SN/T 1151.5-2014.Quarantine protocol for tetrahedral baculovirosis.
1范围
SN/T 1151.5规定了对虾杆状病毒的显微镜检查、聚合酶链式反应检测方法。
SN/T 1151.5适用于对虾杆状病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出 人境动物检疫采样
GB 19489实验室生物安全通 用要求
3试剂和材料
3.1水:符合 GB/T 6682一级水的规格。
3.2TaqDNA聚合酶:-20C保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。
3.3 dNTPs:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmol/L。
3.4引物:一对引物 ,浓度为40μmol/L,序列为:
4仪器和设备
4.1剪刀和镊子。
4.2载玻片 和盖玻片。
4.3恒温培养箱。
4.4普通冰箱和超低温冰箱。
4.5正置 显微镜。
4.6离心机和离心管。
4.7微量移液器及吸头。
4.8 PCR 扩增仪。
4.9电泳仪。
4.10紫外观察灯 或凝胶成像仪。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1151.5—2014
代替SN/T1151.5—2003
对虾杆状病毒病检疫技术规范
Quarantine protocol for tetrahedral baculovirosis2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
SN/T1151分为6部分：
-虾桃拉综合征检疫技术规范；
对虾白斑病检疫技术规范；
一斑节对虾杆状病毒（MBV)诊断方法；-虾黄头病检疫技术规范；
-对虾杆状病毒病检疫技术规范；言
对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程本部分为SN/T1151的第5部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分代替SN/T1151.52003《对虾杆状病毒（BP)检测方法》。本部分与SN/T1151.5—2003相比，主要技术变化如下：增加了采样；
对PCR试验引物进行了修改；
增加了扩增产物的参考序列。
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1151.5—2014
本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本部分主要起草人：史秀杰、何俊强、蒋玉婷、王津津、于力、郑晓聪、贾鹏、兰文升、杨锦舜、刘。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1151.5—2003。
1范围
对虾杆状病毒病检疫技术规范
SN/T1151.5—2014
SN/T1151的本标准规定了对虾杆状病毒的显微镜检查、聚合酶链式反应检测方法。本标准适用于对虾杆状病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样
GB19489实验室生物安全通用要求3
试剂和材料
3.1水：符合GB/T6682一级水的规格。3.2TaqDNA聚合酶：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.3dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。3.4引物：一对引物，浓度为40μmol/L，序列为：6581F:5'-TGT-AGC-AGC-AGA-GAA-GAG-36582R:5-CAC-TAA-GCC-TAT-CTC-CAG-3\扩增病毒基因中的645bp的DNA片断。3.5无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。仪器和设备
剪刀和镊子。
载玻片和盖玻片。
恒温培养箱。
普通冰箱和超低温冰箱。
正置显微镜。
离心机和离心管。
微量移液器及吸头。
4.8PCR扩增仪。
4.9电泳仪。
紫外观察灯或凝胶成像仪。
SN/T1151.5—2014
5采样
虾卵、幼虾、仔虾取整个作为样品，稚虾、成虾（鲜活的、颜死的或有损伤的）取肝胰腺、肠或粪便作为样品。根据GB/T18088规定的数量取样。用于分子生物学检测的样品可以是新鲜的、冰冻的、90%乙醇保存的，或其他适用于DNA扩增的保存样品。6对虾杆状病毒的诊断
6.1实验室环境
病原鉴定的实验室环境条件应符合GB19489的要求。6.2直接光学显微镜检查
6.2.1新鲜组织湿片法
取活的（鲜活的、濒死的或有损伤的）对虾肝胰腺和中肠，置于载玻片上，小心地制备压片，用相差或亮视野显微镜检查包涵体。
6.2.2粪便检查法
该方法适用于稚虾或大一些的对虾，尤其适用于用非致死方法检查有经济价值的亲虾是否带有BP。把对虾放在水簇箱、产卵箱或其他合适的水箱中，待数小时直到水箱底部出现粪便。用塑料虹吸管吸取排泄物，放在玻璃离心管中。把粪便制成湿片，用相差或亮视野显微镜检查包涵体。6.2.3结果判定
在肝胰腺、中肠或粪便的湿压片中，如果观察到上皮细胞的核内有单个或多个四面体的包涵体，可确认为对虾杆状病毒（Baculoviruspenaei,BP)感染。6.3聚合酶链式反应（PCR)检测
6.3.1提取DNA
6.3.1.1将粪便、肝胰腺，中肠或待检样本匀浆后，加人10倍体积的蛋白酶K消化液（见A.1），混合振荡使样品在缓冲液中分散。60C加热1h，然后95C处理10min。12000r/min离心2min，将上清转移到新的离心管中，然后置于冰上备用。6.3.1.2吸取200消化后的样品，加人600pL样品稀释液（见A.2），加600μL酚/三氯甲烷/异戊醇（见A.4），充分混合30s；12000r/min离心5min，取上层水相（约700μL）：加650L三氯甲烷/异戊醇（见A.3），用力混合30s；12000r/min离心5min，取上层水相（约600μL）：加1.5倍体积一20℃预冷的无水乙醇，混勾后一20℃过夜以沉淀核酸（在不能及时进行PCR检测的情况下，可置于1.5倍体积无水乙醇中，长期保存）；15000r/min离心30min，小心弃上清，立即用滤纸吸干（应尽量充分吸干），37℃干燥约30min；加11μL水溶解，吹打20下，一80℃冻融一次，做PCR模板。6.3.1.3可使用同等抽提效果的其他方法或使用商品化试剂盒抽提病毒DNA。6.3.2PCR扩增
用PCR检测BP时，每个抽提样品要煮沸3min，使DNA变性，然后放在冰上迅速冷却。PCR反2
SN/T 1151.5—2014
应混合物总体积25μL：10倍PCR缓冲液2.5μL、25mmol/LMgClz1.5μL、2.5mmol/LdNTPs2μL、40μmol/L引物各0.5uL、5UTaq酶0.5μL、待测样品DNA模板1μL，加水到25μL。混勾后稍离心，再将反应管置于PCR扩增仪。反应条件：95℃预变性5min；95℃30s、60℃30s、72℃60s，35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。6.3.3设立对照
在6.3.2中设立阳性对照、阴性对照、空白对照。取已知的感染了对虾杆状病毒的对虾组织（由指定单位提供）和未感染对虾杆状病毒的对虾组织，用6.3.1中的方法制备PCR模板，分别设立阳性对照和阴性对照；用1μL水作为PCR模板，设立空白对照。6.3.4琼脂糖电泳
用TBE缓冲液（见A.5）配制1.5%的琼脂糖（含0.5μg/mLEB）板，约0.5cm厚。将平板放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μLPCR扩增产物和2μL上样缓冲液（见A.6）混勾后加人样品孔。30mA电泳约0.5h，当溴酚蓝到达底部时停止。在电泳时设立DNA标准分子量Marker作对照。用紫外灯或凝胶成像仪观察核酸带。6.3.5结果判定
PCR后阳性对照出现645bp大小的扩增条带，阴性对照和空白对照没有该扩增条带。待测样品PCR后在相应的位置上有扩增条带，可确认为对虾杆状病毒。无扩增带或扩增带的位置不对的为阴性。
如果阴性对照出现扩增条带和（或）阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次测试样品的结果无效，需重新进行试验。bzxZ.net
6.4综合判定
在肝胰腺、中肠或粪便的湿压片中，观察到上皮细胞的核内有单个或多个四面体的包涵体，同时PCR检测BP结果也为阳性的，可确诊为对虾杆状病毒病。3
SN/T1151.5—2014
蛋白酶K消化液
氯化钾(KCI)
Tris-HCl
NonidetP-40
吐温-20（Tween-20)
蛋白酶K
样品稀释液
Tris-HCl
三氯甲烷/异戊醇
附录A
（规范性附录）
试剂配制
50mmol/L
10mmol/LpH8.3
80μg/mL
10mmol/LpH8.0
0.1mmol/L
将二者按24：1的比例混合，密闭避光保存。酚/三氯甲烷/异戊醇
用1mol/LTris饱和酚，三氯甲烷/异戊醇等体积混合，密闭避光保存。A.5
TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）
用5.0mol/L的盐酸调pH到8.0。
上样缓冲液
每100.0mL溶液中：溴酚蓝0.25g，蔗糖40.0g。4
附录B
（资料性附录）
扩增产物的参考序列
tgtagcagca gagaagagag aagagagaaa taagtgaagt aaataaaatgtcgggagctg aacatatgga aggtgttgag cgagtgctca gggatttgaacagtgaagaa aaattaacac tcggactgag tgctgtgggt ggggtagttggggcaactaa gatgatgaat gaagctgcag agcttagaag gaattatggaaatcgcccat atgaaaggct tttggagttg agcaagagaa agtatgagtccacaccaaca tcaggatttg aggagcgagt aagaccatct atggctgaacagctagatag aagcacaaag aggccaagga aagctaacag gttcccagtaaacactcatt ataacatgca taagatctgc aagaggacaa acctgacctcctccaaactt ttaggctttt ctggtcaggc tggaccagat gtcccaaaatataacagtgc agtaacccta ccattggagg ctctagaatt ttgggtgggagataacataa atccagaagt agcacactcc atgggaagca aagtattgagcgataaggaa tgcagggtaa aatcaatgaa actgaaactt agcaacctgcaagtatatga agacagacaa tatggat ctg gagataggct tagtgSN/T1151.5-—2014
SN/T1151.5—2014
附录C
(资料性附录）
对虾杆状病毒病
对虾杆状病毒病又名四面体杆状病毒病（Tetrahedralbaculovirosis），是由对虾杆状病毒（Baculoviruspenaei，BP），又名南美白对虾单核型多角体病毒（PvSNPV）引起的。该病毒暂被列在核型多角体病毒属，目前已发现至少存在三个地域的病毒株，分别分布在东南大西洋、美国墨西哥沿岸及加勒比海，南美、中美和北美洲的太平洋沿岸，夏威夷。该病毒通过肠道感染肝胰腺小管及中肠前段粘膜上皮细胞，在上皮细胞核内产生单个或多个四面体包涵体。包涵体呈四面体或金字塔状，金字塔底部到顶部高0.1μm到20μm，垂直长度大多为8μm，有些文献把BP包涵体归为PIBs（多面体包涵体）。BP主要在美洲和夏威夷流行，感染野生对虾，在东半球野生或养殖对虾中并未发现BP。鉴于BP在水产养殖业中造成的较大危害，OIE将其列人水生动物疫病检疫名录中，中国将其列为中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》二类疫病。该病毒宿主广泛，可感染对虾属（Penaeus）的滨对虾亚属（Litopenaeus）、美对虾亚属（Farfantepenaeus），明对虾亚属（Melicertus）、沟对虾亚属（Fenneropenaeus）对虾亚属（Penaeus），鹰爪虾属（Trachypenaeus）和原糙对虾属（Protrachypene）等在内的所有对虾品种。BP发病率差异很大，以幼体、仔虾和稚虾早期阶段对病毒最为敏感，从野生和养殖群体的不足1%，到对虾育苗池的100%。实验室攻毒试验显示，幼体（尤其是蚤状幼体和糠虾幼体）和仔虾早期阶段最容易感染BP，也是对虾孵化场中死亡率可能最高的两个阶段。稚虾或成虾感染BP后，死亡率一般不高，但在虾场中，感染可能导致虾生长缓慢、对虾育苗池或养成池中虾的成活率降低。严重感染了BP的蚤状幼体，糠虾幼体和早期仔体，出现发白的中肠（由于在粪便中出现包涵体和细胞碎片），稚虾、成虾以及轻度感染的幼虾没有呈现具诊断价值的症状。除严重感染的后期幼体表现出昏睡外，没有受感染宿主出现行为变化的报道。BP主要是水平传播，通过摄食感染的组织（同类残食）、粪便、包涵体或病毒污染的碎屑或水体引起。一般在对虾宿主存在持续感染，严重感染BP的野生雌性南美白对虾的成体在产卵时会排泄出含BP的粪便，从而污染了虾卵，把病毒传给下一代。可以通过消毒剂、降低pH值、加热和紫外照射等方法灭活病毒。在孵化场中可以使用福尔马林，有机碘和干净的海水彻底清洗无节幼体或虾卵，以消除粪便对虾卵和幼体的污染。对已感染或可能感染病毒的亲虾虾卵进行日常消毒，可以减少BP流行病在孵化场的发生。
SN/T1151.5-2014
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
对虾杆状病毒病检疫技术规范
SN/T1151.5-2014
中国标准出版社出版
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张0.75字数14千字2015年12月第一版2015年12月第一次印刷印数1-1100
书号：155066·2-29349
定价16.00元
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