SN/T 1612-2013
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标准简介
SN/T 1612-2013.Detection and identification of Carnation ringspot virus.
1范围
SN/T 1612主要规定了进境种苗中香石竹环斑病毒的DAS ELISA、免疫电镜、免疫捕获RT-PCR和实时荧光RT-PCR等检疫鉴定方法。
SN/T 1612适用于进境种苗中香石竹环斑病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1840植物病毒 免疫电镜检测方法
3香石竹环斑病毒基本信息
中文名:香石竹环斑病毒
英文名:Carnation ringspot virus
缩写:CRSV
分类地位:番茄丛矮病毒科(Tombysviridae),香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)
传播途径:该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播，近距离主要是由于植物间的接触、土壤污染和农事操作等引起病毒传播。
香石竹环斑病毒的其他信息参见附录A。
4方法原理
香石竹环斑病毒具有中等到强的免疫原性，易获得高质量的多抗血清,属内病毒之间有较弱的血清学交叉反应。
以香石竹环斑病毒的抗血清,采用DASELISA或者免疫捕获RT-PCR进行病毒初筛,如果样品阳性,则采用实时荧光RT-PCR、免疫电镜或者鉴别寄主反应,对阳性材料进行验证。两种及以上方法可进行病毒种类的检疫鉴定。
1范围
SN/T 1612主要规定了进境种苗中香石竹环斑病毒的DAS ELISA、免疫电镜、免疫捕获RT-PCR和实时荧光RT-PCR等检疫鉴定方法。
SN/T 1612适用于进境种苗中香石竹环斑病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1840植物病毒 免疫电镜检测方法
3香石竹环斑病毒基本信息
中文名:香石竹环斑病毒
英文名:Carnation ringspot virus
缩写:CRSV
分类地位:番茄丛矮病毒科(Tombysviridae),香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)
传播途径:该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播，近距离主要是由于植物间的接触、土壤污染和农事操作等引起病毒传播。
香石竹环斑病毒的其他信息参见附录A。
4方法原理
香石竹环斑病毒具有中等到强的免疫原性，易获得高质量的多抗血清,属内病毒之间有较弱的血清学交叉反应。
以香石竹环斑病毒的抗血清,采用DASELISA或者免疫捕获RT-PCR进行病毒初筛,如果样品阳性,则采用实时荧光RT-PCR、免疫电镜或者鉴别寄主反应,对阳性材料进行验证。两种及以上方法可进行病毒种类的检疫鉴定。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T16122013
代替SN/T1612—2005
香石竹环斑病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Carnation ringspot virus2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。言
本标准代替SN/T1612—2005《香石竹环斑病毒血清学检测方法》。本标准与SN/T1612—2005相比，主要技术变化如下：增加了免疫捕获RT-PCR检测方法；增加了免疫电镜检测方法；
增加了实时荧光RT-PCR检测方法：-增加了香石竹环斑病毒相关资料的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国上海出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：杨翠云、于翠、胡培龙、陶廷典、崔学慧、于子翔。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1612—2005。
SN/T1612—2013
1范围
香石竹环斑病毒检疫鉴定方法
SN/T1612—2013
本标准主要规定了进境种苗中香石竹环斑病毒的DAS-ELISA、免疫电镜、免疫捕获RT-PCR和实时荧光RT-PCR等检疫鉴定方法。本标准适用于进境种苗中香石竹环斑病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的弓用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3香石竹环斑病毒基本信息
中文名：香石竹环斑病毒
英文名：Carnation ringspotvirus缩写：CRSV
分类地位：番茄丛矮病毒科（Tombusviridae），香石竹环斑病毒属（Dianthouirus）传播途径：该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播，近距离主要是由于植物间的接触、土壤污染和农事操作等引起病毒传播。香石竹环斑病毒的其他信息参见附录A。4方法原理
香石竹环斑病毒具有中等到强的免疫原性，易获得高质量的多抗血清，属内病毒之间有较弱的血清学交叉反应。
以香石竹环斑病毒的抗血清，采用DAS-ELISA或者免疫捕获RT-PCR进行病毒初筛，如果样品阳性，则采用实时荧光RT-PCR，免疫电镜或者鉴别寄主反应，对阳性材料进行验证。两种及以上方法可进行病毒种类的检疫鉴定。
5仪器设备，用具和试剂
5.1仪器设备
酶标仪PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平（1/10000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、高速冷冻离心机、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、旋涡振荡器。5.2用具
可调式微量移液器（2μL.10μL100μL200μL.1000μL.5000μL）及相应的无RNase吸头、无1
SN/T1612—2013
RNase离心管，PCR管和研钵等
主要试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。CRSV血清检测试剂、植物总RNA提取试剂盒、RNA反转录酶、TaqDNA聚合酶，DNA分子标记物、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。试剂配制见附录B。
6病毒检测
6.1样品制备
将送检样品中有疑似病毒为害症状的植物组织放人研钵内研磨，并按重量和病毒抽提缓冲液1：10的比例稀释，制备的汁液分别盛装于Eppendorf管中，离心后吸取上清液作为待测样品。症状描述参见附录A。
6.2双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）按6.1方法进行样品制备获得的上清液用于DAS-ELISA检测。同时，设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照的种类和材料应该尽量与所检测样品类型相一致。具体操作步骤见附录C。6.3
免疫捕获RT-PCR方法IC-RT-PCR）先用香石竹环斑病毒抗血清包被PCR管，洗涤后在PCR管中加入6.1制备的上清液，进行免疫捕获，然后反转录获得cDNA，再进行PCR反应。具体操作步骤见附录D。6.4实时荧光RT-PCR方法
采用6.3方法获得cDNA，进行实时荧光PCR反应。也可按照植物总RNA提取试剂盒的规定提取样品中的RNA，反转录后再进行实时荧光PCR反应。具体操作步骤见附录E。6.5免疫电镜方法
利用香石竹环斑病毒抗血清富集植物材料中的病毒，在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特征，具体操作步骤按照SN/T1840规定进行。如观察到直径为34nm的球状病毒粒子，即可判定免疫电镜结果阳性。
7结果判定
样品经DAS-ELISA或IC-RT-PCR检测为阴性时，可判定样品不携带香石竹环斑病毒。样品经DAS-ELISA和IC-RT-PCR检测为阳性时，且扩增产物序列与CRSV有高度同源性时，可判定样品携带香石竹环斑病毒
样品经DAS-ELISA或IC-RT-PCR其中一种方法检测为阳性时，需要用实时荧光RT-PCR，免疫电镜方法或者鉴别寄主反应其中的任何一种方法进行验证，如果实时荧光RT-PCR阳性、免疫电镜方法观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄主表现相应症状时，可判定样品携带香石竹环斑病毒。2
样品保存和结果记录
样品保存
SN/T1612—2013
经检测确定携带香石竹环斑病毒的样品，应妥善保存在一80℃冰箱中，并做好登记和标记工作。样品保存期限至少1年。
8.2结果记录
记录包括：样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检疫人员的签字等。DAS-ELISA检测应有酶联反应的数值，IC-RT-PCR检测应有电泳照片及序列测定分析结果，实时荧光RT-PCR应有扩增图谱，免疫电镜检测需要有病毒颗粒图片，生物学测定应有鉴别寄主症状照片。3
SN/T16122013
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
香石竹环斑病毒简介
香石竹环斑病毒的实验寄主范围较自然寄主广，在自然条件下，CRSV除侵染香石竹外，还可侵染多种果树如李树、梨树、苹果、葡萄、酸樱桃和甜樱桃树及果园里的杂草，如繁缕在实验条件下，CRSV可侵染25科共133种植物，可系统侵染茄科、豆科和葫芦科的植物，非系统侵染的寄主范围更广。
A,2为害症状
CRSV侵染香石竹引起叶片环斑，斑驳，导致叶和花的扭曲及畸变，严重可致叶尖坏死。当CRSV与香石竹斑驳病毒（Carnationmottlevirus）共同侵染时，症状加重。CRSV侵染果树的症状较轻且很难发现。
CRSV接种如下儿种鉴别寄主可产生相应的症状，可用来作为该病毒的鉴定方法之一宽色藜（Chenopodiumamaranticolor）和昆诺藜（C.quinoa）：接种叶出现局部褪绿或坏死斑，通常无系统症状。
三生烟（Nicotianatabacumvar.SamsunNN）：接种叶出现退绿环斑、枯斑及坏死斑，后期病斑连成一片。
豇豆（Vignaunguiculatassp.Sinensisy）：接种叶产生局部坏死斑，接着系统感染叶产生斑驳，坏死斑、叶片卷曲或脉缩。
美国石竹（Diathusbarbatus）：接种叶产生环状病斑，接着为系统褪绿及坏死斑。千日红（Gomphrenaglobosa）：接种叶产生局部坏死环斑，接着系统感染叶产生病斑、斑驳和畸形。菜豆（Phaseolusuulgaris）：接种叶产生局部坏死斑，接着叶变白、坏死，产生不规则系统斑，坏死叶脉斑，最后无症带毒。
图A.1CRSV接种昆诺募
图A.2CRSV接种宽色蒙
A.3分布地区
图A.3CRSV接种三生烟
SN/T1612—2013
图A.4CRSV接种虹豆
欧洲：丹麦、芬兰、法国、德国、意大利、立陶宛、荷兰、波兰和英国。美洲：巴西、加拿大、哥伦比亚、墨西哥和美国。大洋洲：澳大利亚、新西兰。
A.4粒体形态
病毒粒体为直径34nm的正二十面体（T=3），由180个分子量为38kd的蛋白亚基组成病毒粒子外壳。
A.5基因组
基因组由RNA-1和RNA-2两条单链RNA分子组成，分别为3.8kb和1.4kb。RNA-1在缺少RNA-2时可单独在植物原生质体中进行复制，但侵染植物时需RNA-1和RNA-2的共同作用。SN/T1612-—2013
B.1、10×PBST缓冲液（pH7.4）氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KHPO4）
磷酸氢二钠（Na2HPO.）
氯化钾（KCI)
吐湿20（Tween-20)
（规范性附录）
试剂配制
溶于900mL的蒸馏水中，用浓盐酸（HCI）调节pH至7.4，并定容至1000mL。B.2
样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸钠（NaSO）
聚乙烯基吡喀烷酮（PVP）
叠氮化钠（NAN）
吐温20（Tween-20)
溶于900mL的1×PBST中，用HCl调节pH至7.4，定容至1000mL。包被抗体缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NazCO）
碳酸氢钠（NaHCO：）
溶解于900mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCI）调节pH至9.6并定容至1000mL酶标抗体缓冲液（pH7.4）
1XPBST缓冲液
牛血清白蛋白（BSA）
聚乙烯基吡略烷酮（PVP）
用无菌蒸馏水定容至1000mL。
B.5底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）二乙醇胺
叠氮化钠（NaN，）
溶解于600mL的无菌蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH至9.8，然后用蒸馏水定容至1000mL。6
反应终止液
氢氧化钠（NaOH)120g溶于1000mL的无菌蒸馏水中，浓度3mol/L。B.7
电泳缓冲液TAE（50×）
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰乙酸
0.5mol/L乙二胺四乙酸钠（EDTA）用时加蒸馏水稀释至1×TAE。
SN/T1612—2013
SN/T1612—2013
C.1检测
附录C
（规范性附录）
双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）C.1.1根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上，包括2个阳性对照孔，2个阴性对照孔，2个空白对照孔和多个待检测样品孔。每个待测样品重复一次。C.1.2每孔加人100μL用包被抗体缓冲液稀释至工作浓度的CRSV抗体溶液，封口膜包好，37℃孵育2h～4h（或4℃冰箱过夜）。
C.1.3清空孔中溶液，用200μL的1×PBST洗涤酶联板3次，每次3min，然后在干净滤纸上扣干。C.1.4将100uL制备的待测样品溶液加入到设计的待检测孔中，对照孔中也各加入100μL相应的阴性对照、阳性对照和空白对照。封口膜包好.37℃孵育2h（或4℃冰箱过夜）。C.1.5洗涤，步骤同C.1.3。
C.1.6每孔加人100μL用酶标抗体缓冲液稀释至工作浓度的CRSV酶标抗体溶液，封口膜包好，并于37℃孵育2h
C.1.7洗涤，步骤同C.1.3。
C.1.8将pNPP溶于底物缓冲液中，使最终浓度为1m/mL。每孔加人100μL配好的底物溶液，室温孵育0.5h~2h。必要时每孔加入50uL3mgl/L氢氧化钠落液终止反应。C.1.9酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录。C.2
质量控制和结果判定
C.2.1质量控制要求
缓冲液孔和阴性对照孔的OD值小于0.15.阴性对照孔的OD40s值小于0.05时，按0.05计算。阳性对照有明显的颜色反应，孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制，按照式（C.1)进行计算OD.—OD2
=(OD;+OD,)×1/2×100%
式中：
平行充许率；
重复样品1；
OD2——重复样品2。
当重复检测样品OD值平行允许率（P）小于20%时，判定检测结果有效。C.2.2结果判定
若满足不了C.2.1的质量要求，则不能进行结果判定。在满足了C.2.1的质量要求后，则按如下原则作出判定：样品OD/阴性对照OD值大于2，结果判定为阳性8
.(C.1)
SN/T1612—2013
一样品OD405/阴性对照OD405值在阈值附近，判为可疑样品，需重做一次或者用其他方法进行验证。
样品OD405/阴性对照OD405值小于2，判为阴性9
SN/T1612—2013
引物序列
附录D
（规范性附录）
免疫捕获RT-PCR方法
上游引物：CRSV-F：5*-CCGATGTGCCCAAGTATGT-3下游引物：CRSV-R：5*-GGCTATGACGCCGTGAAT-3扩增片段大小为406bp。
抗体吸附
将CRSV抗体用包被缓冲液作适量稀释，吸取200μL包被PCR管，37℃，孵育2h；用PBST洗3次，吸取100μL按照6.1方法制备的样品上清液包被PCR管，4℃过夜（或37℃，孵育2h）；PBST洗3次，DEPC-H2O洗1次，每次洗涤时间1min，短暂离心后吸去管底余液。反转录
直接在吸附了病毒的PCR管中进行反转录。反转录体系总体积20μL，其中1μL下游引物(20μmol/L），4μL5×AMV酶缓冲液，2μLdNTPs（10mmol/L）.1μLAMV反转录酶（5U/μL)，1μLRNA酶抑制剂（40U/μL），补足DEPC-H,O至20μL，42℃反应1h（不同的反转录酶产品按规定的温度条件进行操作）。
PCR扩增
PCR反应体系见表D.1，每个样品设2个平行处理。检测时以含香石竹环斑病毒材料的cDNA或含有香石竹环斑病毒目标片段的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。
PCR反应条件设置如下：94℃3min：94℃30s、52℃30s、72℃30s.30个循环；72℃10min延伸。
PCR缓冲液
上游引物
下游引物
Tag醇
储存液浓度
2.5mmol/L
25mmol/L
25μmol/L
25μmol/LbZxz.net
5U/μL
PCR反应体系
终浓度
0.2mmol/L
2.0mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.06U/μL
加样量/μL
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代替SN/T1612—2005
香石竹环斑病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Carnation ringspot virus2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。言
本标准代替SN/T1612—2005《香石竹环斑病毒血清学检测方法》。本标准与SN/T1612—2005相比，主要技术变化如下：增加了免疫捕获RT-PCR检测方法；增加了免疫电镜检测方法；
增加了实时荧光RT-PCR检测方法：-增加了香石竹环斑病毒相关资料的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国上海出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：杨翠云、于翠、胡培龙、陶廷典、崔学慧、于子翔。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1612—2005。
SN/T1612—2013
1范围
香石竹环斑病毒检疫鉴定方法
SN/T1612—2013
本标准主要规定了进境种苗中香石竹环斑病毒的DAS-ELISA、免疫电镜、免疫捕获RT-PCR和实时荧光RT-PCR等检疫鉴定方法。本标准适用于进境种苗中香石竹环斑病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的弓用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3香石竹环斑病毒基本信息
中文名：香石竹环斑病毒
英文名：Carnation ringspotvirus缩写：CRSV
分类地位：番茄丛矮病毒科（Tombusviridae），香石竹环斑病毒属（Dianthouirus）传播途径：该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播，近距离主要是由于植物间的接触、土壤污染和农事操作等引起病毒传播。香石竹环斑病毒的其他信息参见附录A。4方法原理
香石竹环斑病毒具有中等到强的免疫原性，易获得高质量的多抗血清，属内病毒之间有较弱的血清学交叉反应。
以香石竹环斑病毒的抗血清，采用DAS-ELISA或者免疫捕获RT-PCR进行病毒初筛，如果样品阳性，则采用实时荧光RT-PCR，免疫电镜或者鉴别寄主反应，对阳性材料进行验证。两种及以上方法可进行病毒种类的检疫鉴定。
5仪器设备，用具和试剂
5.1仪器设备
酶标仪PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平（1/10000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、高速冷冻离心机、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、旋涡振荡器。5.2用具
可调式微量移液器（2μL.10μL100μL200μL.1000μL.5000μL）及相应的无RNase吸头、无1
SN/T1612—2013
RNase离心管，PCR管和研钵等
主要试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。CRSV血清检测试剂、植物总RNA提取试剂盒、RNA反转录酶、TaqDNA聚合酶，DNA分子标记物、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。试剂配制见附录B。
6病毒检测
6.1样品制备
将送检样品中有疑似病毒为害症状的植物组织放人研钵内研磨，并按重量和病毒抽提缓冲液1：10的比例稀释，制备的汁液分别盛装于Eppendorf管中，离心后吸取上清液作为待测样品。症状描述参见附录A。
6.2双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）按6.1方法进行样品制备获得的上清液用于DAS-ELISA检测。同时，设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照的种类和材料应该尽量与所检测样品类型相一致。具体操作步骤见附录C。6.3
免疫捕获RT-PCR方法IC-RT-PCR）先用香石竹环斑病毒抗血清包被PCR管，洗涤后在PCR管中加入6.1制备的上清液，进行免疫捕获，然后反转录获得cDNA，再进行PCR反应。具体操作步骤见附录D。6.4实时荧光RT-PCR方法
采用6.3方法获得cDNA，进行实时荧光PCR反应。也可按照植物总RNA提取试剂盒的规定提取样品中的RNA，反转录后再进行实时荧光PCR反应。具体操作步骤见附录E。6.5免疫电镜方法
利用香石竹环斑病毒抗血清富集植物材料中的病毒，在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特征，具体操作步骤按照SN/T1840规定进行。如观察到直径为34nm的球状病毒粒子，即可判定免疫电镜结果阳性。
7结果判定
样品经DAS-ELISA或IC-RT-PCR检测为阴性时，可判定样品不携带香石竹环斑病毒。样品经DAS-ELISA和IC-RT-PCR检测为阳性时，且扩增产物序列与CRSV有高度同源性时，可判定样品携带香石竹环斑病毒
样品经DAS-ELISA或IC-RT-PCR其中一种方法检测为阳性时，需要用实时荧光RT-PCR，免疫电镜方法或者鉴别寄主反应其中的任何一种方法进行验证，如果实时荧光RT-PCR阳性、免疫电镜方法观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄主表现相应症状时，可判定样品携带香石竹环斑病毒。2
样品保存和结果记录
样品保存
SN/T1612—2013
经检测确定携带香石竹环斑病毒的样品，应妥善保存在一80℃冰箱中，并做好登记和标记工作。样品保存期限至少1年。
8.2结果记录
记录包括：样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检疫人员的签字等。DAS-ELISA检测应有酶联反应的数值，IC-RT-PCR检测应有电泳照片及序列测定分析结果，实时荧光RT-PCR应有扩增图谱，免疫电镜检测需要有病毒颗粒图片，生物学测定应有鉴别寄主症状照片。3
SN/T16122013
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
香石竹环斑病毒简介
香石竹环斑病毒的实验寄主范围较自然寄主广，在自然条件下，CRSV除侵染香石竹外，还可侵染多种果树如李树、梨树、苹果、葡萄、酸樱桃和甜樱桃树及果园里的杂草，如繁缕在实验条件下，CRSV可侵染25科共133种植物，可系统侵染茄科、豆科和葫芦科的植物，非系统侵染的寄主范围更广。
A,2为害症状
CRSV侵染香石竹引起叶片环斑，斑驳，导致叶和花的扭曲及畸变，严重可致叶尖坏死。当CRSV与香石竹斑驳病毒（Carnationmottlevirus）共同侵染时，症状加重。CRSV侵染果树的症状较轻且很难发现。
CRSV接种如下儿种鉴别寄主可产生相应的症状，可用来作为该病毒的鉴定方法之一宽色藜（Chenopodiumamaranticolor）和昆诺藜（C.quinoa）：接种叶出现局部褪绿或坏死斑，通常无系统症状。
三生烟（Nicotianatabacumvar.SamsunNN）：接种叶出现退绿环斑、枯斑及坏死斑，后期病斑连成一片。
豇豆（Vignaunguiculatassp.Sinensisy）：接种叶产生局部坏死斑，接着系统感染叶产生斑驳，坏死斑、叶片卷曲或脉缩。
美国石竹（Diathusbarbatus）：接种叶产生环状病斑，接着为系统褪绿及坏死斑。千日红（Gomphrenaglobosa）：接种叶产生局部坏死环斑，接着系统感染叶产生病斑、斑驳和畸形。菜豆（Phaseolusuulgaris）：接种叶产生局部坏死斑，接着叶变白、坏死，产生不规则系统斑，坏死叶脉斑，最后无症带毒。
图A.1CRSV接种昆诺募
图A.2CRSV接种宽色蒙
A.3分布地区
图A.3CRSV接种三生烟
SN/T1612—2013
图A.4CRSV接种虹豆
欧洲：丹麦、芬兰、法国、德国、意大利、立陶宛、荷兰、波兰和英国。美洲：巴西、加拿大、哥伦比亚、墨西哥和美国。大洋洲：澳大利亚、新西兰。
A.4粒体形态
病毒粒体为直径34nm的正二十面体（T=3），由180个分子量为38kd的蛋白亚基组成病毒粒子外壳。
A.5基因组
基因组由RNA-1和RNA-2两条单链RNA分子组成，分别为3.8kb和1.4kb。RNA-1在缺少RNA-2时可单独在植物原生质体中进行复制，但侵染植物时需RNA-1和RNA-2的共同作用。SN/T1612-—2013
B.1、10×PBST缓冲液（pH7.4）氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KHPO4）
磷酸氢二钠（Na2HPO.）
氯化钾（KCI)
吐湿20（Tween-20)
（规范性附录）
试剂配制
溶于900mL的蒸馏水中，用浓盐酸（HCI）调节pH至7.4，并定容至1000mL。B.2
样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸钠（NaSO）
聚乙烯基吡喀烷酮（PVP）
叠氮化钠（NAN）
吐温20（Tween-20)
溶于900mL的1×PBST中，用HCl调节pH至7.4，定容至1000mL。包被抗体缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NazCO）
碳酸氢钠（NaHCO：）
溶解于900mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCI）调节pH至9.6并定容至1000mL酶标抗体缓冲液（pH7.4）
1XPBST缓冲液
牛血清白蛋白（BSA）
聚乙烯基吡略烷酮（PVP）
用无菌蒸馏水定容至1000mL。
B.5底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）二乙醇胺
叠氮化钠（NaN，）
溶解于600mL的无菌蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH至9.8，然后用蒸馏水定容至1000mL。6
反应终止液
氢氧化钠（NaOH)120g溶于1000mL的无菌蒸馏水中，浓度3mol/L。B.7
电泳缓冲液TAE（50×）
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰乙酸
0.5mol/L乙二胺四乙酸钠（EDTA）用时加蒸馏水稀释至1×TAE。
SN/T1612—2013
SN/T1612—2013
C.1检测
附录C
（规范性附录）
双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）C.1.1根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上，包括2个阳性对照孔，2个阴性对照孔，2个空白对照孔和多个待检测样品孔。每个待测样品重复一次。C.1.2每孔加人100μL用包被抗体缓冲液稀释至工作浓度的CRSV抗体溶液，封口膜包好，37℃孵育2h～4h（或4℃冰箱过夜）。
C.1.3清空孔中溶液，用200μL的1×PBST洗涤酶联板3次，每次3min，然后在干净滤纸上扣干。C.1.4将100uL制备的待测样品溶液加入到设计的待检测孔中，对照孔中也各加入100μL相应的阴性对照、阳性对照和空白对照。封口膜包好.37℃孵育2h（或4℃冰箱过夜）。C.1.5洗涤，步骤同C.1.3。
C.1.6每孔加人100μL用酶标抗体缓冲液稀释至工作浓度的CRSV酶标抗体溶液，封口膜包好，并于37℃孵育2h
C.1.7洗涤，步骤同C.1.3。
C.1.8将pNPP溶于底物缓冲液中，使最终浓度为1m/mL。每孔加人100μL配好的底物溶液，室温孵育0.5h~2h。必要时每孔加入50uL3mgl/L氢氧化钠落液终止反应。C.1.9酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录。C.2
质量控制和结果判定
C.2.1质量控制要求
缓冲液孔和阴性对照孔的OD值小于0.15.阴性对照孔的OD40s值小于0.05时，按0.05计算。阳性对照有明显的颜色反应，孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制，按照式（C.1)进行计算OD.—OD2
=(OD;+OD,)×1/2×100%
式中：
平行充许率；
重复样品1；
OD2——重复样品2。
当重复检测样品OD值平行允许率（P）小于20%时，判定检测结果有效。C.2.2结果判定
若满足不了C.2.1的质量要求，则不能进行结果判定。在满足了C.2.1的质量要求后，则按如下原则作出判定：样品OD/阴性对照OD值大于2，结果判定为阳性8
.(C.1)
SN/T1612—2013
一样品OD405/阴性对照OD405值在阈值附近，判为可疑样品，需重做一次或者用其他方法进行验证。
样品OD405/阴性对照OD405值小于2，判为阴性9
SN/T1612—2013
引物序列
附录D
（规范性附录）
免疫捕获RT-PCR方法
上游引物：CRSV-F：5*-CCGATGTGCCCAAGTATGT-3下游引物：CRSV-R：5*-GGCTATGACGCCGTGAAT-3扩增片段大小为406bp。
抗体吸附
将CRSV抗体用包被缓冲液作适量稀释，吸取200μL包被PCR管，37℃，孵育2h；用PBST洗3次，吸取100μL按照6.1方法制备的样品上清液包被PCR管，4℃过夜（或37℃，孵育2h）；PBST洗3次，DEPC-H2O洗1次，每次洗涤时间1min，短暂离心后吸去管底余液。反转录
直接在吸附了病毒的PCR管中进行反转录。反转录体系总体积20μL，其中1μL下游引物(20μmol/L），4μL5×AMV酶缓冲液，2μLdNTPs（10mmol/L）.1μLAMV反转录酶（5U/μL)，1μLRNA酶抑制剂（40U/μL），补足DEPC-H,O至20μL，42℃反应1h（不同的反转录酶产品按规定的温度条件进行操作）。
PCR扩增
PCR反应体系见表D.1，每个样品设2个平行处理。检测时以含香石竹环斑病毒材料的cDNA或含有香石竹环斑病毒目标片段的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。
PCR反应条件设置如下：94℃3min：94℃30s、52℃30s、72℃30s.30个循环；72℃10min延伸。
PCR缓冲液
上游引物
下游引物
Tag醇
储存液浓度
2.5mmol/L
25mmol/L
25μmol/L
25μmol/LbZxz.net
5U/μL
PCR反应体系
终浓度
0.2mmol/L
2.0mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.06U/μL
加样量/μL
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