SN/T 1145-2014
基本信息
标准号： SN/T 1145-2014
中文名称：苜蓿黄萎病菌检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1145-2014.Detection and identification of Verticillium albo-atrum Reinke & Berthold.
1范围
SN/T 1145规定了苜蓿黄菱病菌的检疫鉴定方法。
SN/T 1145适用于苜蓿黄萎病菌的寄主携带苜蓿黄萎病菌的检疫鉴定。
2定义和术语
下列术语和定义适用于本文件。
2.1轮状分生孢子梗verticillate conidiophore
轮枝菌的分生孢子梗类型,在直立的分生孢子梗每节基部膨大处轮生若干个小梗,可以有1轮~5轮。
2.2厚垣孢子chlamydospore
由菌丝个别细胞膨大形成,具有厚壁和浓缩的原生质，可抵抗高温、低温、干旱、营养短缺等不良环境条件的一种休眠孢子。
2.3微菌核microsclerotium
暗褐色或黑色近球形坚硬的休眠体，由单一菌丝体不断芽殖聚集而来。
2.4休眠菌丝体resting mycelium
休眠体,暗褐色或黑色,分隔规则，隔膜间膨大,星念珠状。
3基本信息
中文名:苜蓿黄萎病菌
学名:Verticillium albo-atrumn Reinke & Berthold
分类地位:真菌界(Fungi)，无性型真菌(Anamorphic fungi), 丝孢纲( Hyphomycetes),丝孢目(Hyphomycetales)，丛梗孢科(Moniliaceae) ,轮枝孢属(Vericillium)。
传播途径:苜蓿黄萎病菌主要由种子传播,也可经土壤、病残体、风.灌溉水和昆虫传病。
近似种:大丽轮枝菌Vericilium dahliae、变黑轮枝菌V.nigrescens、云状轮枝菌V.nubilum、三体轮枝菌V.tricorpus。
1范围
SN/T 1145规定了苜蓿黄菱病菌的检疫鉴定方法。
SN/T 1145适用于苜蓿黄萎病菌的寄主携带苜蓿黄萎病菌的检疫鉴定。
2定义和术语
下列术语和定义适用于本文件。
2.1轮状分生孢子梗verticillate conidiophore
轮枝菌的分生孢子梗类型,在直立的分生孢子梗每节基部膨大处轮生若干个小梗,可以有1轮~5轮。
2.2厚垣孢子chlamydospore
由菌丝个别细胞膨大形成,具有厚壁和浓缩的原生质，可抵抗高温、低温、干旱、营养短缺等不良环境条件的一种休眠孢子。
2.3微菌核microsclerotium
暗褐色或黑色近球形坚硬的休眠体，由单一菌丝体不断芽殖聚集而来。
2.4休眠菌丝体resting mycelium
休眠体,暗褐色或黑色,分隔规则，隔膜间膨大,星念珠状。
3基本信息
中文名:苜蓿黄萎病菌
学名:Verticillium albo-atrumn Reinke & Berthold
分类地位:真菌界(Fungi)，无性型真菌(Anamorphic fungi), 丝孢纲( Hyphomycetes),丝孢目(Hyphomycetales)，丛梗孢科(Moniliaceae) ,轮枝孢属(Vericillium)。
传播途径:苜蓿黄萎病菌主要由种子传播,也可经土壤、病残体、风.灌溉水和昆虫传病。
近似种:大丽轮枝菌Vericilium dahliae、变黑轮枝菌V.nigrescens、云状轮枝菌V.nubilum、三体轮枝菌V.tricorpus。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1145—2014
代替SN/T1145-2002
首著黄萎病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Verticillium albo-atrum Reinke & Berthold2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1145—2014
本标准代替SN/T1145-2002《植物检疫首黄萎病菌检疫鉴定方法》，与SN/T1145—2002相比，除编辑性修改外主要技术变化如下一增加了分子生物学及蛋白质谱检测内容；增加了附录C、附录D、附录E、附录F。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院。
本标准起草人：章桂明、王颖、程颖慧、汪莹、王伍、吴品珊、杜洪忠。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T1145-2002。
1范围
首著黄萎病菌检疫鉴定方法
本标准规定了首黄萎病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于首黄萎病菌的寄主携带首黄萎病菌的检疫鉴定。2定义和术语bZxz.net
下列术语和定义适用于本文件。2.1
轮状分生孢子梗verticillate conidiophoreSN/T1145—2014
轮枝菌的分生孢子梗类型，在直立的分生孢子梗每节基部膨大处轮生若干个小梗，可以有1轮～5轮。
厚垣孢子chlamydospore
由菌丝个别细胞膨大形成，具有厚壁和浓缩的原生质可抵抗高温、低温、干早、营养短缺等不良环境条件的一种休眠孢子。
微菌核microsclerotium
暗褐色或黑色近球形坚硬的休眠体，由单一一菌丝体不断芽殖聚集而来。
resting mycelium
休眠菌丝体
休眠体，暗褐色或黑色，分隔规则，隔膜间膨大，呈念珠状3基本信息
中文名：首黄萎病菌
学名：Verticillium albo-atrumReinke&Berthold分类地位：真菌界（Fungi），无性型真菌（Anamorphicfungi），丝孢纲（Hyphomycetes），丝孢目（Hyphomycetales），丛梗孢科（Moniliaceae），轮枝孢属（Verticillium）。传播途径：首黄萎病菌主要由种子传播，也可经土壤、病残体、风、灌溉水和昆虫传病。近似种：大丽轮枝菌Verticilliumdahliae、变黑轮枝菌V.nigrescens、云状轮枝菌V.nubilum、三体轮枝菌V.tricorpus。
4方法原理
该病菌的为害症状、形态学特征、分子生物学特征及蛋白质谱特征是鉴定该病菌的依据。1
SN/T1145—2014
5仪器及用具
5.1仪器
烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、光照培养箱、天平（感量1/100g、1/10000g）、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、台式离心机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、真空抽干仪、冰箱、超净工作台、普通PCR仪、凝胶成像仪、实时荧光PCR仪、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪、超声波振荡仪。
5.2用具
培养皿、载玻片、盖玻片、三角瓶、试管、烧杯、手术刀、手术剪、镊子、研钵、量筒、吸管、酒精灯、滤纸、微量移液器（0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）、PCR反应管（0.2mL，0.5mL）、Tip头（0.1μL10μL，5μL～200μL，100μL～1000μL）、质谱分析样品靶。6试剂和培养基
6.1试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。2%~3%次氯酸钠溶液、无水乙醇、75%乙醇、无菌去离子水、2，4-D钠盐、CTAB提取缓冲液、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、RNaseA、液氮、PCR试剂（包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、MgClz）、DNAMarker、溴化乙锭、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、TaqManMasterMix、特异性引物和探针、乙腈、三氟乙酸（TFA）、甲醇、Q-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）、质谱校正标准液（肽标准品及蛋白标准品）。
6.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、梅干煎汁酵母琼脂培养基（PLYA)、马铃薯葡萄糖液体培养基，参见附录A。
7抽样与现场检查
7.1首种子的抽样
按以下标准抽样：1.5kg~10kg取1份；11kg~100kg取2份；101kg~500kg取3份；501kg~1000kg取4份。每份样品为1.5kg。1.5kg以下全部取样。7.2首种苗、植株的抽样
按以下标准抽样：50株以下取1份；51株～200株取2份，201株～1000株取3份；1001株～5000株取4份：5001株以上每增加5000株增取1份，不足5000株的按5000株计。每份样品5株。7.3
现场检查
首种子抽样时注意检查种子中有无可疑带病种子、首残体；植株抽样时注意检查有无可疑病株。如有可疑病种、病株应将其挑出来，送实验室作进一步检验鉴定。2
8制样
SN/T1145—2014
按7.1的要求抽取的每份样品应充分混勾，制成平均样品，从每份平均样品中取25g做检验样品。检疫鉴定
9.1形态学方法
9.1.1种子保湿培养
吸水纸培养血的准备
用0.2%的2.4-D钠盐溶液浸渍无菌吸水纸（滤纸），再将吸水纸铺在9cm直径的已灭菌的培养Ⅲ底部，每皿铺3层。
9.1.1.2样品种子的放置
将抽取的检验样品不经表面消毒直接放置于培养皿中，每Ⅲ均勾放置25粒种子。9.1.1.3培养
将培养Ⅲ置于21℃～23℃条件下培养，每昼夜用黑光灯照明12h，培养10d。9.1.1.4镜检
10d后取出培养皿，用体式显微镜逐粒检查种子，根据轮枝状分生孢子梗和分生孢子的着生情况，检出带菌种子，见附录B。
9.1.1.5选择性培养
从带菌种子上挑取孢子接种到梅干煎汁醇酵母琼脂培养基（PLYA)和马铃薯琼脂培养基（PDA）中进一步培养，20d后检查培养结果。9.1.1.6致病性测定
9.1.1.6.1接种方法
采用浸根法接种，即从培养2周的病菌培养基上刮下分生孢子配制成100个孢子/mL的悬浮液，取在无病条件下栽培4周龄长出3片～4片真叶的首猎幼苗，清洗掉根部土壤并用刀片切去主根根尖1cm～2cm后，立即在孢子悬浮液中浸根5min，然后裁人营养钵中，在22℃～25℃和每天光照14h～15h下培育。
9.1.1.6.2症状检查
接种1周后，植株开始表现症状，进行症状检查。9.1.1.6.3病原菌再分离及鉴定
取小块病健交接处组织，用2%～3%次氯酸钠溶液消毒3min，用无菌水冲洗3次，置于PDA培养基上22℃～24℃进行分离培养，10d后观察菌落性状和病原菌特征。SN/T1145—2014
9.1.2种苗、植株的检验
症状检查
用肉眼查看种苗、植株样品，根据首藉黄萎病的症状挑选出怀疑发病的植株，带入实验室作进一步检验。
保湿培养
取待检样品的茎或叶柄切成1cm长的小段，用自来水冲洗掉表面的泥土杂物后，用含2%～3%次氯酸钠溶液消毒1min~2min，无菌水冲洗3次后，用灭菌解剖刀横切成1mm~4mm的小片，并放置在湿Ⅲ内滤纸上，每Ⅲ5片～10片，湿血封闭在塑料袋中22℃下培养9.1.2.3镜检
用实体显微镜观察有无产生病原菌子实体，观察分生孢子梗的基部颜色以及是否形成休眠结构。9.1.2.4分离培养和致病性测定
按照9.1.1.5和9.1.1.6所述步骤进行分离培养和致病性测定。9.2分子生物学鉴定
9.2.1DNA提取
病菌基因组DNA提取方法见附录 C9.2.2PCR检测
定性PCR检测和实时荧光PCR检测方法分别见附录D和附录E9.3蛋白质谱鉴定
9.3.1样品制备
制备用于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析（MALDITOFMS）的样品的方法见附录F中F.l。
9.3.2质谱检测
MALDITOFMS检测方法见F.2。
10鉴定特征
10.1症状
接种7d后，植株开始发病，中叶自下而上变黄和萎菱焉。下部小叶多呈斑块状黄色，上部黄化中叶叶脉仍可保持绿色，严重时叶片枯死脱落。重病植株矮化，茎秆细弱，倒伏，整株枯萎死亡。10.2病原菌形态特征
10.2.1PDA上的培养性状
病原菌在PDA培养基上生长很快，最初形成的菌落无色，2周～3周后因产生了休眠菌丝而变成4
SN/T1145--2014
灰褐色至黑褐色；不芽殖形成类似微菌核状的结构，不产生厚垣孢子和微菌核产生的分生孢子梗多，直立，无色，分生孢子梗基部暗色、膨大，或无色、无明显膨大，上生有1层～5层瓶状小梗，每层的瓶体小梗数1个～5个，可轮生、对生或互生，常见分生孢子梗二次分枝，瓶状小梗大小为[20μm～30μm（50um）×（1.4μm~3.2μm），分生孢子着生于瓶状小梗的端部，圆形或圆桶形，透明，多为单胞，少数有一个隔，大小为[3.5μm～10.5μm（12.5μm）×（2μm～4μm）。见附录B。病菌生长适温为20℃~23℃。
10.2.2PLYA上的培养性状
病原菌在PLYA上培养时，在24℃～26℃条件下，菌落呈辐射状扩展，培养20d可产生休眠菌丝体。
10.3首黄菱病菌与其近似种的形态学区别首猎黄菱病的近似种主要大丽轮枝菌V.dahliae、变黑轮枝菌V.nigrescens、云状轮枝菌V.nubilum、三体轮枝菌V.tricorpus等，首黄娄病菌与其近似种的形态学的主要区别为：首黄萎病菌产生黑色的休眠菌丝，不产生微菌核和厚垣孢子。休眠菌丝多孢、隔膜间隔膨大，呈节结状，菌丝直径2.8μm~6.7μm。一V.dahliae产生黑色微菌核，葡萄状或念珠状，由多数球形的膨大细胞构成。微菌核大小为：(15μm~178μm）x（18.9gm~58μm）。—V.nigrescens产生黑褐色厚垣孢子，球形、近球形，大多单生，少数间生，直径5.3μm~8.1μm。-V.nubilum产生黑褐色厚垣孢子，单生或串生，直径8.4pμm~17.5μm。V.tricorpus产生休眠菌丝、微菌核或厚垣孢子。休眠菌丝黑褐色，各细胞膨大，呈念珠状，直径3.2μm～7.1μm。微菌核在休眠菌丝上产生，由膨大细胞构成，长形至近球形，直径34 μm~80 μm.
10.4PCR特异性
在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，首黄萎病菌的定性PCR特异性扩增产物片段大小为330bp，实时荧光PCRCt值小于或等于36。10.5质谱检测
将获得的目标物的质谱分析图谱与已有的首猎黄萎病菌的标准图谱进行比对，通过Biotype软件计算得到相应的匹配分值。
11结果判定
11.1形态学结果
如果分离物的形态特征与10.2描述的病原菌形态特征相吻合，通过致病性测定所获得的症状特征也与10.1所描述的症状相吻合，再分离获得的培养物的形态特征也仍与10.2描述的病原菌形态特征相吻合，可确定为首黄萎病菌。
11.2分子生物学检测结果
11.2.1定性PCR检测
在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带、阳性对照产生约330bp的预期大小条带的情5
SN/T1145-2014
况下：
如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带，则为阳性；如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带，则为阴性。11.2.2实时荧光PCR检测
在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则：检测Ct值小于或等于36，判定为首猎黄萎病菌；一一检测Ct值大于或等于40，判定为非首黄萎病菌；检测Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR，再次扩增后，如Ct值小于或等于36或者Ct值大于或等于40，判定同上：如果检测Ct值仍在36～40之间，则应按照形态学方法进行鉴定。
11.3蛋白质谱检测
将获得的质谱分析图谱与已有的首黄菱病菌的标准图谱进行比对，通过Biotype软件计算得到匹配分值，分值的范围为2.3～3.0的，判定为首着黄萎病菌；如果分值的范围为2.0～2.3的，则应按照形态学方法进行鉴定；分值2.0以下，判定为非首黄萎病菌。样品保存与处理
保存样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月。如发现首黄菱病菌，该样品应保存1年，以备复验。保存期满后，应经灭菌处理。13
菌种保存与处理
分离到的首猎黄萎病菌菌种，转人PDA斜面培养基上，置于5℃黑暗条件下保存，并定期转管，标注分离物来源、寄主、分离时间、鉴定人。实验记录保存
妥善保存检验报告包括症状、病菌等图文资料。检验报告应注明检验日期、方法、结果等，并有检验人签名。
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T0683—2014
代替SN0683--1997
出口粮谷中三环唑残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法
Determination of tricyclazole in cereals for export-HPLC-MS/MSmethod
2014-01-13发布
中华人民共和国
玉家质量监督检验检疫总局
2014-08-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标
出口粮谷中三环唑残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法
SN/T0683—2014
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张1.25
字数32千字
2014年12月第一版
2014年12月第一次印刷
印数11300
书号：155066·2-28081
定价21.00元
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代替SN/T1145-2002
首著黄萎病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Verticillium albo-atrum Reinke & Berthold2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1145—2014
本标准代替SN/T1145-2002《植物检疫首黄萎病菌检疫鉴定方法》，与SN/T1145—2002相比，除编辑性修改外主要技术变化如下一增加了分子生物学及蛋白质谱检测内容；增加了附录C、附录D、附录E、附录F。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院。
本标准起草人：章桂明、王颖、程颖慧、汪莹、王伍、吴品珊、杜洪忠。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T1145-2002。
1范围
首著黄萎病菌检疫鉴定方法
本标准规定了首黄萎病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于首黄萎病菌的寄主携带首黄萎病菌的检疫鉴定。2定义和术语bZxz.net
下列术语和定义适用于本文件。2.1
轮状分生孢子梗verticillate conidiophoreSN/T1145—2014
轮枝菌的分生孢子梗类型，在直立的分生孢子梗每节基部膨大处轮生若干个小梗，可以有1轮～5轮。
厚垣孢子chlamydospore
由菌丝个别细胞膨大形成，具有厚壁和浓缩的原生质可抵抗高温、低温、干早、营养短缺等不良环境条件的一种休眠孢子。
微菌核microsclerotium
暗褐色或黑色近球形坚硬的休眠体，由单一一菌丝体不断芽殖聚集而来。
resting mycelium
休眠菌丝体
休眠体，暗褐色或黑色，分隔规则，隔膜间膨大，呈念珠状3基本信息
中文名：首黄萎病菌
学名：Verticillium albo-atrumReinke&Berthold分类地位：真菌界（Fungi），无性型真菌（Anamorphicfungi），丝孢纲（Hyphomycetes），丝孢目（Hyphomycetales），丛梗孢科（Moniliaceae），轮枝孢属（Verticillium）。传播途径：首黄萎病菌主要由种子传播，也可经土壤、病残体、风、灌溉水和昆虫传病。近似种：大丽轮枝菌Verticilliumdahliae、变黑轮枝菌V.nigrescens、云状轮枝菌V.nubilum、三体轮枝菌V.tricorpus。
4方法原理
该病菌的为害症状、形态学特征、分子生物学特征及蛋白质谱特征是鉴定该病菌的依据。1
SN/T1145—2014
5仪器及用具
5.1仪器
烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、光照培养箱、天平（感量1/100g、1/10000g）、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、台式离心机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、真空抽干仪、冰箱、超净工作台、普通PCR仪、凝胶成像仪、实时荧光PCR仪、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪、超声波振荡仪。
5.2用具
培养皿、载玻片、盖玻片、三角瓶、试管、烧杯、手术刀、手术剪、镊子、研钵、量筒、吸管、酒精灯、滤纸、微量移液器（0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）、PCR反应管（0.2mL，0.5mL）、Tip头（0.1μL10μL，5μL～200μL，100μL～1000μL）、质谱分析样品靶。6试剂和培养基
6.1试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。2%~3%次氯酸钠溶液、无水乙醇、75%乙醇、无菌去离子水、2，4-D钠盐、CTAB提取缓冲液、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、RNaseA、液氮、PCR试剂（包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、MgClz）、DNAMarker、溴化乙锭、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、TaqManMasterMix、特异性引物和探针、乙腈、三氟乙酸（TFA）、甲醇、Q-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）、质谱校正标准液（肽标准品及蛋白标准品）。
6.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、梅干煎汁酵母琼脂培养基（PLYA)、马铃薯葡萄糖液体培养基，参见附录A。
7抽样与现场检查
7.1首种子的抽样
按以下标准抽样：1.5kg~10kg取1份；11kg~100kg取2份；101kg~500kg取3份；501kg~1000kg取4份。每份样品为1.5kg。1.5kg以下全部取样。7.2首种苗、植株的抽样
按以下标准抽样：50株以下取1份；51株～200株取2份，201株～1000株取3份；1001株～5000株取4份：5001株以上每增加5000株增取1份，不足5000株的按5000株计。每份样品5株。7.3
现场检查
首种子抽样时注意检查种子中有无可疑带病种子、首残体；植株抽样时注意检查有无可疑病株。如有可疑病种、病株应将其挑出来，送实验室作进一步检验鉴定。2
8制样
SN/T1145—2014
按7.1的要求抽取的每份样品应充分混勾，制成平均样品，从每份平均样品中取25g做检验样品。检疫鉴定
9.1形态学方法
9.1.1种子保湿培养
吸水纸培养血的准备
用0.2%的2.4-D钠盐溶液浸渍无菌吸水纸（滤纸），再将吸水纸铺在9cm直径的已灭菌的培养Ⅲ底部，每皿铺3层。
9.1.1.2样品种子的放置
将抽取的检验样品不经表面消毒直接放置于培养皿中，每Ⅲ均勾放置25粒种子。9.1.1.3培养
将培养Ⅲ置于21℃～23℃条件下培养，每昼夜用黑光灯照明12h，培养10d。9.1.1.4镜检
10d后取出培养皿，用体式显微镜逐粒检查种子，根据轮枝状分生孢子梗和分生孢子的着生情况，检出带菌种子，见附录B。
9.1.1.5选择性培养
从带菌种子上挑取孢子接种到梅干煎汁醇酵母琼脂培养基（PLYA)和马铃薯琼脂培养基（PDA）中进一步培养，20d后检查培养结果。9.1.1.6致病性测定
9.1.1.6.1接种方法
采用浸根法接种，即从培养2周的病菌培养基上刮下分生孢子配制成100个孢子/mL的悬浮液，取在无病条件下栽培4周龄长出3片～4片真叶的首猎幼苗，清洗掉根部土壤并用刀片切去主根根尖1cm～2cm后，立即在孢子悬浮液中浸根5min，然后裁人营养钵中，在22℃～25℃和每天光照14h～15h下培育。
9.1.1.6.2症状检查
接种1周后，植株开始表现症状，进行症状检查。9.1.1.6.3病原菌再分离及鉴定
取小块病健交接处组织，用2%～3%次氯酸钠溶液消毒3min，用无菌水冲洗3次，置于PDA培养基上22℃～24℃进行分离培养，10d后观察菌落性状和病原菌特征。SN/T1145—2014
9.1.2种苗、植株的检验
症状检查
用肉眼查看种苗、植株样品，根据首藉黄萎病的症状挑选出怀疑发病的植株，带入实验室作进一步检验。
保湿培养
取待检样品的茎或叶柄切成1cm长的小段，用自来水冲洗掉表面的泥土杂物后，用含2%～3%次氯酸钠溶液消毒1min~2min，无菌水冲洗3次后，用灭菌解剖刀横切成1mm~4mm的小片，并放置在湿Ⅲ内滤纸上，每Ⅲ5片～10片，湿血封闭在塑料袋中22℃下培养9.1.2.3镜检
用实体显微镜观察有无产生病原菌子实体，观察分生孢子梗的基部颜色以及是否形成休眠结构。9.1.2.4分离培养和致病性测定
按照9.1.1.5和9.1.1.6所述步骤进行分离培养和致病性测定。9.2分子生物学鉴定
9.2.1DNA提取
病菌基因组DNA提取方法见附录 C9.2.2PCR检测
定性PCR检测和实时荧光PCR检测方法分别见附录D和附录E9.3蛋白质谱鉴定
9.3.1样品制备
制备用于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析（MALDITOFMS）的样品的方法见附录F中F.l。
9.3.2质谱检测
MALDITOFMS检测方法见F.2。
10鉴定特征
10.1症状
接种7d后，植株开始发病，中叶自下而上变黄和萎菱焉。下部小叶多呈斑块状黄色，上部黄化中叶叶脉仍可保持绿色，严重时叶片枯死脱落。重病植株矮化，茎秆细弱，倒伏，整株枯萎死亡。10.2病原菌形态特征
10.2.1PDA上的培养性状
病原菌在PDA培养基上生长很快，最初形成的菌落无色，2周～3周后因产生了休眠菌丝而变成4
SN/T1145--2014
灰褐色至黑褐色；不芽殖形成类似微菌核状的结构，不产生厚垣孢子和微菌核产生的分生孢子梗多，直立，无色，分生孢子梗基部暗色、膨大，或无色、无明显膨大，上生有1层～5层瓶状小梗，每层的瓶体小梗数1个～5个，可轮生、对生或互生，常见分生孢子梗二次分枝，瓶状小梗大小为[20μm～30μm（50um）×（1.4μm~3.2μm），分生孢子着生于瓶状小梗的端部，圆形或圆桶形，透明，多为单胞，少数有一个隔，大小为[3.5μm～10.5μm（12.5μm）×（2μm～4μm）。见附录B。病菌生长适温为20℃~23℃。
10.2.2PLYA上的培养性状
病原菌在PLYA上培养时，在24℃～26℃条件下，菌落呈辐射状扩展，培养20d可产生休眠菌丝体。
10.3首黄菱病菌与其近似种的形态学区别首猎黄菱病的近似种主要大丽轮枝菌V.dahliae、变黑轮枝菌V.nigrescens、云状轮枝菌V.nubilum、三体轮枝菌V.tricorpus等，首黄娄病菌与其近似种的形态学的主要区别为：首黄萎病菌产生黑色的休眠菌丝，不产生微菌核和厚垣孢子。休眠菌丝多孢、隔膜间隔膨大，呈节结状，菌丝直径2.8μm~6.7μm。一V.dahliae产生黑色微菌核，葡萄状或念珠状，由多数球形的膨大细胞构成。微菌核大小为：(15μm~178μm）x（18.9gm~58μm）。—V.nigrescens产生黑褐色厚垣孢子，球形、近球形，大多单生，少数间生，直径5.3μm~8.1μm。-V.nubilum产生黑褐色厚垣孢子，单生或串生，直径8.4pμm~17.5μm。V.tricorpus产生休眠菌丝、微菌核或厚垣孢子。休眠菌丝黑褐色，各细胞膨大，呈念珠状，直径3.2μm～7.1μm。微菌核在休眠菌丝上产生，由膨大细胞构成，长形至近球形，直径34 μm~80 μm.
10.4PCR特异性
在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，首黄萎病菌的定性PCR特异性扩增产物片段大小为330bp，实时荧光PCRCt值小于或等于36。10.5质谱检测
将获得的目标物的质谱分析图谱与已有的首猎黄萎病菌的标准图谱进行比对，通过Biotype软件计算得到相应的匹配分值。
11结果判定
11.1形态学结果
如果分离物的形态特征与10.2描述的病原菌形态特征相吻合，通过致病性测定所获得的症状特征也与10.1所描述的症状相吻合，再分离获得的培养物的形态特征也仍与10.2描述的病原菌形态特征相吻合，可确定为首黄萎病菌。
11.2分子生物学检测结果
11.2.1定性PCR检测
在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带、阳性对照产生约330bp的预期大小条带的情5
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况下：
如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带，则为阳性；如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带，则为阴性。11.2.2实时荧光PCR检测
在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则：检测Ct值小于或等于36，判定为首猎黄萎病菌；一一检测Ct值大于或等于40，判定为非首黄萎病菌；检测Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR，再次扩增后，如Ct值小于或等于36或者Ct值大于或等于40，判定同上：如果检测Ct值仍在36～40之间，则应按照形态学方法进行鉴定。
11.3蛋白质谱检测
将获得的质谱分析图谱与已有的首黄菱病菌的标准图谱进行比对，通过Biotype软件计算得到匹配分值，分值的范围为2.3～3.0的，判定为首着黄萎病菌；如果分值的范围为2.0～2.3的，则应按照形态学方法进行鉴定；分值2.0以下，判定为非首黄萎病菌。样品保存与处理
保存样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月。如发现首黄菱病菌，该样品应保存1年，以备复验。保存期满后，应经灭菌处理。13
菌种保存与处理
分离到的首猎黄萎病菌菌种，转人PDA斜面培养基上，置于5℃黑暗条件下保存，并定期转管，标注分离物来源、寄主、分离时间、鉴定人。实验记录保存
妥善保存检验报告包括症状、病菌等图文资料。检验报告应注明检验日期、方法、结果等，并有检验人签名。
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T0683—2014
代替SN0683--1997
出口粮谷中三环唑残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法
Determination of tricyclazole in cereals for export-HPLC-MS/MSmethod
2014-01-13发布
中华人民共和国
玉家质量监督检验检疫总局
2014-08-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标
出口粮谷中三环唑残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法
SN/T0683—2014
中国标准出版社出版
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张1.25
字数32千字
2014年12月第一版
2014年12月第一次印刷
印数11300
书号：155066·2-28081
定价21.00元
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