SN/T 1699-2017.Quarantine protocol for pofcine epidemic diarrhea.
1范围
SN/T 1699规定了猪流行性腹泻的病毒分离鉴定、反转录聚合酶链式反应、实时荧光反转录聚合酶链式反应、直接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验和微量血清中和试验的实验室检疫技术规范。
SN/T 1699适用于进出境猪中猪流行性腹泻的检疫疫情监测和诊断
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PED:猪流行性腹泻( porcine epidemic diarrhea)
PEDV:猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic iarrhea virus )
PBS:磷酸盐缓冲液( phosphate buffer saline)
Vero:非洲绿猴肾细胞
DMEM:一种改良细胞培养液(dulbeco's nodified eagle m edium
CPE:致细胞病变效应(cytopathic ffect)
RT-PCR:反转录聚合酶链式反应(reverse transcription- polymerase chain reaction)
4猪流行性腹泻概述
猪流行性腹泻(PED)是由冠状病毒科(Coronaviridae).冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性高度接触性猪肠道传染病,临床表现呈水样腹泻、呕吐、脱水、运动僵硬和哺乳仔猪高死亡率等特征。各种年龄猪均可感染,其中以1周龄内的哺乳仔猪最为易感。PEDV主要通过被感染猪的粪便或其他病毒污染物传播，自然条件下，PEDV通过口与鼻途径进入猪的体内。PED 的流行无明显季节性,但多在寒冷季节发生。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1699—2017
代替SN/T1699.1—2006，SN/T1699.2—2006,SN/T1699.3—2006猪流行性腹泻检疫技术规范
Quarantineprotocol forpofcine epidemic diarrhea2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1699—2017
本标准代替SN/T1699.1—2006《猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程》，SN/T1699.2—2006《猪流行性腹泻病毒直接免疫荧光试验操作规程》、SN/T1699.3一2006《猪流行性腹泻间接斑点酶联免疫吸附试验操作规程》。
本标准与SN/T1699.1—2006、SN/T1699.2—2006、SN/T1699.3—2006相比，主要技术变化如下：
增加了猪流行性腹泻病毒分离鉴定方法；增加了反转录-聚合酶链式反应方法；增加了实时荧光反转录聚合酶链式反应方法：增加了酶联免疫吸附试验方法，取代间接斑点酶联免疫吸附试验操作规程；修改了直接免疫荧光试验操作规程，采纳NY/T544一2015《猪流行性腹泻诊断技术》中6.2“直接免疫荧光法”，并对其操作步骤进行细化描述；修改了微量血清中和试验操作规程，对推荐采用的细胞系、病毒增殖与毒价测定、对照设置等内容进行了修改和补充。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、华南农业大学、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：陈茹、马保华、马静云、艾青、朱道中、程珏益、秦智锋、杨俊兴、杨健、刘志玲伍绮文、罗琼、段燕喻、孙洁、林志雄、陈兵、王莹、鱼海琼。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1699.1—2006;
—SN/T1699.2—2006;
—SN/T1699.3-—2006。
1范围
猪流行性腹泻检疫技术规范
SN/T1699—2017
本标准规定了猪流行性腹泻的病毒分离鉴定、反转录聚合酶链式反应、实时荧光反转录聚合酶链式反应、直接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验和微量血清中和试验的实验室检疫技术规范。本标准适用于进出境猪中猪流行性腹泻的检疫疫情监测和诊断2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的化是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件
PED：猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea）PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcindemic diarrhea virus)
PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline
Vero：非洲绿猴肾细胞
DMEM：一种改良细胞培养液（dullCPE：致细胞病变效应（cytopathicRT-PCR：反转录聚合酶链式反应（cco's modified eagle medium
ffect)
transcription-po
everse
ddH,O：双蒸水（doubledistilledwater）DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）BSA：牛血清白蛋白（bovineserumalbumin）Ct：荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数FITC：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate）ymera
echain reaction)
ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay）TMB.3，3，5.5-四甲基联苯胺（3.3,5，5-Tetramethylbenzidine）OD：光密度（opticaldensity）TCIDso：半数组织培养感染剂量（tissuecultureinfectivedose）4猪流行性腹泻概述
猪流行性腹泻（PED)是由冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性高度接触性猪肠道传染病，临床表现呈水样腹泻、呕吐、脱水、运动僵硬和哺乳仔猪高死亡率等特征。各种年龄猪均可感染，其中以1周龄内的哺乳仔猪最为易感。PEDV主要通过被感染猪的粪便或其他病毒污染物传播，自然条件下，PEDV通过口与鼻途径进入猪的体内。PED的流行无明1
SN/T1699—2017
显季节性，但多在寒冷季节发生。5实验室诊断技术
5.1病毒分离鉴定
5.1.1器材与设备
CO2培养箱、倒置显微镜、台式冷冻离心机、冰箱；剪刀、镊子、离心管、研钵、0.22μm微孔滤器、细胞培养瓶或细胞培养板
5.1.2试剂与材料
本标准所用水为符合GB/T6682中规定的二级水。除特殊规定外，本标准所用试剂均指分析纯试剂。
0.01mol/LpH7.2PBS缓冲液，Veto传代细胞，DMEM细胞培养液，胰蛋白酶（trypsin）。溶液配制方法见附录A的A.1。
5.1.3操作方法
样品采集与预处理
采集腹泻猪的粪便、死亡病猪的肠道及内容物。取粪样、肠内容物或肠道样品（经剪取处理），按1：5的比例加人DMEM细胞培养液，反复研磨至糊状，将研磨好的病料反复冻融3次，在4℃1000r/min低速离心10min，取上清液；在4℃10000r/min离心10min，取上清液，用0.22μm微孔滤器过滤除菌：将样品滤液分装，立即使用或置一80℃备用。5.1.3.2病毒分离
5.1.3.2.1接种
取长成单层（一般生长1d～2d形成80%以上单层即可）生长良好的Vero细胞，弃去培养液，用0.01mol/LpH7.2PBS缓冲液清洗细胞3次，将上述样品滤液按细胞培养液用量的10%接种到Vero细胞单层，加人含5μg/mL~10μg/mL胰蛋白酶（根据细胞状况等实际情况调整确定具体采用的胰蛋白酶浓度）的DMEM细胞培养液（用量约占接种量的50%），在37℃5%CO培养箱吸附1.5h，期间轻摇3次，根据培养瓶或培养孔大小，添加含5μg/mL～10μg/mL胰蛋白酶的DMEM细胞培养液至常规培养用量。同步设置不接种滤液的正常细胞对照和接种同类阴性猪临床样品的对照。5.1.3.2.2显微镜观察与传代
采用倒置显微镜观察细胞培养物，逐日观察3d～5d；根据致细胞病变效应（CPE）变化情况，按以下操作盲传2代~3代：收集细胞培养物，反复冻融3次，在4℃8000r/min离心10min，取上清液，用0.22uμm微孔滤器过滤除菌，再按上述同样操作进行接种和传代。其特征性CPE是细胞面粗糙、颗粒增多，部分细胞核逐渐融合，形成合胞体，并可见空斑样小区，细胞逐渐脱落。5.1.3.3病毒鉴定
收集上述病毒分离培养物，采用常规RT-PCR、实时荧光RT-PCR或直接免疫荧光试验等方法（见5.2~5.4中有关细胞培养物的内容）进行PED病毒检测鉴定，出现阳性结果即可判定为PED病毒分离鉴定阳性。
5.2常规RT-PCR
5.2.1设备与器材
SN/T1699—2017
PCR仪、恒温水浴箱，烘箱，台式冷冻离心机（离心转速可达到12000r/min以上），振荡混匀器，电泳仪，凝胶成像仪或紫外透射仪，冰箱（2℃～8℃、一20℃、一80℃），微量移液器（10μL、100mL1000μL）及配套吸嘴，微量离心管，微量PCR反应管。RNA操作所涉及的耗材使用无RNA酶产品。5.2.2试剂
本标准所用水为符合GB/T6682中规定的二级水。除特殊规定外，本标准所用试剂均指分析纯试剂。
TRIzol试剂，三氯甲烷，异丙醇，乙醇，Taq酶，逆转录酶（RTase），核糖核酸酶（RNase）抑制剂，dNTPs混合物（dATP、dTTP、dCTP和dGTP各1ommol/L），无核酸酶水（DNase，RNase-freeddHO，可用商品化产品，或采用DEPC处理水），DNA标准分子量（DNAMarker），DNA上样缓冲液，Goldview或其他等效核酸染料，琼脂糖，TAE电泳缓冲液。溶液与试剂配制方法见附录A中A.25.2.3RT-PCR扩增引物
上游引物：5*-CAGCATCCTTATGGCTTGC-3”；下游引物：5-AGCATTGACTGAACGACCAAC-3'采用无核酸酶水将每条引物配制成100μmol/L。储存液，置一20℃以下冻存；使用时，取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融，5.2.4样品采集、预处理、核酸提取5.2.4.1样品采集与预处理
猪粪样、肠道及其内容物等临床样品的采集及预处理操作方法同5.1.3.1。细胞培养物样品的预处理方法：收集病毒分离或接种病毒的细胞培养物，反复冻融3次，在4℃8000r/min离心10min，取上清液。5.2.4.2核酸提取
取上述待检样品上清液200μL置于灭菌微量离心管（1.5mL)中，加人600μLTRIzol试剂，反复颠倒混匀后室温静置15min。短暂离心以收集管壁液滴，加人200μL三氯甲烷，震荡混勾，室温静置5min。4℃12000r/min离心15min。吸取上清液至另一洁净1.5mL离心管中，加人等体积异丙醇，上下颠倒混匀后室温静置10min。4℃12000r/min离心15min。倒掉上清液，加人75%乙醇1mL，上下颠倒洗涤离心管。4℃12000r/min离心10min，吸弃上清液，将离心管倒扣在吸水纸上自然晾干。加人50μL无核酸酶水，室温静置5min，短暂离心以收集管壁液滴。纯化核酸溶液可直接用于后续检测，或存于低温备用（一20℃以下）。也可采用经验证可靠的病毒核酸提取纯化试剂盒进行核酸提取，参照说明书进行操作。5.2.5RT-POR检测
5.2.5.1对照设置
从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照。SN/T1699—2017
明性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照空白对照：在扩增反应阶段设置，以无核酸酶水作为模板设置空白对照。5.2.5.2扩增试剂准备
采用50μL反应体系，含以下组分：dNTPs（dATP、dTTP、dCTP和dGTP各200μmol/L），20mmol/LTris-HCl(pH8.8)25mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2，上、下游引物各o.2μmol/L，Tag酶1U~2U.M-MLV逆转录酶100U.10μL模板根据上述反应体系，按照每个反应40μL的用量配制RT一PCR预混反应液，用无核酸酶水补足反应体积。需配制的RT-PCR预混反应液数量=样品个数十对照个数十1。将以上RT-PCR反应试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混勾，然后在每个微量PCR反应管中分装40μL可采用一步法RT-PCR反应试剂配制RT-PGR反应体系，以含倍预混反应缓冲液（2Xonestep
buffer）的商品化一步法RT-PCR反应试剂为例，可按表1加样配制RT-PCR预混反应液。表1采用一步法RT-PCR反应试剂加样表（常规RT-PCR）试剂
2X one step buffer
上游引物（10μmol/
下游引物（10pmol/L
RTase/TaqEnzymen
RNase-free ddH,O
5.2.5.3加模板
在每管已分装有40μLRT-
C-PCR预混反应液的微量PCR
阳性对照、阴性对照、空白对照模板各5.2.5.4RT-PCR扩增检测
每管用量/L
反应管中，分别对应加人待检样品核酸、L，充分混匀，
盖上管盖
将已完成加样的PGR反应管放入PCR仪，扩增反应条件设定：5℃反转录30min，94℃预变性
℃10min。
0S.40个循环：72
2min；94℃变性30s，60℃退火
30s.72℃延伸20
5.2.5.5电泳检测
用新鲜配制的1×TAE电泳缓冲液配制2%琼脂糖凝胶，采用Goldview或其他等效核酸染料，按说明书使用。取适量扩增产物液进行电泳检测，设DNAMarker同步电泳；采用5V/cm~8V/cm，电泳1h，用凝胶成像仪或紫外透射仪观察，拍照记录检测结果。5.2.5.6结果分析与判定
在质控有效的前提条件下进行结果判定。阴性对照、空白对照应无特异扩增产物，阳性对照应有分子量为328bp的特异扩增产物。否则，本次实验无效阳性结果判定：待检样品呈现分子量为328bp的特异扩增产物，判为RT-PCR检测阳性。阴性结果判定：待检样品未呈现特异扩增条带，判为RT-PCR检测阴性。5.2.5.7RT-PCR检测结果的确证
必要时可对RT-PCR扩增产物进行测序确证。将所测得的扩增产物序列与GenBank收录的SN/T1699—2017
PEDV序列（参见附录B）进行比较，序列吻合（扩增区全序列比对同源性达95%以上）表明确证为阳性。5.3实时荧光RT-PCR
5.3.1仪器与耗材
荧光PCR仪，微量移液器（10μL、100μL、1000μL)及配套吸嘴，微量离心管，PCR光学管及管盖。RNA操作所涉及的耗材使用无RNA酶产品。5.3.2试剂
5.3.2.1引物与探针
PEDV特异的实时荧光RT-PCR扩增引物与探针序列如下上游引物：5-AACGCTAACACTCCTTAG-3：下游引物：5\-GAAGCATTGACTGAACGAC-3探针：5-TGTACGCCAGTAGCAACCTTATAGCC-3探针5'端标记FAM报告荧光基团，3'端标记BHQ-1淬火基团。可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选定报告荧光基团和淬灭基团采用无核酸酶水将每条引物与探针配制成100umol/L储存液，置配制成10μmol/L工作液，避免多次东融5.3.2.2PEDV荧光RT-PCR反应液
含50mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCl(pH8.8HGTP客
0.2mmol/LdNTPs(dATP.dTTPdCTP和d0.12μmol/L
Taq DNA聚合酶
M-MLV逆转录酶
5.3.3操作方法
样品采集、预处理、核酸提取
同5.2.4。
2对照设置
从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照。阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照。阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。20℃以下冻存；使用时取适量
，3mmol/LMgCl20.1mg/mLBSA，4%甘油，0.2mmol/L)
、下游引物各0.2μmol/L，探针空白对照：在扩增反应阶段设置，以无核酸酶水作为模板设置空白对照。5.3.3.3扩增试剂准备
采用25μL反应体系，含以下成分：50mmol/LKCl，10mmol/LTris-HCl（pH8.8），3mmol/LMgClz，0.1mg/mLBSA，4%甘油，0.2mmol/LdNTPs，上、下游引物各0.2μmol/L，探针0.12μmol/L，TaqDNA聚合酶1U,M-MLV逆转录酶50U,10μL核酸模板。取出PEDV荧光RT-PCR反应液等试剂，室温融化（Taq酶、逆转录酶除外），瞬时离心后置冰上。5
SN/T1699—2017
根据上述反应体系，按照每个反应15μL的用量配制荧光RT-PCR预混反应液，用无核酸酶水补足反应体积，见表2。需配制的荧光RT-PCR预混反应液数量三样品个数十对照个数十1。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混勾，然后在每个PCR光学管中分装15μL表2PEDV荧光RT-PCR反应体系配制加样表试剂
PEDV荧光RT-PCR反应液
Taq酶
M-MLV逆转录酶
每管用量/μL
可采用一步法RT-PCR反应试剂配制反应体系，该试剂需经验证适合荧光RT-PCR反应。以含2倍预混反应缓冲液（2×onestepbuffer）的商品化一步法RT-PCR反应试剂为例，可按表3加样配制荧光RT-PCR预混反应液。
表3采用一步法RT-PCR反应试剂加样表（荧光RT-PCR）试剂
2Xone step buffer
上游引物（10μmol/L）
下游引物（10pmol/L）
探针（10μmol/L）
RTase/Taq Enzymemix
RNase-free ddH,O
5.3.3.4加模板
每管用量/μL
在每管已分装15uL荧光RT-PCR预混反应液的PCR光学管中，分别对应加人待测样品阳性对照、阴性对照或空白对照模板各10μL，混勾，盖上管盖，放入荧光PCR仪内，记录样品放置顺序。5.3.3.5实时荧光RT-PCR扩增反应第一阶段：42℃反转录15min，95℃预变性3min；第二阶段：95℃变性10s，60℃退火40s.40个循环：60℃设置采集荧光。荧光素设定：报告荧光（ReportDye）设为FAM（或按探针实际标记的荧光基团设定），淬灭荧光（QuenchDye）设为None，校准荧光（Referencedye）设为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。
5.3.4分析条件设定
综合分析仪器给出的各项结果，基线（baseline）以及仪器给出的默认值作为参考，阈值（Threshold）设定原则以阅值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为原则，具体还需根据仪器噪音情况进行调整：选择FAM通道进行分析。5.3.5结果分析及判定
在质控有效的前提条件下进行结果判定。阴性对照和空白对照应为阴性，Ct≥40.0（Ct值显示为6
SN/T16992017
None或40.0），阳性对照应Ct<35.0.且呈现S型典型扩增曲线，否则，此次实验视为无效。阳性结果判定：检测结果，样品Ct35.0、且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光RT-PCR检测阳性反应。
阴性结果判定：检测结果，样品Ct≥40.0、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光RTPCR检测阴性反应。
对于355.4直接免疫荧光试验
5.4.1器材与设备
荧光显微镜、冷冻切片机、台式离心机、温箱、剪刀、眼科镀子、培养血载玻片、盖玻片、滴管、染色缸等。
5.4.2试剂
5.4.2.1水与化学试剂：本标准所用水为符合GB/T6682中规定的二级水。除特殊规定外，本标准所用试剂均指分析纯试剂。
5.4.2.2PED荧光抗体：结合了异硫氰酸荧光素（FITC）的抗PEDV抗体。由权威机构提供5.4.2.3
PEDV阳性对照样品：PEDV阳性猪肠组织样品、或传代细胞增殖病毒样品。5.4.2.41
PEDV阴性对照样品：健康猪肠组织样品，或正常传代细胞样品。5.4.2.50.01mol/LpH7.2PBS缓冲液：配制方法见附录A的A.1。50.1%伊文思蓝原液：配制方法见附录A的A.3。5.4.2.6
磷酸盐缓冲甘油：配制方法见附录A的A.3。丙酮。
标本片的制备
组织标本
采集急性期内（5d~7d）患猪空肠中段的黏膜上皮做涂片，或采集肠段做冷冻切片（4μm～7μm），置预冷的丙酮中固定10min，置0.01mol/LpH7.2PBS缓冲液中浸泡10min~15min，风干或自然干燥5.4.3.2细胞培养玻片
可在接种时放置洁净无菌的玻片来制备。将病毒分离细胞培养（24h～48h）的玻片及其阳性、阴性对照玻片置0.01mol/LpH7.2PBS缓冲液中冲洗数次，置预冷的丙酮中固定10min，再置于0.01mol/LpH7.2PBS缓冲液中浸泡10min~15min，取出，风干。5.4.4荧光抗体染色
用0.02%伊文思蓝溶液将PED荧光抗体稀释至工作浓度（1：8以上合格）。4000r/min离心10min，取上清液滴于标本上。37℃恒温恒湿染色30min，用0.01mol/LpH7.2PBS缓冲液漂洗3次，依次为3min、4min、5min，风干，滴加磷酸盐缓冲甘油，盖玻片封固，置荧光显微镜下检查。5.4.5结果判定
判定标准：在荧光显微镜下检查，被检标本的细胞结构应完整清晰，并在阳性、阴性对照均成立时判SN/T1699—2017
定。在胞浆中见到特异性苹果绿色荧光判定为阳性，如所有细胞浆中无特异性荧光判定为阴性。可根据细胞内荧光亮度强，弱分别做如下记录：a）十十十十：呈闪亮苹果绿色荧光；b）十十十：呈明亮苹果绿色荧光；c）十十：呈一般苹果绿色荧光
d）十：呈较弱绿色荧光：
e）一：呈红色。
检测结果为a)～d)者均判为阳性；检测结果为e)者判为阴性。酶联免疫吸附试验（ELISA）
5.5.1试剂盒方法
本标准推荐采用加拿大Biovet?试剂盒方法5.5.2设备与器材
配备450nm滤光片的酶标仪、洗板机、冰箱、恒温箱、水浴箱、单道和多道微量移液器及配套吸嘴、微量离心管，量简，烧杯。
5.5.3试剂
本标准所用水为符合GB/T6682中规定的级水下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂包被PEDV抗原的酶标板（板条可拆卸）、PEDV抗体阳性对照血清、PEDV抗体阴性对照血清、稀释缓冲液、洗涤液、生物素标记的抗猪1gG抗体（标记抗体，结合物A）、链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物（结合物B）、底物液（TMB柠檬酸盐缓冲液）、终止液（1mol/L硫酸溶液）。所有试剂保存在2℃~7℃。溶液配制方法见附录A的
5.5.4样品采集
且清分装.置4℃保存。
无菌条件下静脉采集猪血，分离血5.5.5操作方法
5.5.5.1准备工作
将所有试剂在使用前恢复至室温。对照血清、稀释缓冲液、洗涤液在2℃～7℃储存时可能会形成结晶，但这不会影响产品的性能。使用前将这些溶液恢复至室温，结晶就会溶解。如果溶解不了，置37℃水浴30min，使用前充分混匀。将洗涤液用水稀释至使用浓度（1×），稀释后的洗涤液（1×）可在2℃～7℃储存1周。用稀释缓冲液将猪血清样品稀释200倍（例如：用796μL稀释缓冲液稀释4pL样品）。5.5.5.2加样
根据待检样品数量，取出足量的酶标板或板条。将每份经200倍稀释的猪血清样品加人两孔，每孔100L：将阴性血清对照，阳性血清对照分别加人两孔，每孔100L。记录样品和对照血清分布的位置。封板，置（23士2）℃C孵育60min。用1×洗涤液洗涤4次，每次每孔用300L1×洗涤液：最后一次该试剂盒产品由加章大Biovet?公司生产。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的1
唯一认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。8
洗涤后，在吸水纸上拍干酶标板。可用自动化洗板机完成洗涤操作。5.5.5.3加标记抗体（结合物A）预先将结合物A用稀释缓冲液稀释至工作浓度。SN/T1699—2017
每孔加入100pL稀释到工作浓度的结合物A，封板，置（23土2)℃孵育60min。用1×洗涤液洗涤4次；每次每孔用300μL1×洗涤液，最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干酶标板。5.5.5.4加链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物（结合物B）预先将结合物B用稀释缓冲液稀释至工作浓度。每孔加人100uL稀释到工作浓度的结合物B。封板，置S（23±2）C孵育60min。用1×洗涤液洗涤4次，每次每孔用300μL1×洗涤液：最后一次洗涤后，在吸水纸上拍干酶标板。5.5.5.5显色反应
每孔加100μL底物液。（23士2）℃避光孵育约105.5.5.6终止反应
每孔加入100μL终止液，
5.5.5.7OD值测定
设测定波长为450nm，用酶标仪读取各孔的光密度值（OD450）490nm。在加人终止液后15min内读数5.5.5.8质量控制与结果判定
S/P比值计算。按以下公式计
算对照血清和样品的S
S/P值=（样品OD450值一阴性对照D450值）/（阳性对照OD50
对应两孔OD
公式中对照和样品的OD450值均为其如果酶标仪配有参照滤光片，设为宜
值的平均
前提是必须符合以下条
质量控制。检测结果有效的前
件：阴性对照的
照的OD45o校正值（阳性对照OD450平均值减去阴性对照
阴性对照OD450值）
OD50平均值小于0.40：阳性对
平均值后
获得的数值）大于0.70
结果判定。在质量控制成立的前提条件下，样品的S/P值Www.bzxZ.net
判为阴性：样品0.35≤S/P值<0.40判为可疑，可样品应重性，S/P值<0.40判为阴性。
5.6微量血清中和试验
5.6.1设备与器材
判为阳性：样品的S/P值<0.40
次，重检后的S/P值≥0.40判为阳COz培养箱、倒置显微镜、振荡混匀器、单道和多道微量移液器及配套吸嘴、96孔微量平底培养板细胞培养瓶、微量离心管。
5.6.2材料与试剂
5.6.2.1PEDV病毒：采用权威机构提供的毒株。5.6.2.2Vero传代细胞。
标准阳性血清：PEDV抗体中和效价不低于1：32.由权威机构提供，按说明书使用5.6.2.3
标准阴性血清：不含PEDV抗体的健康猪血清，由权威机构提供，按说明书使用。9
SN/T1699—2017
5.6.2.5DMEM细胞培养液。
5.6.2.6胰蛋白酶。
5.6.3样品采集
无菌条件下静脉采集猪血，每头份待检血清不少于1mL，分离血清，分装，置4℃暂存。长期保存需置-20℃
5.6.4操作方法
5.6.4.1病毒增殖
将PEDV病毒液接种到Vero单层细胞上，加人胰蛋白酶使其终浓度达到5μg/mL~1oμg/mL（根据细胞状况等实际情况调整确定具体采用的胰蛋白酶浓度），摇勾后置5%CO2培养箱，37℃吸附1h，吸附期间摇勾一次，吸弃悬液，然后加人含胰蛋白酶的DMEM细胞培养液，置5%CO?培养箱培养。逐日观察CPE，当CPE达到75%以上时收获，反复冻融三次后，收取病毒悬液，在3000r/min离心10min，取上清液，分装，置一70℃保存备用。5.6.4.2毒价测定
在微量离心管中，用含5μg/mL~10μg/mL胰蛋白酶的DMEM细胞培养液将PEDV病毒液作10倍梯度稀释，稀释成10-1～10-或更高稀释度。将稀释好的病毒液接种到长成单层Vero细胞的96孔微量平底培养板中，每一稀释度接种8孔，每孔接种50μL，37℃吸附1h，每孔加人150μL含胰蛋白酶的DMEM细胞培养液，置5%CO培养箱培养。同步设正常细胞对照（即用含胰蛋白酶的DMEM细胞培养液替代PEDV病毒液，其余操作相同），正常细胞对照作8孔16孔。逐日观察CPE并记录结果，一般需观察至5d。按Reed-Muench两氏法计算病毒毒价（TCIDso），参见附录C。5.6.4.3血清处理
将待检猪血清、标准阳性血清和标准阴性血清置56℃水浴箱，灭活30min。5.6.4.4中和试验操作
5.6.4.4.1血清稀释
取已灭活的待检血清，用含5μg/mL～10μg/mL胰蛋白酶的DMEM细胞培养液作为稀释液，在96孔微量平底培养板中进行一系列倍比稀释，稀释成1：2～1：64。将各稀释度血清加到96孔微量平底培养板中，每个稀释度加3孔，每孔加50μL，第一孔作为血清毒性对照，第二，三孔作为正式实验孔。病毒回归试验和其他各项对照可采用另一块微量板进行。5.6.4.4.2血清中和与接种细胞
根据测得的毒价，用含5μL/mL～10μg/mL胰蛋白酶的DMEM细胞培养液将PEDV病毒液稀释成每50μL中含100TCIDso的工作浓度，然后加人上述已加有稀释待检血清的微量板中，每孔加50μL；血清毒性对照孔不加病毒液，改为加人50μL含胰蛋白酶的DMEM细胞培养液；置5%COz培养箱中，37℃中和1h。取上述完成中和反应的血清与病毒混液（每孔共100μL），接种到长成单层Vero细胞的96孔微量平底细胞培养板中，37℃吸附1h；然后每孔补加100μL含胰蛋白酶的DMEM细胞培养液。置5%CO2培养箱中，37℃培养，每天观察CPE，72h~96h判定结果。按5.6.4.4.3同步设对照，按5.6.4.4.4同步做病毒回归试验。10
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