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SN/T 1612-2013

基本信息

标准号: SN/T 1612-2013

中文名称:香石竹环斑病毒检疫鉴定方法

标准类别:商检行业标准(SN)

标准状态:现行

出版语种:简体中文

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相关标签: 环斑 病毒 检疫 鉴定 方法

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出版信息

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标准简介

SN/T 1612-2013.Detection and identification of Carnation ringspot virus.
1范围
SN/T 1612主要规定了进境种苗中香石竹环斑病毒的DAS ELISA、免疫电镜、免疫捕获RT-PCR和实时荧光RT-PCR等检疫鉴定方法。
SN/T 1612适用于进境种苗中香石竹环斑病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1840植物病毒 免疫电镜检测方法
3香石竹环斑病毒基本信息
中文名:香石竹环斑病毒
英文名:Carnation ringspot virus
缩写:CRSV
分类地位:番茄丛矮病毒科(Tombysviridae),香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)
传播途径:该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播,近距离主要是由于植物间的接触、土壤污染和农事操作等引起病毒传播。
香石竹环斑病毒的其他信息参见附录A。
4方法原理
香石竹环斑病毒具有中等到强的免疫原性,易获得高质量的多抗血清,属内病毒之间有较弱的血清学交叉反应。
以香石竹环斑病毒的抗血清,采用DASELISA或者免疫捕获RT-PCR进行病毒初筛,如果样品阳性,则采用实时荧光RT-PCR、免疫电镜或者鉴别寄主反应,对阳性材料进行验证。两种及以上方法可进行病毒种类的检疫鉴定。

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标准内容

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T16122013
代替SN/T1612—2005
香石竹环斑病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Carnation ringspot virus2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。言
本标准代替SN/T1612—2005《香石竹环斑病毒血清学检测方法》。本标准与SN/T1612—2005相比,主要技术变化如下:增加了免疫捕获RT-PCR检测方法;增加了免疫电镜检测方法;
增加了实时荧光RT-PCR检测方法:-增加了香石竹环斑病毒相关资料的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国上海出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人:杨翠云、于翠、胡培龙、陶廷典、崔学慧、于子翔。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:SN/T1612—2005。
SN/T1612—2013
1范围
香石竹环斑病毒检疫鉴定方法
SN/T1612—2013
本标准主要规定了进境种苗中香石竹环斑病毒的DAS-ELISA、免疫电镜、免疫捕获RT-PCR和实时荧光RT-PCR等检疫鉴定方法。本标准适用于进境种苗中香石竹环斑病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的弓用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3香石竹环斑病毒基本信息
中文名:香石竹环斑病毒
英文名:Carnation ringspotvirus缩写:CRSV
分类地位:番茄丛矮病毒科(Tombusviridae),香石竹环斑病毒属(Dianthouirus)传播途径:该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播,近距离主要是由于植物间的接触、土壤污染和农事操作等引起病毒传播。香石竹环斑病毒的其他信息参见附录A。4方法原理
香石竹环斑病毒具有中等到强的免疫原性,易获得高质量的多抗血清,属内病毒之间有较弱的血清学交叉反应。
以香石竹环斑病毒的抗血清,采用DAS-ELISA或者免疫捕获RT-PCR进行病毒初筛,如果样品阳性,则采用实时荧光RT-PCR,免疫电镜或者鉴别寄主反应,对阳性材料进行验证。两种及以上方法可进行病毒种类的检疫鉴定。
5仪器设备,用具和试剂
5.1仪器设备
酶标仪PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平(1/10000g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、高速冷冻离心机、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、旋涡振荡器。5.2用具
可调式微量移液器(2μL.10μL100μL200μL.1000μL.5000μL)及相应的无RNase吸头、无1
SN/T1612—2013
RNase离心管,PCR管和研钵等
主要试剂
除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯。CRSV血清检测试剂、植物总RNA提取试剂盒、RNA反转录酶、TaqDNA聚合酶,DNA分子标记物、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。试剂配制见附录B。
6病毒检测
6.1样品制备
将送检样品中有疑似病毒为害症状的植物组织放人研钵内研磨,并按重量和病毒抽提缓冲液1:10的比例稀释,制备的汁液分别盛装于Eppendorf管中,离心后吸取上清液作为待测样品。症状描述参见附录A。
6.2双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)按6.1方法进行样品制备获得的上清液用于DAS-ELISA检测。同时,设置阴性对照、阳性对照和空白对照,阴性对照的种类和材料应该尽量与所检测样品类型相一致。具体操作步骤见附录C。6.3
免疫捕获RT-PCR方法IC-RT-PCR)先用香石竹环斑病毒抗血清包被PCR管,洗涤后在PCR管中加入6.1制备的上清液,进行免疫捕获,然后反转录获得cDNA,再进行PCR反应。具体操作步骤见附录D。6.4实时荧光RT-PCR方法
采用6.3方法获得cDNA,进行实时荧光PCR反应。也可按照植物总RNA提取试剂盒的规定提取样品中的RNA,反转录后再进行实时荧光PCR反应。具体操作步骤见附录E。6.5免疫电镜方法
利用香石竹环斑病毒抗血清富集植物材料中的病毒,在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特征,具体操作步骤按照SN/T1840规定进行。如观察到直径为34nm的球状病毒粒子,即可判定免疫电镜结果阳性。
7结果判定
样品经DAS-ELISA或IC-RT-PCR检测为阴性时,可判定样品不携带香石竹环斑病毒。样品经DAS-ELISA和IC-RT-PCR检测为阳性时,且扩增产物序列与CRSV有高度同源性时,可判定样品携带香石竹环斑病毒
样品经DAS-ELISA或IC-RT-PCR其中一种方法检测为阳性时,需要用实时荧光RT-PCR,免疫电镜方法或者鉴别寄主反应其中的任何一种方法进行验证,如果实时荧光RT-PCR阳性、免疫电镜方法观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄主表现相应症状时,可判定样品携带香石竹环斑病毒。2
样品保存和结果记录
样品保存
SN/T1612—2013
经检测确定携带香石竹环斑病毒的样品,应妥善保存在一80℃冰箱中,并做好登记和标记工作。样品保存期限至少1年。
8.2结果记录
记录包括:样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检疫人员的签字等。DAS-ELISA检测应有酶联反应的数值,IC-RT-PCR检测应有电泳照片及序列测定分析结果,实时荧光RT-PCR应有扩增图谱,免疫电镜检测需要有病毒颗粒图片,生物学测定应有鉴别寄主症状照片。3
SN/T16122013
A.1寄主范围
附录A
(资料性附录)
香石竹环斑病毒简介
香石竹环斑病毒的实验寄主范围较自然寄主广,在自然条件下,CRSV除侵染香石竹外,还可侵染多种果树如李树、梨树、苹果、葡萄、酸樱桃和甜樱桃树及果园里的杂草,如繁缕在实验条件下,CRSV可侵染25科共133种植物,可系统侵染茄科、豆科和葫芦科的植物,非系统侵染的寄主范围更广。
A,2为害症状
CRSV侵染香石竹引起叶片环斑,斑驳,导致叶和花的扭曲及畸变,严重可致叶尖坏死。当CRSV与香石竹斑驳病毒(Carnationmottlevirus)共同侵染时,症状加重。CRSV侵染果树的症状较轻且很难发现。
CRSV接种如下儿种鉴别寄主可产生相应的症状,可用来作为该病毒的鉴定方法之一宽色藜(Chenopodiumamaranticolor)和昆诺藜(C.quinoa):接种叶出现局部褪绿或坏死斑,通常无系统症状。
三生烟(Nicotianatabacumvar.SamsunNN):接种叶出现退绿环斑、枯斑及坏死斑,后期病斑连成一片。
豇豆(Vignaunguiculatassp.Sinensisy):接种叶产生局部坏死斑,接着系统感染叶产生斑驳,坏死斑、叶片卷曲或脉缩。
美国石竹(Diathusbarbatus):接种叶产生环状病斑,接着为系统褪绿及坏死斑。千日红(Gomphrenaglobosa):接种叶产生局部坏死环斑,接着系统感染叶产生病斑、斑驳和畸形。菜豆(Phaseolusuulgaris):接种叶产生局部坏死斑,接着叶变白、坏死,产生不规则系统斑,坏死叶脉斑,最后无症带毒。
图A.1CRSV接种昆诺募
图A.2CRSV接种宽色蒙
A.3分布地区
图A.3CRSV接种三生烟
SN/T1612—2013
图A.4CRSV接种虹豆
欧洲:丹麦、芬兰、法国、德国、意大利、立陶宛、荷兰、波兰和英国。美洲:巴西、加拿大、哥伦比亚、墨西哥和美国。大洋洲:澳大利亚、新西兰。
A.4粒体形态
病毒粒体为直径34nm的正二十面体(T=3),由180个分子量为38kd的蛋白亚基组成病毒粒子外壳。
A.5基因组
基因组由RNA-1和RNA-2两条单链RNA分子组成,分别为3.8kb和1.4kb。RNA-1在缺少RNA-2时可单独在植物原生质体中进行复制,但侵染植物时需RNA-1和RNA-2的共同作用。SN/T1612-—2013
B.1、10×PBST缓冲液(pH7.4)氯化钠(NaCI)
磷酸二氢钾(KHPO4)
磷酸氢二钠(Na2HPO.)
氯化钾(KCI)
吐湿20(Tween-20)
(规范性附录)
试剂配制
溶于900mL的蒸馏水中,用浓盐酸(HCI)调节pH至7.4,并定容至1000mL。B.2
样品抽提缓冲液(pH7.4)
亚硫酸钠(NaSO)
聚乙烯基吡喀烷酮(PVP)
叠氮化钠(NAN)
吐温20(Tween-20)
溶于900mL的1×PBST中,用HCl调节pH至7.4,定容至1000mL。包被抗体缓冲液(pH9.6)
碳酸钠(NazCO)
碳酸氢钠(NaHCO:)
溶解于900mL蒸馏水中,用浓盐酸(HCI)调节pH至9.6并定容至1000mL酶标抗体缓冲液(pH7.4)
1XPBST缓冲液
牛血清白蛋白(BSA)
聚乙烯基吡略烷酮(PVP)
用无菌蒸馏水定容至1000mL。
B.5底物(pNPP)缓冲液(pH9.8)二乙醇胺
叠氮化钠(NaN,)
溶解于600mL的无菌蒸馏水中,用浓盐酸(HCI)调节pH至9.8,然后用蒸馏水定容至1000mL。6
反应终止液
氢氧化钠(NaOH)120g溶于1000mL的无菌蒸馏水中,浓度3mol/L。B.7
电泳缓冲液TAE(50×)
三羟甲基氨基甲烷(Tris)
冰乙酸
0.5mol/L乙二胺四乙酸钠(EDTA)用时加蒸馏水稀释至1×TAE。
SN/T1612—2013
SN/T1612—2013
C.1检测
附录C
(规范性附录)
双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)C.1.1根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上,包括2个阳性对照孔,2个阴性对照孔,2个空白对照孔和多个待检测样品孔。每个待测样品重复一次。C.1.2每孔加人100μL用包被抗体缓冲液稀释至工作浓度的CRSV抗体溶液,封口膜包好,37℃孵育2h~4h(或4℃冰箱过夜)。
C.1.3清空孔中溶液,用200μL的1×PBST洗涤酶联板3次,每次3min,然后在干净滤纸上扣干。C.1.4将100uL制备的待测样品溶液加入到设计的待检测孔中,对照孔中也各加入100μL相应的阴性对照、阳性对照和空白对照。封口膜包好.37℃孵育2h(或4℃冰箱过夜)。C.1.5洗涤,步骤同C.1.3。
C.1.6每孔加人100μL用酶标抗体缓冲液稀释至工作浓度的CRSV酶标抗体溶液,封口膜包好,并于37℃孵育2h
C.1.7洗涤,步骤同C.1.3。
C.1.8将pNPP溶于底物缓冲液中,使最终浓度为1m/mL。每孔加人100μL配好的底物溶液,室温孵育0.5h~2h。必要时每孔加入50uL3mgl/L氢氧化钠落液终止反应。C.1.9酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录。C.2
质量控制和结果判定
C.2.1质量控制要求
缓冲液孔和阴性对照孔的OD值小于0.15.阴性对照孔的OD40s值小于0.05时,按0.05计算。阳性对照有明显的颜色反应,孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制,按照式(C.1)进行计算OD.—OD2
=(OD;+OD,)×1/2×100%
式中:
平行充许率;
重复样品1;
OD2——重复样品2。
当重复检测样品OD值平行允许率(P)小于20%时,判定检测结果有效。C.2.2结果判定
若满足不了C.2.1的质量要求,则不能进行结果判定。在满足了C.2.1的质量要求后,则按如下原则作出判定:样品OD/阴性对照OD值大于2,结果判定为阳性8
.(C.1)
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一样品OD405/阴性对照OD405值在阈值附近,判为可疑样品,需重做一次或者用其他方法进行验证。
样品OD405/阴性对照OD405值小于2,判为阴性9
SN/T1612—2013
引物序列
附录D
(规范性附录)
免疫捕获RT-PCR方法
上游引物:CRSV-F:5*-CCGATGTGCCCAAGTATGT-3下游引物:CRSV-R:5*-GGCTATGACGCCGTGAAT-3扩增片段大小为406bp。
抗体吸附
将CRSV抗体用包被缓冲液作适量稀释,吸取200μL包被PCR管,37℃,孵育2h;用PBST洗3次,吸取100μL按照6.1方法制备的样品上清液包被PCR管,4℃过夜(或37℃,孵育2h);PBST洗3次,DEPC-H2O洗1次,每次洗涤时间1min,短暂离心后吸去管底余液。反转录
直接在吸附了病毒的PCR管中进行反转录。反转录体系总体积20μL,其中1μL下游引物(20μmol/L),4μL5×AMV酶缓冲液,2μLdNTPs(10mmol/L).1μLAMV反转录酶(5U/μL),1μLRNA酶抑制剂(40U/μL),补足DEPC-H,O至20μL,42℃反应1h(不同的反转录酶产品按规定的温度条件进行操作)。
PCR扩增
PCR反应体系见表D.1,每个样品设2个平行处理。检测时以含香石竹环斑病毒材料的cDNA或含有香石竹环斑病毒目标片段的质粒作为阳性对照,以健康植物材料作为阴性对照,以水代替模板作为空白对照。
PCR反应条件设置如下:94℃3min:94℃30s、52℃30s、72℃30s.30个循环;72℃10min延伸。
PCR缓冲液
上游引物
下游引物
Tag醇
储存液浓度
2.5mmol/L
25mmol/L
25μmol/L
25μmol/L
5U/μL
PCR反应体系
终浓度
0.2mmol/L
2.0mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.06U/μL
加样量/μL
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