SN/T 1558-2017
基本信息
标准号： SN/T 1558-2017
中文名称：禽脑脊髓炎检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1558-2017.Quarantine protocol for avain encephalomyelitis.
1范围
SN/T 1558规定了禽脑脊髓炎的病毒分离与鉴定、反转录-聚合酶链式反应、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、琼脂扩散试验的检测技术。
SN/T 1558适用于禽脑脊髓炎的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AE:禽脑脊髓炎(参见附录A)(Avian encephalomyelitis)
AEV:禽脑脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus)
AGID:琼脂扩散试验( Agar gel immunodiffusion test)
BSA:牛血清白蛋白(Bovine serum albumin)
CEF :鸡胚成纤维细胞(Chickenembryo fibroblast)
ELISA :酶联免疫吸附试验( Enzyme -linked immunosorbent assay)
PBS:磷酸缓冲液(Phosphate buffer saline)
RT-PCR:反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-Polymerase chain reaction)
4病毒分离与鉴定
4.1设备、器材和试剂
4.1.1主要设备 和器材:高压灭菌锅、冰箱、生物安全柜、离心机、无菌剪刀、镊子、平皿、烧杯、玻璃瓶、组织研磨器、注射器等。
1范围
SN/T 1558规定了禽脑脊髓炎的病毒分离与鉴定、反转录-聚合酶链式反应、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、琼脂扩散试验的检测技术。
SN/T 1558适用于禽脑脊髓炎的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AE:禽脑脊髓炎(参见附录A)(Avian encephalomyelitis)
AEV:禽脑脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus)
AGID:琼脂扩散试验( Agar gel immunodiffusion test)
BSA:牛血清白蛋白(Bovine serum albumin)
CEF :鸡胚成纤维细胞(Chickenembryo fibroblast)
ELISA :酶联免疫吸附试验( Enzyme -linked immunosorbent assay)
PBS:磷酸缓冲液(Phosphate buffer saline)
RT-PCR:反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-Polymerase chain reaction)
4病毒分离与鉴定
4.1设备、器材和试剂
4.1.1主要设备 和器材:高压灭菌锅、冰箱、生物安全柜、离心机、无菌剪刀、镊子、平皿、烧杯、玻璃瓶、组织研磨器、注射器等。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1558—2017
代替SN/T1558—2005
禽脑脊髓炎检疫技术规范
Quarantine protocol for avain encephalomyelitis2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准代替SN/T1558—2005《禽脑脊髓炎琼脂免疫扩散试验操作规程》。本标准与SN/T1558—2005相比，主要技术变化如下：增加了禽脑脊髓炎病毒分离；
一增加了反转录-聚合酶链式反应；增加了间接免疫荧光试验；
增加了酶联免疫吸附试验。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1558—2017
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：杨俊兴、孙洁、廖立珊、张彩虹、刘建利、陶虹、林彦星、吕建强、曹琛福、卢体康花群义、秦智锋
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1558—2005。
1范围
禽脑脊髓炎检疫技术规范
SN/T1558—2017
本标准规定了窝脑脊髓炎的病毒分离与鉴定、反转录-聚合链式反应，间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、琼脂扩散试验的检测技术。本标准适用于窝脑脊髓炎的检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AE：禽脑脊髓炎（参见附录A）（Avianencephalomyelitis）AEV：禽脑脊髓炎病毒（Avianencephalomyelitisvirus）AGID：琼脂扩散试验（Agargelimmunodiffusiontest）BSA：牛血清白蛋白（Bovineserumalbumin）CEF：鸡胚成纤维细胞（Chickenembryofibroblast）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay）PBS：磷酸缓冲液（Phosphatebuffersaline）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-Polymerasechainreaction）4病毒分离与鉴定
4.1设备、器材和试剂
4.1.1主要设备和器材：高压灭菌锅、冰箱、生物安全柜、离心机、无菌剪刀、镊子、平皿、烧杯、玻璃瓶组织研磨器、注射器等。
4.1.2材料：SPF种蛋SPF锥鸡
4.1.3主要试剂：生理盐水、青霉素（10000IU/mL）、链霉素（10000μg/mL）。2样品的采集、保存和运输
无菌取维鸡脑组织后，宜立即处理（见4.3），若暂时不能处理，可于一70℃冰箱中保存。样品的保存和运送按SN/T2123进行操作。4.3样品的处理
将组织样品无菌称量、研磨，反复冻融3次，用无菌生理盐水溶液作1：5（W/V）稀释制成悬液，并1
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加青霉素（终浓度为1001U/mL）和链霉素（100μg/mL）。样品经4000r/min离心10min，取上清液，冻存、备用。
4.4鸡胚接种
取4.3中上清液，以0.2mL/胚，经卵黄囊无菌接种6日龄SPF鸡胚，每份样本至少接种5枚鸡胚，同时设未接种病料的空白对照组和接种0.2mLSPF鸡脑组织处理液的阴性对照组。于37℃孵化箱内孵育至16日龄。每隔12h观察鸡胚死亡情况，并记录。收集24h后死亡和仍存活的鸡胚，无菌吸取胚液（尿囊液和羊水），然后观察胚体发育情况：检查胚体、胚脑病变。若鸡胚有病变或鸡胚死亡，取胚脑、胃、肠、胰腺称量、研磨，以胚液作1：5稀释，加入青霉素（终浓度为100IU/mL）和链霉素（100μg/mL)，4000r/min离心10min，制成鸡胚组织病毒液，即为第1代病毒液（AEVE1）。取AEVE1按照本条上述方法再接种6日龄SPF鸡胚卵黄囊，传代2代，收集胚液，即可作为病毒鉴定用的病毒液。若鸡胚无病变，盲传至第5代。与健康对照组鸡胚相比，发病鸡胚病变为：胚体活力减弱、发育不良和肌肉萎缩（胚体重减轻）、腿细、爪曲或强直，脑萎缩，卤、胃肠水肿、出血等。
可进一步通过RT-PCR和/或间接免疫荧光试验进行病毒鉴定（见第5章、第6章）。5反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）5.1设备、器材和试剂
5.1.1主要设备和器材：PCR仪、离心机、电流仪、电泳槽、凝胶成像系统一20℃冰箱。
5.1.2主要试剂：Trizol、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP、琼脂糖、DNAmarker。
注：核酸提取可使用等效的商品化病毒核酸提取试剂盒5.1.3对照样品：灭活AEV作为阳性对照，由指定单位提供。SPF鸡胚尿囊液作为阴性对照。5.2
引物和序列
P1：5'-CTTATGCTGGCCCTGATCGT-3'；P2:5'-CCACAAACCTAGCCAAGGTG-3\扩增目的片段为612bp。
5.3核酸提取
5.3.1取250μL处理后的样品置于1.5mL离心管中，作好标记。同时设立阳性样品、阴性样品对照。加人3倍体积的Trizol，震荡混合20s，静置5min。5.3.2加人200μL三氯甲烷，震荡混合20s，静置5min；4℃12000r/min离心15min，取上清液置另一个标记好的1.5mL离心管中，加人等体积异丙醇，一20℃静置15min。5.3.34℃12000r/min离心15min，弃去上清，加人1mL75%乙醇。5.3.44℃12000r/min离心15min小心弃去乙醇，将离心管倒置于滤纸上，自然晾干，加人20μLDEPC水溶解沉淀，即为RNA模板，可立即用于RT-PCR检测，或放一20℃保存。5.4RT-PCR检测
5.4.1反应体系
10XRT-PCR缓冲液
P1(20 μmol/L)
P2(20μmol/L）
dNTP（各10mmol/L）
RNA模板
反转录酶（5U/μL）
TaqDNA聚合酶（5U/μL）
无RNA酶水
总体积
5.4.2反应程序
反应条件：42℃30min；95℃5min10min。
5.5琼脂糖凝胶电泳分析
SN/T1558—2017
min，共35个循环。72℃延伸wwW.bzxz.Net
用1×TBE电泳缓冲液配制2%琼脂糖凝胶平板（见附录B），将平板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。取8μLPCR产物和2μL样品缓冲液混匀后加人样品孔，同时加人DNA分子量标准物质（DNAmarker）。调节电压为约5V/em，电泳约25min。在紫外灯下或凝胶电泳分析仪观察是否出现大小约为612bp的基因片段（核酸序列参考附录C）性，否则判为AEV阴性
6间接免疫荧光试验
设备、材料和试剂
6.1.1主要设备：荧光显微镜，冰冻切片机若出现相应大小的条带，则判为AEV阳6.1.2主要试剂：FITC标记免抗鸡IgG抗体、标准阳性血清、标准阴性血清（SPF鸡血清）、冷冻固定剂、无水乙醇和丙酮。
6.1.3组织样品：发病维鸡脑组织样品（阳性对照、健康维鸡脑组织样品（阴性对照）和待检脑组织样品。
6.2操作方法
6.2.1冰冻组织切片制备
取AE发病鸡脑组织样品，SPF鸡脑组织样品和待检禽脑组织样品，分别覆以冷冻固定剂，一15℃～一18℃固定过夜。次日取出，经冰冻切片机切片，将组织切片置载玻片上，用一20℃预冷的丙酮：乙醇（3：2）固定液室温固定5min~10min6.2.2间接免疫荧光检测
将固定好的组织切片，PBS洗3次，分别加上标准阳性血清和标准阴性血清100uL/片，于37℃温度孵育30min后用PBS洗涤3次，加人FITC标记兔抗鸡IgG抗体，置37℃孵育30min，经PBS洗涤3次后在荧光显微镜下观察。
6.2.3结果判定
阳性对照脑组织切片与标准阳性血清作用，出现明亮绿色荧光，而与标准阴性血清作用以及SPF鸡脑组织切片与阳性血清作用均无亮绿色荧光，则对照成立。判定结果时，若被检组织的细胞浆中出现3
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绿色荧光，判为阳性，否则判为阴性。酶联免疫吸附试验
7.1设备、材料和试剂
7.1.1主要设备和材料：酶标仪、37℃恒温箱、4℃冰箱、ELISA洗板机、超声波破碎仪、酶标板。注：也可使用等效的商品化间接ELISA试剂盒检测AEV抗体。7.1.2包被抗原：为纯化的AEV抗原。按附录D制备并培养鸡胚成纤维细胞（CEF），待CEF生长至单层，弃去营养液，用无菌PBS洗2次～3次，按培养液原体积的1/10接种AEV，37℃吸附1h。弃去病毒液，加人维持液（含2%特牛血清的MEM），于CO2培养箱37℃培养6d~7d后，冻融3次~5次，作为毒种，依次传代至第5代。将第5代收获细胞毒经超声破碎仪处理，10000r/min离心60min，将上清转移至另一离心管中，45000r/min离心150min，去上清，沉淀物用适量无菌PBS溶液悬浮，经超声破碎仪处理，用分光光度计测定提纯物蛋白质浓度，纯化后抗原蛋白浓度应≥1.0g/L。7.1.3阳性血清：鸡抗AEV阳性血清，由指定单位提供7.1.4阴性血清：SPF鸡血清。
7.1.5待检血清：按常规方法采集鸡全血约1mL并分离血清，将血清置于4℃保存待检或一70℃长期保存。
7.1.6酶标记抗体：辣根过氧化物酶标记的免抗鸡IgG。7.1.7ELISA包被液、封闭液、稀释液、洗涤液（PBST）、底物液、终止液见附录B。7.2试验操作
7.2.1包被：用包被液稀释AEV抗原至终浓度为10mg/L，包被96孔ELISA板，50μL/孔，置4℃冰箱过液。
7.2.2封闭：弃去包被液，加人1%BSA溶液，200μL/孔，37℃放置1h，弃去封闭液，用PBST洗3遍。7.2.3加样：每份样品（包括阴性对照、阳性对照样品和待检样品）做2个平行检测，50uL/孔，轻轻敲打酶标板边缘，使孔内反应液均匀铺满孔底。置于37℃反应1h，弃去反应物，用PBST洗3遍。7.2.4加人用稀释液稀释的酶标记抗体（1：3000或按相关说明书进行稀释），50μL/孔，轻轻敲打酶标板边缘，使孔内反应液均勾铺满孔底。置于37℃反应30min，弃去反应物，用PBST洗3遍7.2.5加入底物液，50μL/孔，轻轻敲打酶标板边缘，使孔内反应液均勾铺满孔底。室温避光反应20min.
7.2.6加人终止液，50μL/孔。
用酶标仪在450nm下读取OD值。
7.3结果判定
7.3.1S/P值的计算见式（1)：
待检样品OD平均值一阴性对照OD平均值阳性对照OD平均值一阴性对照OD平均值7.3.2
样品S/P≥0.2.为AEV抗体阳性：样品S/P<0.2.为AEV抗体阴性（1)
8琼脂扩散试验
设备、器材和试剂
主要设备
37℃恒温箱、冰箱。
主要器材
平ml：直径为90mm。
微量加样器
塑料吸头。
打孔器：内径4.0mm，孔间距3.0mm，7孔梅花样金属打孔器。8.1.2.4
3试剂
脑脊髓炎琼脂扩散试验抗原和标准阳性血清，由指定单位提供。8.1.3.2
期保存。
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被检血清：按常规方法采集鸡全血约1mL并分离血清，将血清置于4℃保存待检或一70℃长8.1.3.3琼脂糖。
操作步骤
8.2.1琼脂板制备
称取琼脂糖1.0g，加0.01mol/LPBS(pH7.2）至100mL。加热熔化后，加人8.0g氯化钠，充分溶解后，加1.0mL1%硫柳汞溶液（终浓度为0.01%）。冷却至45℃~50℃，将洁净干燥、直径为90mm的灭菌平皿，放置于水平平台上，每个平血加18mL，厚度约为3.0mm。凝固后盖严，把平血倒置放人4℃冰箱中保存备用。
8.2.2打孔
反应孔现用现打。从冰箱内出琼脂板，用7孔一组的梅花形打孔器进行打孔（中间1孔，外周6孔）（见图1)，孔径4.00mm，孔距3.0mm。将孔中的琼脂糖轻轻挑出或吸出，勿伤及边缘或使琼脂层脱离玻璃
图1梅花形7孔图
8.2.3封底
在酒精灯火焰上通过4次～6次加热平血背面，使底部琼脂稍微熔化5
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8.2.4加样
结合上列图示，用微量加样器吸取抗原溶液滴人中央孔，标“+”的三孔加标准阳性血清，1、2、3孔加被检血清，每孔均需加满，但不能溢出。每加一个被检样品应换一个吸头。8.2.5反应
加样完毕，室温静置10min，放人保湿盒内置22℃~26℃反应，分别在24h，48h和72h观察并记录结果。
8.3结果判定
8.3.1判定前提
将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，在抗原孔与标准阳性血清孔之间出现一条清晰、致密的沉淀线，抗原孔与阴性血清孔之间不出现沉淀线，说明对照成立，可进行结果判定。8.3.2阳性
抗原孔与被检血清孔之间形成的沉淀线与阳性对照血清形成的沉淀线弯曲环联，判为阳性（见图2）。a
注：标“+”为阳性血清，1、2、3孔被检血清呈阳图2
8.3.3可疑
被检血清阳性示意图
若抗原孔与被检血清孔间虽不出现沉淀线，但抗原与标准阳性血清孔间的沉淀线在被检血清孔位置微向内侧弯曲者（见图3中的1号孔），则被检血清判为可疑反应。对该份血清应复检，仍为可疑则判为阳性反应。
注：标“十”为阳性血清，1孔被检血清为可疑，2、3孔被检血清呈阴性。图3被检血清呈可疑结果示意图
8.3.4非特异性反应
若抗原孔、被检血清孔之间的沉淀线与抗原孔、标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉，则判为非特异6
性反应，应重做。若仍出现非特异性反应则判为阴性（如图4所示第3孔）。SN/T1558—2017
注：标“+”为阳性血清，1孔被检血清为阳性，2孔被检血清为阴性，3孔被检血清呈非特异性反应。图4
8.3.5阴性
被检血清呈非特异性反应示意图抗原孔与被检血清孔之间无沉淀线，抗原孔与标准阳性血清孔间沉淀线直伸延到被检血清孔边缘无弯曲者，则判为阴性（见图5）。3
注：标+”为阳性血清，1、2、3孔被检血清呈阴性被检血清呈阴性示意图
SN/T1558—2017
附录A
（资料性附录）
禽脑脊髓炎概述
禽脑脊髓炎（Avianencephalomyelitis，AE）是由细小RNA病毒科（Picornaviridae）、肠病毒属（En+terovirus）的禽脑脊髓炎病毒（Avianencephalomyelitisvirus，AEV)引起的，以主侵幼鸡中枢神经系统引起非化脓性脑炎为主要病理特征的一种病毒性传染病。AEV为RNA病毒，属于微RNA病毒科肠道病毒属。禽脑脊髓炎呈世界性分布，对养鸡业特别是种鸡饲养业造成了极大危害。该病1930年首先在美国被发现，现已遍及世界大多数国家。在我国，自1980年以来，先后在广东、江苏、辽宁、黑龙江、河北、内蒙古，福建、上海等省市区有发生AE的报道。流行病学
除鸡易感AEV外，雉鸡、鹑、火鸡和山鸡也可自然感染。无本病史和未经免疫的鸡群一旦感染，维鸡发病率通常为40%～60%、死亡率为10%～80%或更高。不同日龄的鸡一年四季均可感染。随日龄的增长，鸡对AEV的抵抗力不断增强。感染鸡的种蛋可以引起后代鸡胚和雏鸡发病：同时，病鸡的分泌物和排泄物可污染环境、饲料和饮水，引起与其接触的易感鸡发病。自然情况下，4周龄以内的维鸡（幼禽）对AEV最易感：人工感染1日龄雍鸡脑内接种AEV强毒5d~7d后可发病：经胚胎感染的维鸡出壳后潜伏期1d~7d，口服感染或自然接触一般9d~11d后发病。临床症状
自然感染和人工感染雏鸡的临床症状基本一致，初期精神沉郁、嗜睡、易惊、斜视、呈半尊姿势，头颈偏向一侧，饮水困难，双腿紧缩，叉开或爪缩，以后可出现站立不稳、进行性运动失调、头颈快速震题等症状，甚者常因瘫痪、衰竭而死亡。成年鸡感染后一般不出现明显症状，有时仅见轻微腹泻，产蛋率下降10%～40%和种蛋孵化率降低。
病理变化
典型病变为非化脓性脑炎，镜下可见神经元发生中央染色质溶解和逐渐性坏死，小胶质细胞增生，血管周围管套现象。人工感染病鸡进行病理学研究发现：肉眼可见脑组织表面有充血淤血，或有针尖大出血点和灰白色小病灶。镜下可见毛细血管增多、充血、水肿、管套形成，小血管外围出现围管性细胞浸润，浸润的细胞以淋巴细胞为主，也有少量浆细胞和巨噬细胞，这些细胞少则1层～2层或散在，多则几层、十儿层，密集排列形成管套，严重时可压道血管使之狭窄或闭塞：神经细胞变性和中央染色质溶解，变性的神经细胞肿大，淡染或浓缩，有的呈现中央染色质溶解现象。此外，外周神经和其他实质器官也有一定病变，并有淋巴细胞增生。8
0.01mol/LPBS(pH7.2)的配制
磷酸氢二钠（NazHPO.·12H,O)
磷酸二氢钠（NaHPO）
氯化钠（NaCI)
加蒸馏水至
附录B
（规范性附录）
溶液配方
1000mL
用氢氧化钠（NaOH)或盐酸（HCI)调pH至7.2，灭菌或过滤。B.2
ELISA包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）碳酸氢钠（NaHCO）
碳酸钠（NazCO）
蒸馏水
溶解后置于4℃冰箱保存，请在一周内使用。2.93g
1000mL
洗涤液（含0.1%Tween-20pH7.4PBS，PBST）氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KH,PO）
磷酸氢二钠（NaHPO）
氯化钾（KCI)
Tween-20
蒸馏水
溶解后置于4℃冰箱备用。
4封闭液
1000mL
3%BSA溶液：取3gBSA粉，加人100mL蒸馏水，混匀，置于4℃冰箱备用。B.5
5稀释液
含有1%BSA的PBST，用于血清样品、酶标记抗体的稀释。底物液
乙酸-柠檬酸缓冲液（pH6.0）：B.6.1
A液：乙酸钠溶液
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乙酸钠
双蒸水
B液：柠檬酸缓冲液
柠檬酸
蒸馏水
配制：取B液约2mL至A液中，调pH值6.0，置于4℃冰箱保存备用。B.6.2TMB溶液：
加温溶解后于暗盒中室温保存
B.6.3底物工作液（现用现配）
乙酸-柠檬酸缓冲液（pH6.0）
TMB溶液
可使用等效商品化底物溶液
终液（2mol/LH,SO
浓硫酸（H,SO）
蒸馏水
B.85×TBE电泳缓冲液
Tris碱
0.5mol/LEDTA溶液pH8.
蒸馏水定容至1000mL，充分溶解，B.92%琼脂糖凝胶
℃保存
在200mL三角烧瓶中加人琼脂糖2g：1×TBE缓冲液100mL。微波炉中使之完全溶解，加人2μL浓度为10mg/mL溴化乙锭溶液（或等效商品化DNA染料）2μL充分摇勾，备用；待琼脂糖冷却至60℃左右，倒入制胶板并防止气泡产生，使琼脂糖厚度达3mm~5mm，待凝胶完全凝固后去掉梳子，将凝胶托盘放人电泳槽，加人1×TBE电泳缓冲液使之高出凝胶2mm～3mm。硼酸缓冲液（pH8.6）
四硼酸钠
蒸馏水加至1000mL。
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下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3缩略语
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AE：禽脑脊髓炎（参见附录A）（Avianencephalomyelitis）AEV：禽脑脊髓炎病毒（Avianencephalomyelitisvirus）AGID：琼脂扩散试验（Agargelimmunodiffusiontest）BSA：牛血清白蛋白（Bovineserumalbumin）CEF：鸡胚成纤维细胞（Chickenembryofibroblast）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay）PBS：磷酸缓冲液（Phosphatebuffersaline）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-Polymerasechainreaction）4病毒分离与鉴定
4.1设备、器材和试剂
4.1.1主要设备和器材：高压灭菌锅、冰箱、生物安全柜、离心机、无菌剪刀、镊子、平皿、烧杯、玻璃瓶组织研磨器、注射器等。
4.1.2材料：SPF种蛋SPF锥鸡
4.1.3主要试剂：生理盐水、青霉素（10000IU/mL）、链霉素（10000μg/mL）。2样品的采集、保存和运输
无菌取维鸡脑组织后，宜立即处理（见4.3），若暂时不能处理，可于一70℃冰箱中保存。样品的保存和运送按SN/T2123进行操作。4.3样品的处理
将组织样品无菌称量、研磨，反复冻融3次，用无菌生理盐水溶液作1：5（W/V）稀释制成悬液，并1
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加青霉素（终浓度为1001U/mL）和链霉素（100μg/mL）。样品经4000r/min离心10min，取上清液，冻存、备用。
4.4鸡胚接种
取4.3中上清液，以0.2mL/胚，经卵黄囊无菌接种6日龄SPF鸡胚，每份样本至少接种5枚鸡胚，同时设未接种病料的空白对照组和接种0.2mLSPF鸡脑组织处理液的阴性对照组。于37℃孵化箱内孵育至16日龄。每隔12h观察鸡胚死亡情况，并记录。收集24h后死亡和仍存活的鸡胚，无菌吸取胚液（尿囊液和羊水），然后观察胚体发育情况：检查胚体、胚脑病变。若鸡胚有病变或鸡胚死亡，取胚脑、胃、肠、胰腺称量、研磨，以胚液作1：5稀释，加入青霉素（终浓度为100IU/mL）和链霉素（100μg/mL)，4000r/min离心10min，制成鸡胚组织病毒液，即为第1代病毒液（AEVE1）。取AEVE1按照本条上述方法再接种6日龄SPF鸡胚卵黄囊，传代2代，收集胚液，即可作为病毒鉴定用的病毒液。若鸡胚无病变，盲传至第5代。与健康对照组鸡胚相比，发病鸡胚病变为：胚体活力减弱、发育不良和肌肉萎缩（胚体重减轻）、腿细、爪曲或强直，脑萎缩，卤、胃肠水肿、出血等。
可进一步通过RT-PCR和/或间接免疫荧光试验进行病毒鉴定（见第5章、第6章）。5反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）5.1设备、器材和试剂
5.1.1主要设备和器材：PCR仪、离心机、电流仪、电泳槽、凝胶成像系统一20℃冰箱。
5.1.2主要试剂：Trizol、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP、琼脂糖、DNAmarker。
注：核酸提取可使用等效的商品化病毒核酸提取试剂盒5.1.3对照样品：灭活AEV作为阳性对照，由指定单位提供。SPF鸡胚尿囊液作为阴性对照。5.2
引物和序列
P1：5'-CTTATGCTGGCCCTGATCGT-3'；P2:5'-CCACAAACCTAGCCAAGGTG-3\扩增目的片段为612bp。
5.3核酸提取
5.3.1取250μL处理后的样品置于1.5mL离心管中，作好标记。同时设立阳性样品、阴性样品对照。加人3倍体积的Trizol，震荡混合20s，静置5min。5.3.2加人200μL三氯甲烷，震荡混合20s，静置5min；4℃12000r/min离心15min，取上清液置另一个标记好的1.5mL离心管中，加人等体积异丙醇，一20℃静置15min。5.3.34℃12000r/min离心15min，弃去上清，加人1mL75%乙醇。5.3.44℃12000r/min离心15min小心弃去乙醇，将离心管倒置于滤纸上，自然晾干，加人20μLDEPC水溶解沉淀，即为RNA模板，可立即用于RT-PCR检测，或放一20℃保存。5.4RT-PCR检测
5.4.1反应体系
10XRT-PCR缓冲液
P1(20 μmol/L)
P2(20μmol/L）
dNTP（各10mmol/L）
RNA模板
反转录酶（5U/μL）
TaqDNA聚合酶（5U/μL）
无RNA酶水
总体积
5.4.2反应程序
反应条件：42℃30min；95℃5min10min。
5.5琼脂糖凝胶电泳分析
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min，共35个循环。72℃延伸wwW.bzxz.Net
用1×TBE电泳缓冲液配制2%琼脂糖凝胶平板（见附录B），将平板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。取8μLPCR产物和2μL样品缓冲液混匀后加人样品孔，同时加人DNA分子量标准物质（DNAmarker）。调节电压为约5V/em，电泳约25min。在紫外灯下或凝胶电泳分析仪观察是否出现大小约为612bp的基因片段（核酸序列参考附录C）性，否则判为AEV阴性
6间接免疫荧光试验
设备、材料和试剂
6.1.1主要设备：荧光显微镜，冰冻切片机若出现相应大小的条带，则判为AEV阳6.1.2主要试剂：FITC标记免抗鸡IgG抗体、标准阳性血清、标准阴性血清（SPF鸡血清）、冷冻固定剂、无水乙醇和丙酮。
6.1.3组织样品：发病维鸡脑组织样品（阳性对照、健康维鸡脑组织样品（阴性对照）和待检脑组织样品。
6.2操作方法
6.2.1冰冻组织切片制备
取AE发病鸡脑组织样品，SPF鸡脑组织样品和待检禽脑组织样品，分别覆以冷冻固定剂，一15℃～一18℃固定过夜。次日取出，经冰冻切片机切片，将组织切片置载玻片上，用一20℃预冷的丙酮：乙醇（3：2）固定液室温固定5min~10min6.2.2间接免疫荧光检测
将固定好的组织切片，PBS洗3次，分别加上标准阳性血清和标准阴性血清100uL/片，于37℃温度孵育30min后用PBS洗涤3次，加人FITC标记兔抗鸡IgG抗体，置37℃孵育30min，经PBS洗涤3次后在荧光显微镜下观察。
6.2.3结果判定
阳性对照脑组织切片与标准阳性血清作用，出现明亮绿色荧光，而与标准阴性血清作用以及SPF鸡脑组织切片与阳性血清作用均无亮绿色荧光，则对照成立。判定结果时，若被检组织的细胞浆中出现3
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绿色荧光，判为阳性，否则判为阴性。酶联免疫吸附试验
7.1设备、材料和试剂
7.1.1主要设备和材料：酶标仪、37℃恒温箱、4℃冰箱、ELISA洗板机、超声波破碎仪、酶标板。注：也可使用等效的商品化间接ELISA试剂盒检测AEV抗体。7.1.2包被抗原：为纯化的AEV抗原。按附录D制备并培养鸡胚成纤维细胞（CEF），待CEF生长至单层，弃去营养液，用无菌PBS洗2次～3次，按培养液原体积的1/10接种AEV，37℃吸附1h。弃去病毒液，加人维持液（含2%特牛血清的MEM），于CO2培养箱37℃培养6d~7d后，冻融3次~5次，作为毒种，依次传代至第5代。将第5代收获细胞毒经超声破碎仪处理，10000r/min离心60min，将上清转移至另一离心管中，45000r/min离心150min，去上清，沉淀物用适量无菌PBS溶液悬浮，经超声破碎仪处理，用分光光度计测定提纯物蛋白质浓度，纯化后抗原蛋白浓度应≥1.0g/L。7.1.3阳性血清：鸡抗AEV阳性血清，由指定单位提供7.1.4阴性血清：SPF鸡血清。
7.1.5待检血清：按常规方法采集鸡全血约1mL并分离血清，将血清置于4℃保存待检或一70℃长期保存。
7.1.6酶标记抗体：辣根过氧化物酶标记的免抗鸡IgG。7.1.7ELISA包被液、封闭液、稀释液、洗涤液（PBST）、底物液、终止液见附录B。7.2试验操作
7.2.1包被：用包被液稀释AEV抗原至终浓度为10mg/L，包被96孔ELISA板，50μL/孔，置4℃冰箱过液。
7.2.2封闭：弃去包被液，加人1%BSA溶液，200μL/孔，37℃放置1h，弃去封闭液，用PBST洗3遍。7.2.3加样：每份样品（包括阴性对照、阳性对照样品和待检样品）做2个平行检测，50uL/孔，轻轻敲打酶标板边缘，使孔内反应液均匀铺满孔底。置于37℃反应1h，弃去反应物，用PBST洗3遍。7.2.4加人用稀释液稀释的酶标记抗体（1：3000或按相关说明书进行稀释），50μL/孔，轻轻敲打酶标板边缘，使孔内反应液均勾铺满孔底。置于37℃反应30min，弃去反应物，用PBST洗3遍7.2.5加入底物液，50μL/孔，轻轻敲打酶标板边缘，使孔内反应液均勾铺满孔底。室温避光反应20min.
7.2.6加人终止液，50μL/孔。
用酶标仪在450nm下读取OD值。
7.3结果判定
7.3.1S/P值的计算见式（1)：
待检样品OD平均值一阴性对照OD平均值阳性对照OD平均值一阴性对照OD平均值7.3.2
样品S/P≥0.2.为AEV抗体阳性：样品S/P<0.2.为AEV抗体阴性（1)
8琼脂扩散试验
设备、器材和试剂
主要设备
37℃恒温箱、冰箱。
主要器材
平ml：直径为90mm。
微量加样器
塑料吸头。
打孔器：内径4.0mm，孔间距3.0mm，7孔梅花样金属打孔器。8.1.2.4
3试剂
脑脊髓炎琼脂扩散试验抗原和标准阳性血清，由指定单位提供。8.1.3.2
期保存。
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被检血清：按常规方法采集鸡全血约1mL并分离血清，将血清置于4℃保存待检或一70℃长8.1.3.3琼脂糖。
操作步骤
8.2.1琼脂板制备
称取琼脂糖1.0g，加0.01mol/LPBS(pH7.2）至100mL。加热熔化后，加人8.0g氯化钠，充分溶解后，加1.0mL1%硫柳汞溶液（终浓度为0.01%）。冷却至45℃~50℃，将洁净干燥、直径为90mm的灭菌平皿，放置于水平平台上，每个平血加18mL，厚度约为3.0mm。凝固后盖严，把平血倒置放人4℃冰箱中保存备用。
8.2.2打孔
反应孔现用现打。从冰箱内出琼脂板，用7孔一组的梅花形打孔器进行打孔（中间1孔，外周6孔）（见图1)，孔径4.00mm，孔距3.0mm。将孔中的琼脂糖轻轻挑出或吸出，勿伤及边缘或使琼脂层脱离玻璃
图1梅花形7孔图
8.2.3封底
在酒精灯火焰上通过4次～6次加热平血背面，使底部琼脂稍微熔化5
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8.2.4加样
结合上列图示，用微量加样器吸取抗原溶液滴人中央孔，标“+”的三孔加标准阳性血清，1、2、3孔加被检血清，每孔均需加满，但不能溢出。每加一个被检样品应换一个吸头。8.2.5反应
加样完毕，室温静置10min，放人保湿盒内置22℃~26℃反应，分别在24h，48h和72h观察并记录结果。
8.3结果判定
8.3.1判定前提
将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，在抗原孔与标准阳性血清孔之间出现一条清晰、致密的沉淀线，抗原孔与阴性血清孔之间不出现沉淀线，说明对照成立，可进行结果判定。8.3.2阳性
抗原孔与被检血清孔之间形成的沉淀线与阳性对照血清形成的沉淀线弯曲环联，判为阳性（见图2）。a
注：标“+”为阳性血清，1、2、3孔被检血清呈阳图2
8.3.3可疑
被检血清阳性示意图
若抗原孔与被检血清孔间虽不出现沉淀线，但抗原与标准阳性血清孔间的沉淀线在被检血清孔位置微向内侧弯曲者（见图3中的1号孔），则被检血清判为可疑反应。对该份血清应复检，仍为可疑则判为阳性反应。
注：标“十”为阳性血清，1孔被检血清为可疑，2、3孔被检血清呈阴性。图3被检血清呈可疑结果示意图
8.3.4非特异性反应
若抗原孔、被检血清孔之间的沉淀线与抗原孔、标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉，则判为非特异6
性反应，应重做。若仍出现非特异性反应则判为阴性（如图4所示第3孔）。SN/T1558—2017
注：标“+”为阳性血清，1孔被检血清为阳性，2孔被检血清为阴性，3孔被检血清呈非特异性反应。图4
8.3.5阴性
被检血清呈非特异性反应示意图抗原孔与被检血清孔之间无沉淀线，抗原孔与标准阳性血清孔间沉淀线直伸延到被检血清孔边缘无弯曲者，则判为阴性（见图5）。3
注：标+”为阳性血清，1、2、3孔被检血清呈阴性被检血清呈阴性示意图
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附录A
（资料性附录）
禽脑脊髓炎概述
禽脑脊髓炎（Avianencephalomyelitis，AE）是由细小RNA病毒科（Picornaviridae）、肠病毒属（En+terovirus）的禽脑脊髓炎病毒（Avianencephalomyelitisvirus，AEV)引起的，以主侵幼鸡中枢神经系统引起非化脓性脑炎为主要病理特征的一种病毒性传染病。AEV为RNA病毒，属于微RNA病毒科肠道病毒属。禽脑脊髓炎呈世界性分布，对养鸡业特别是种鸡饲养业造成了极大危害。该病1930年首先在美国被发现，现已遍及世界大多数国家。在我国，自1980年以来，先后在广东、江苏、辽宁、黑龙江、河北、内蒙古，福建、上海等省市区有发生AE的报道。流行病学
除鸡易感AEV外，雉鸡、鹑、火鸡和山鸡也可自然感染。无本病史和未经免疫的鸡群一旦感染，维鸡发病率通常为40%～60%、死亡率为10%～80%或更高。不同日龄的鸡一年四季均可感染。随日龄的增长，鸡对AEV的抵抗力不断增强。感染鸡的种蛋可以引起后代鸡胚和雏鸡发病：同时，病鸡的分泌物和排泄物可污染环境、饲料和饮水，引起与其接触的易感鸡发病。自然情况下，4周龄以内的维鸡（幼禽）对AEV最易感：人工感染1日龄雍鸡脑内接种AEV强毒5d~7d后可发病：经胚胎感染的维鸡出壳后潜伏期1d~7d，口服感染或自然接触一般9d~11d后发病。临床症状
自然感染和人工感染雏鸡的临床症状基本一致，初期精神沉郁、嗜睡、易惊、斜视、呈半尊姿势，头颈偏向一侧，饮水困难，双腿紧缩，叉开或爪缩，以后可出现站立不稳、进行性运动失调、头颈快速震题等症状，甚者常因瘫痪、衰竭而死亡。成年鸡感染后一般不出现明显症状，有时仅见轻微腹泻，产蛋率下降10%～40%和种蛋孵化率降低。
病理变化
典型病变为非化脓性脑炎，镜下可见神经元发生中央染色质溶解和逐渐性坏死，小胶质细胞增生，血管周围管套现象。人工感染病鸡进行病理学研究发现：肉眼可见脑组织表面有充血淤血，或有针尖大出血点和灰白色小病灶。镜下可见毛细血管增多、充血、水肿、管套形成，小血管外围出现围管性细胞浸润，浸润的细胞以淋巴细胞为主，也有少量浆细胞和巨噬细胞，这些细胞少则1层～2层或散在，多则几层、十儿层，密集排列形成管套，严重时可压道血管使之狭窄或闭塞：神经细胞变性和中央染色质溶解，变性的神经细胞肿大，淡染或浓缩，有的呈现中央染色质溶解现象。此外，外周神经和其他实质器官也有一定病变，并有淋巴细胞增生。8
0.01mol/LPBS(pH7.2)的配制
磷酸氢二钠（NazHPO.·12H,O)
磷酸二氢钠（NaHPO）
氯化钠（NaCI)
加蒸馏水至
附录B
（规范性附录）
溶液配方
1000mL
用氢氧化钠（NaOH)或盐酸（HCI)调pH至7.2，灭菌或过滤。B.2
ELISA包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）碳酸氢钠（NaHCO）
碳酸钠（NazCO）
蒸馏水
溶解后置于4℃冰箱保存，请在一周内使用。2.93g
1000mL
洗涤液（含0.1%Tween-20pH7.4PBS，PBST）氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KH,PO）
磷酸氢二钠（NaHPO）
氯化钾（KCI)
Tween-20
蒸馏水
溶解后置于4℃冰箱备用。
4封闭液
1000mL
3%BSA溶液：取3gBSA粉，加人100mL蒸馏水，混匀，置于4℃冰箱备用。B.5
5稀释液
含有1%BSA的PBST，用于血清样品、酶标记抗体的稀释。底物液
乙酸-柠檬酸缓冲液（pH6.0）：B.6.1
A液：乙酸钠溶液
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乙酸钠
双蒸水
B液：柠檬酸缓冲液
柠檬酸
蒸馏水
配制：取B液约2mL至A液中，调pH值6.0，置于4℃冰箱保存备用。B.6.2TMB溶液：
加温溶解后于暗盒中室温保存
B.6.3底物工作液（现用现配）
乙酸-柠檬酸缓冲液（pH6.0）
TMB溶液
可使用等效商品化底物溶液
终液（2mol/LH,SO
浓硫酸（H,SO）
蒸馏水
B.85×TBE电泳缓冲液
Tris碱
0.5mol/LEDTA溶液pH8.
蒸馏水定容至1000mL，充分溶解，B.92%琼脂糖凝胶
℃保存
在200mL三角烧瓶中加人琼脂糖2g：1×TBE缓冲液100mL。微波炉中使之完全溶解，加人2μL浓度为10mg/mL溴化乙锭溶液（或等效商品化DNA染料）2μL充分摇勾，备用；待琼脂糖冷却至60℃左右，倒入制胶板并防止气泡产生，使琼脂糖厚度达3mm~5mm，待凝胶完全凝固后去掉梳子，将凝胶托盘放人电泳槽，加人1×TBE电泳缓冲液使之高出凝胶2mm～3mm。硼酸缓冲液（pH8.6）
四硼酸钠
蒸馏水加至1000mL。
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