SN/T 1616-2013.Detection of African cassava mosaic virus.
1范围
SN/T 1616规定了非洲木薯花叶病毒检测鉴定的基本原则和方法。
SN/T 1616适用于可能带有非洲木薯花叶病毒的所有进境木薯及苗木等的检疫检测和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用
SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法
3非洲木薯花叶病毒基本信息
缩写:ACMV。
分类地位:双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)。
传播途径:主要通过木薯粉虱( Bemisia tabaci),种薯及块茎等传播。
4仪器设备、用具及试剂
4.1仪器设备
透射式电子显微镜、酶联检测仪、电子天平、水浴锅、PCR扩增仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、台式高速冷冻离心机和凝胶成像系统等。
4.2用具
可调移液器、移液器头、酶联板、离心管和研钵等。
4.3试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。
检测试剂见附录B、附录C、附录D。
5实验室检测
木薯种于隔离温室中,待长出苗后取叶片做血清学检测;木薯试管苗及脱毒苗则直接对植株进行血清学检测(见附录B)。血清学检测结果为阳性的再用生物学测定(见附录C)或免疫电镜观察(SN/T 1840)或常规PCR检测(见附录D)或实时荧光PCR检测(见附录E)中的一种方法进行复查。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1616—2013
代替SN/T1616—2005
非洲木薯花叶病毒检测方法
Detection of African cassava mosaic virus2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
非洲木薯花叶病毒检测方法
SN/T1616-2013
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100015）总编室：（010）6-1275323
网址spe.net.cn
中国标准出版社器空岛印剧厂印刷开本 880×12301/16印张1字数26干字2014年2月第一版 201年2月第一次印刷印数1--1600
书号：155066-2-26553
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1616—2005《非洲木薯花叶病毒检测方法》。本标准与SN/T1616—2005相比，除编辑性修改外主要技术变化如下：增加了常规PCR检测方法
一增加了实时荧光PCR检测方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1616—2013
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李明福、冯黎霞、鲁洁、张永江、孔君、李桂芬、相宁、魏梅生、张成良。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T1616—2005。
1范围
非洲木薯花叶病毒检测方法
本标准规定了非洲木薯花叶病毒检测鉴定的基本原则和方法。SN/T1616-—2013
本标准适用于可能带有非洲木薯花叶病毒的所有进境术薯及苗木等的检疫检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适月SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3非洲木薯花叶病毒基本信息
学名：African cassava mosaic缩写：ACMV。
分类地位：双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomouirus）。传播途径：主要通过木薯粉虱（Bemisiatabaci）种薯及块茎等传播。非洲木薯花叶病毒的其他
4方法原理
定状进行生物学检测，根据ACMV与抗体之间的特异性反应，对样MV的粒体特性进行免疫电镜观察：根据ACMV核酸保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测，通过电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定。5仪器设备、用具及试剂
5.1仪器设备
透射式电子显微镜、酶联检测仪、电子天平、水浴锅、PCR扩增仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、台式高速冷冻离心机和凝胶成像系统等。5.2用具
可调移液器、移液器头、酶联板、离心管和研钵等。5.3试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。检测试剂见附录B、附录 C、附录D。SN/T1616—2013
实验室检测
木薯种于隔离温室中，待长出苗后取叶片做血清学检测：木薯试管苗及脱毒苗则直接对植袜进行血清学检测（见附录B）。血清学检测结果为阳性的再用生物学测定（见附录C）或免疫电镜观察（SN/T1840）或常规PCR检测（见附录D）或实时荧光PCR检测见附录E）中的一种方法进行复查。结果判定
检测结果符合以下五种方法结果中的两种，即可判定样品为非洲木将花叶病阳性：通过免疫电镜从样品中观察到的病毒粒体与A.5描述的相同：样品血清学检测为阳性；
一生物学测定鉴别寄主反应与C.3措述相吻合：常规PCR检测为阳性：
实时荧光PCR检测为阳性。
样品保存与复核
样品保存
木薯繁殖材料样品妥善保存于4℃冰箱中，试管苗保存于组培室中，以备复核。8.2复核
完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、采样时间，实验的时间，地点，方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。生物学鉴定需有鉴别寄主的症状照片，电镜观察需有病毒粒体照片，血清学检测需有酶联板反应的照片，常规PCR检测需有电泳图片·实时荧光PCR检测需有扩增曲线图片。2
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
非洲木薯花叶病毒背景资料
SN/T1616-2013
自然寄主包括木薯（Manthotesculenta）猪菜藤（Heuuittiasublobata），西阿拉橡胶树（Manthot-glaziouiiD及火焰桑叶麻（Laporteaaestuans)，人工接种可侵染瓜类及烟类等多种植物。A,2病害症状
木薯植株不同生长时期都可以被侵染致病，幼龄植株更易感染，典型症状为系统花叶。感病植株首先在叶片上呈褪绿小斑，逐步扩大，褪绿斑愈合与正常绿色形成花叶。有时受侵叶片背面可见突起。症状严重程度随季节栽培品种不同而异。在潮湿凉爽雨季症状表现得最严重，而夏季通常隐症或浅花叶。见图A.1
注：引自hitp://agripests.cn/中国农业有害生物信息系统.中国农业科学院植物保护研究所图A,1木薯花叶病（左为病叶）
A.3分布地区
肯尼亚、南非、安哥拉、刚果、喀麦隆、贝宁、尼日利亚、中非、加纳、科特迪瓦、布基纳法索、卢旺达、坦桑尼亚，乌干达、塞舌尔、塞内加尔、印度、印度尼西亚（爪哇）、斯里兰卡、巴西及委内瑞拉等。A.4传播方式
木薯粉虱（Bemisiatabaci）为传毒介体，以持久方式传播，并可以保持侵染能力9d，大约1o%的传毒由单头成虫完成。病毒存在于口器中，脱皮仍保留病毒·但不能通过哪传给下一代。嫁接可以传毒，种子不传毒。汁液可以传毒.但传给木薯困难。该病毒通过染病种薯、块茎、组培苗的运输等人为途径进行传播3
SN/T16162013
粒体形态
病毒粒体为双生球状（30nm×20nm），长轴中心线上有一明显的“腰”，每一面都有一明显的五角形，偶尔可见三联体病毒。
基因组
单链环状DNA，二分体.DNA-A长2.779kb.DNA-B长2.724kb。B.1试剂
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠
碳酸氢钠
氯化钾
叠氮化钠
附录B
（规范性附录）
三抗体夹心酶联免疫吸附实验
溶于900mL蒸馏水中，用氢氧化钠调至pH7.4年再用蒸馅水补足1B.1.3洗涤缓冲液(PBST)
吐温-20
样品抽提缓冲液
0.05mol/LTris缓冲液（含0.06mol/L亚硫酸钠+pH8.5）5酶标抗体稀释缓冲液
聚乙烯吡咯烷酮（PVP)
牛清白蛋白
B.1.6底物缓冲液
二乙醇胺
叠氮化钠
用盐酸调至pH9.8，加水至1L。
SN/T1616—2013
SN/T1616—2013
实验步骤
按要求的浓度用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加200将酶联板放在37℃孵育2h~4h。
用PBST加满各孔，然后倒掉，孔向下在滤纸上拍干，再重复两次。取1g待检组织研碎，加人2ml~10ml.的抽提缓冲液·过滤得到待检测样品液分别将稀释到适当浓度的阳性对照、阴性对照和待检样品各200L加人已包被的孔中·为保证实验的准确性，建议每个样品再设一个重复。4℃孵育过夜。
同步骤B.2.3洗板。
用稀释级冲液将抗体（单克隆抗体）稀释到适当浓度，每孔加100L。37℃孵育2h。bZxz.net
同步骤B.2.3洗板。
用结合缓冲液将标有碱性磷酸酶的免抗鼠IgG稀释到适当浓度，每孔加200L37C育2h。
同步骤B.2.3洗板，以确定所有未结合的抗体都被洗掉。按1mg/mL的浓度将对硝基苯磷酸钠济于底物级冲液中（使用前配制并注意避光以防变色）。制成底物济液。
每孔加100μL底物溶液。
室温下孵育30min~60min
在酶联仪405nm波长下检查各孔的吸收值OD。结果判断
B.3.1对照孔的OD4os值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔）应该在质量控制范围内.即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD0值小于0.15，当阴性对照孔的OD5值小于0.05时，按0.05计算：阳性对照OD值/阴性对照OD40值大于5：孔的重复性一致。B.3.2在满足了B.3.1的质量要求后，结果可判定如下：当样品OD/阴性对照OD≥2时，判定结果为阳性；如果是试剂盒，根据试剂盒的说明来判定。1）不同批次的抗体浓度，阴性对照和阳性对照浓度是不一样的，稀释借数要根摄当时批次面定。如果是检测试剂盒，则根据试剂盒的要求而定。6
C.1试材
附录C
（规范性附录）
生物学测定（鉴别寄主及其症状）SN/T1616-—2013
C.1.1鉴别寄主：采用本氏烟（Nicotiana benthamiana）克利夫兰烟（Nicotianaclevelandii）和曼陀罗（Daturastramonium）。先种于隔离温室（30C左右）大花盆中育苗，出苗后移栽至小盆中，长到3～4片叶时用于接种鉴定。
磷酸盐缓冲液（pH=7.4）、硅藻土。C.1.2
病样加1：1的磷酸盐缓冲液，在研钵中研碎。叶面预先撒上少量硅藻土，将病汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶表面。自来水冲洗叶表。
做好标签，置于隔离温室中。
每天观察记载寄主反应。
鉴别寄主的症状表现
C.3.1本氏烟：逐渐扩大的褪绿斑，然后是系统卷叶、畸形和泡斑。克利夫兰烟：褪绿局部斑，然后表现为严重的畸形，不规则的黄脉带和泡斑。C.3.2
曼陀罗：表现为局部的褪绿和坏死斑，然后发展为系统脉带，卷叶和畸形。7
SN/T1616—2013
D.1试剂
D.1.1CTABDNA提取缓冲液（pH8.0)十六烷基三甲基化胺（CTAB）
附录D
（规范性附录）
常规PCR检测方法
乙二胺四乙酸二钠（EDTA0.5mol/L）化钠（NaCI)
1 mol/L Tris-HCI
2-ME（β-巯基乙醇）
加水定容至200ml，调pH至8.0,121℃高压灭菌30min。D.1.2DNA提取其他试剂
三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、双蒸水。D.1.3PCR试剂
TaqDNA聚合酶（5U/μL）、dNTPs(10mmol/L)、10XPCR缓冲液（含Mg2+）、ddH，O。D.1.4TBE缓冲液（5×）
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
硼酸（HBO）
乙二胺四乙酸二钠（EDTA）
加双蒸水定容至500mL
用时加蒸馏水稀释至0.5×TBE。D.1.5溴化乙锭（EB）溶液（10μg/μL）浪化乙锭（EB）
灭菌去离子水
D.1.6引物
引物序列：ACMV-F.5-GKCGAAGCGACCAGGAGAT-3ACMV-R.5-CCCTGYCTCCTGATGATTATA-3\K-G/T.Y=C/T
D.2DNA提取
取叶片样品0.2g于液氮中磨碎，加人600μL的CTABDNA提取缓冲液（65℃预热），混勾后转人1.5mL离心管中，于65℃C温浴30min，不时混匀。用等体积的三氧甲烷/异皮醇（24：1）抽提，4℃8
SN/T1616-—2013
12000r/min离心10min。回收上清液.加人2倍体积的无水乙醇混匀，一70℃放置30min后，4℃12000r/min离心10min。弃上清用70%乙醇液洗涤沉淀两次。37℃干燥后，溶于100μL双蒸水中，一20℃保存备用”。
D.3PCR扩增
PCR反应体系：
见表D.1，每个样品设3个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。检测时以含ACMV的植物材料的DNA或含有ACMV目标片段的质粒作为阳性对照，以健康植物材料或菜豆金色花叶病毒属其他病毒的-DNA-作为阴性对照，以水代替DNA模板作为空白对照。
PCR反应条件：
94℃5min：94C30s，57C30s.72℃45s，30个循环72℃5min延伸表D.1/PCR反应体系
PCR缓冲液
ACMV-F
ACMV-R
Taq酶
DNA模板
补水至
D.4琼脂糖凝胶电泳检测
储存液浓度
10fmol/L.
20gemol/l.
20μmol/L
加样量/uL
终浓度
2.5mmol/L
0.5μmol/L
0.5μmol/L
PCR产物用0.5×TBE级冲液进行1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，将凝胶放人10ug/mL的溴化乙锭（EB）染色液中染色10min～15min。将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察，记录结果。D.5
结果判定
如果阳性对照出现约655bp的条带，检测样品，阴性对照和空白对照未出现条带，可判定样品为ACMV阴性。
如果阳性对照及检测样品出现约655bp的条带，阴性对照和空白对照未出现条带，可判定样品为ACMV阳性。
2）或者按照商品DNA提取试剂盒进行操作。9
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