主很多，如大豆、甜瓜、莴苣、豇豆、千日红、马铃薯和天竺葵等都可种传，其中大豆种传率高达40%~100%，甜瓜3%~7%，紅豆82%。A.5.3无性繁殖材料传毒
通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播。3
SN/T1146.2-—2009
A.6粒体形态
病毒粒体为等轴多面体球状颗粒，直径约28nm。A.7
基因组
病毒基因组含两条ssRNA。RNA-1长7.514kb：RNA-2长3.929kb，外壳蛋白基因1.548kb。B.1试剂
附录B
（规范性附录）
RT-PCR方法
B.1.1核酸提取试剂为商品化Trizol试剂。B.1.250XTAE
冰乙酸
0.5mol/L.EDTA100ml
用时加蒸馏水稀释至1×TAE。
B.2实验步骤
B.2.1引物设计
根据已报道的TRSVCP基因的保守序列设计2对特异性引物：第一对序列为：TRSVF-1:5\-GATGCAAAGAAAGGAAAGC-3TRSVR-1:5\-AGATATGGACAACATGGAG-3扩增片段大小为576bp。
第二对序列为：TRSVF-2：5-ATGTGTGCTGTGACAGTTG-3*TRSVR-2:5*-TTAAAACAAAGTGGCGGAGCG-3*扩增片段大小为1548bp(CP基因全长）。B.2.2RNA提取
SN/T1146.2-2009
B.2.2.1取0.1g样品，液氢研细，加人1mLTrizol混句，倒人1.5mL离心管中。B.2.2.2加人0.2mL三氯甲烷，猛烈震荡15s，4℃11000z/min离心10min，小心吸取上层无色水相到新离心管中
B.2.2.3加人等体积异丙醇，混勾，-20℃静置10min，4℃12000r/min离心15min，保留沉淀。B.2.2.4加人1mL75%冷乙醇，悉浮沉淀，4℃8000r/min离心10min，干燥沉淀。B.2.2.5加入30μLDEPC-H2O，溶解沉淀（必要时，55℃～60℃水浴10min，加速溶解），存于一80℃备用。
B.2.3反转录
利用提取的RNA在PCR管中进行反转录。反转录体系20μL,其中2μL模板RNA，1μL反向引物（20μmol/L)，4μl.5×AMV酶buffer2μLdNTP(10mmol/L），1μLAMV反转录酶（5U/μL）1μLRNA酶抑制剂(40U/μL).9μLDEPC-H2O。42C反应1h。B.2.4PCR扩增
PCR反应体系见表B.1，每个样品设2个平行处理。检测时以含烟草环斑病毒材料的cDNA或含有烟草环斑病毒目标片断的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。PCR反应条件设置如下：
第对引物：94℃4min94℃45s.48℃45s.72℃45s30个循环：72℃10min延伸第二对引物：94℃4min94℃45s，52℃45s.72℃90s30个循环：72℃10min延伸。注：为了提检测TRSV的灵敏度，可以利用两对引物进行巢式RT-PCR，首先用长片段引物第一轮扩增15个循环后，取PCR产物稀释500倍～1000倍，用短片段引物进行第二轮扩增30个循环。5
SN/T1146.2--2009
PCR缓冲液
氯化镁（MgCl2）
正向引物
反向引物
补水至
B.2.5琼脂糖凝胶电泳检测
B.2.5.1制备凝胶
表B.1PCR反应体系
贮备液浓度
25mmol/L
10mmol/L
20μmol/L
20μmol/L
5U/μL
终浓度
2.0mmol/L
0.4mmol/E.
0.2μmol/1.
0.2μmol/L.
1.5U/1est
用1×TAE配制1.5%琼脂糖凝胶，加热溶化后冷却至55℃左右B.2.5.2加溴化乙锭
加样量/uL
将溴化乙锭（EB)加人到配制好的凝胶中，EB终浓度为0.5μg/mL。将凝胶倒人凝胶槽中，插上样品梳子。冷却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加入1×TAE缓冲液要没过凝胶表面约1mm。B.2.5.3加样
将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔.同时设计PCR的阴性对照和阳性对照，并加入分子量标准物（Marker）。
B.2.5.4电泳
接通电源，以3V/cm~5V/cm电场强度进行电泳，0.5h后观察结果。B.2.6结果观察
电泳结束后，将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察。记录结果。B.3结果判断
通过观察，在576bp和1548bp两个位点正，阳性对照应出现相应条带，阴性和空白对照不会出现相应条带，此时如果检测样品在上述两个位点上呈现出条带应被判为阳性，否则应被判为阴性。如果是阳性可通过测序的方式进一步确认。如果,PCR产物序列与烟草环斑病毒的序列同源，则可判定样品为烟草环斑病毒阳性，若序列不同源，则可判定样品为烟草环斑病毒阴性。c.1试剂
C.1.1TRSV抗体
C.1.2包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（Na2CO）
碳酸氢钠（NaHCO,）
叠氰钠(NaN）
附录C
（规范性附录）
IC-RT-PCR方法
溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容至1L。C.1.3PBST缓冲液(pH7.4)
氯化钠（NaCI)）
磷酸二氢钾（KH2PO）
磷酸氢二钠（Na2HPO.）
氯化钾（KCI)）
叠氮钠（NaNs）
吐温20(Tween-20)
溶于蒸馏水中，并用蒸馏水定容室1LC.T.4样品抽提缓冲液（pH7.4）亚硫酸钠（Na2SO）
聚乙烯基吡略烷酮(PVP)
溶于PBST中，并用PBST定容至让C.2实验步骤
引物设计
见附录B。
C.2.2抗体吸附
SN/T1146.2—2009
将TRSV抗体用包被缓冲液作适量稀释，吸取200μI.包被PCR管，37℃，孵育2h；用PBST洗3次，取样品50mg，加人样品抽提缓冲液进行研磨，吸取100μL包被PCR管，4℃过夜（或37℃，孵育2h）：PBST洗3次，DEPC-H2O洗1次，短暂离心后吸去管底余液。C.2.3反转录
直接在吸附了病毒的PCR管中进行反转录。反转录体系总体积20μL，其中1μl。反向引物（20μmol/L），4L5×AMV酶buffer2μLdNTP(1ommol/L）11μLDEPC-H2O.稍离心混匀后置85℃变性5min，迅速置冰上2min~3min，然后加人1μLAMV反转录酶（5U/μL），lμLRNA酶抑制剂（40U/μL），42℃反应1h。C.2.4PCR扩增和琼脂糖凝胶检测操作方法见附录B。
SN/T1146.2—2009
结果判断
通过观察，在576bp和1548bp两个位点上，阳性对照应出现相应条带，阴性和空白对照不会出现相应条带，此时如果检测样品在上述两个位点上呈现出条带应被判为阳性，否则应被判为阴性。如果是阳性可通过测序的方式进一步确认。如果PCR产物序列与烟草环斑病毒的序列同源，则可判定样品为烟草环斑病毒阳性，若序列不同源，则可判定样品为烟草环斑病毒阴性。8
D.1实验步骤
D.1.1引物设计
附录D
（规范性附录）
实时荧光RT-PCR方法
SN/T1146.2—2009
根据国际基因库中已公布的TRSVCP基因的保守序列，设计了1对特异性引物和探针，引物序列：bzxZ.net
TRSV-5P:5'-TCCATGTTGTCCATATCTTA-3TRSV-3P.5-AGAAGAAACACTCTTGACACT-3探针序列：
5-Fam-CCGCTTATAGTGCCAGACCA-Tamra-3D.1.2RNA提取及反转录
操作方法见附录B。
D.1.3实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表D.1，每个样品设2个平行处理。并设阳性对照，阴性对照和空白对照，以含有烟草环斑病毒的cDNA为阳性对照；以健康植物材料或线虫传多面体病毒属其他病毒的cDNA作为阴性对照；以水代替DNA模板作为空白对照。每种对照各做2个平行管。表D.1实时荧光PCR反应体系
PCR缓冲液
氧化镁（MgCla）
正向引物
反向引物
Taq酶
补水至
D.1.4实时荧光PCR反应参数
贮备液浓度
25mmol/L
10mmol/L
20pmol/L
20pmol/L
5U/μL
20pmol/L
终浓度
3.0mmol/L
0.2mmol/L
0.24μmol/L
0.24μmol/L
2U/test
0.4μmal/L
加样量/μl
反应条件：预变性94℃5min，94℃15$，55℃405.72℃40s，共40个循环。点击运行，进行PCR反应，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出△Rn（荧光信号增加值）与循环数之间关系的图像。
D.2结果判定
待测样品的Ct值为40时，则判定未检测到烟草环斑病毒。待测样品的Ct值小于或等于35时，则判定检测到烟草环斑病毒。待测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新进行测试，如果重新测试的Ct值为40时，则判定未检测到烟草环斑病毒。如果重新测试的Ct值小于40而大于35时，则判定检测到烟草环斑病毒。9
SN/T1146.2-2009
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
烟草环斑病毒分子生物学检测方法SN/T1146.2—2009
中国标雁出版社出版
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中国标准出版社案皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16印张1字数16千字2009年12月第一版 2009年12月第一次印刷印数1—2000
书号：155066·2-20146定价18.00元0
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