SN/T 1150-2015
基本信息
标准号： SN/T 1150-2015
中文名称：南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1150-2015.Detection and identification of Arabis mosaic virus.
1范围
SN/T 1150规定了南芥菜花叶病毒的生物学测定、血清学检测、免疫电镜、RT-PCR检疫鉴定方法。
SN/T 1150适用于进出境植物种子苗木等繁殖材料和植物产品中南芥莱花叶病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T28073南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法
SN/T 1840植 物病毒免疫电镜检测方法
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3基本信息
学名:Arabis mosaic virus
缩写: ArMV
分类地位:豇豆花叶病毒科(Comoviridae) ,线虫传多面体病毒属(Nepovirus)。其他信息参见附录A.
4原理和方法
依据ArMV鉴别寄主的症状、病毒形态、免疫学特性及分子生物学特性进行检测判定。
5仪器设备用具及设施
5.1 仪器设备
天平(感量1/10000g)、pH计、酶标仪、透射电子显微镜PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、离心机、超低温冰箱等。
5.2 用具
微量移液器、研钵、离心管、花盆、消毒土等。
5.3 设施
植物隔离检疫温室。
1范围
SN/T 1150规定了南芥菜花叶病毒的生物学测定、血清学检测、免疫电镜、RT-PCR检疫鉴定方法。
SN/T 1150适用于进出境植物种子苗木等繁殖材料和植物产品中南芥莱花叶病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T28073南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法
SN/T 1840植 物病毒免疫电镜检测方法
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3基本信息
学名:Arabis mosaic virus
缩写: ArMV
分类地位:豇豆花叶病毒科(Comoviridae) ,线虫传多面体病毒属(Nepovirus)。其他信息参见附录A.
4原理和方法
依据ArMV鉴别寄主的症状、病毒形态、免疫学特性及分子生物学特性进行检测判定。
5仪器设备用具及设施
5.1 仪器设备
天平(感量1/10000g)、pH计、酶标仪、透射电子显微镜PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、离心机、超低温冰箱等。
5.2 用具
微量移液器、研钵、离心管、花盆、消毒土等。
5.3 设施
植物隔离检疫温室。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1150—2015
代替SN/T1150—2002
南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Arabis mosaic virus2015-12-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1150—2015
本标准代替SN/T1150—2002《南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法》。与SN/T1150—2002相比，主要技术变化如下：
增加了RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法的内容。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局本标准主要起草人：吴际云、陈枝楠、郑耘、张伟锋、卢小雨、冯建军、王红英、龙海、李芳荣、胡运发、邓琼、邓丛良。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1150-2002。
1范围
南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法
SN/T1150—2015
本标准规定了南芥菜花叶病毒的生物学测定、血清学检测、免疫电镜、RT-PCR检疫鉴定方法。本标准适用于进出境植物种子苗木等繁殖材料和植物产品中南芥莱花叶病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T28073南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法SN/T1840
植物病毒免疫电镜检测方法
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3基本信息
学名：Arabismosaicuirus
缩写：ArMV
分类地位：豆花叶病毒科（Comouiridae），线虫传多面体病毒属（Nepouirus）。其他信息参见附录A。4原理和方法
依据ArMV鉴别寄主的症状、病毒形态、免疫学特性及分子生物学特性进行检测判定。仪器设备用具及设施
仪器设备
天平（感量1/10000g）、pH计、酶标仪、透射电子显微镜、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、离心机、超低温冰箱等5.2
微量移液器、研钵、离心管、花盆、消毒土等，5.3
植物隔离检疫温室。
6试剂
DAS-ELISA检测试剂（见附录B）、RT-PCR检测试剂（见附录C）、生物学测定试剂（见8.5）。免疫1
SN/T1150—2015
电镜检测试剂按照SN/T1840的规定执行，实时荧光RT-PCR检测试剂按照GB/T28073的规定执行。
7样品制备
7.1种子类
抽样按照SN/T2122的规定执行
将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于25℃左右生长并进行症状观察。待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组)并编号。7.2苗木类
抽样按照SN/T2122的规定执行。将苗木种植于隔离温室中，于25℃左右生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法同7.1。
检测方法
8.1DAS-ELISA检测
方法见附录B。
免疫电镜检测
按照SN/T1840的规定执行。
8.3RT-PCR检测
方法见附录C
8.4实时荧光RT-PCR检测
按照GB/T28073的规定执行。
8.5生物学测定
8.5.1接种
病叶加1：1（质量：体积）的磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.2)于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均勾酒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面。8.5.2鉴别寄主症状
对经DAS-ELISA检测出的阳性样品植株，采其叶片，加人适量样品提取缓冲液研磨后的汁液，在室温（20℃～25℃）条件下，用摩擦接种法接种栽种于检疫隔离温、网室中的昆诺藜或色藜、黄瓜、“Prince”菜豆、矮牵牛和番杏等鉴别寄主植物。昆诺藜（Chenopodiumquinoa）或苋色藜（C.amaranticolor）：接种后4d~6d接种叶出现局部褪绿斑，然后出现系统褪绿斑驳。
黄瓜（Cucumissatiuus）：接种子叶5d～7d后出现局部褪绿斑或小型坏死环斑或黄斑，后出现系统环线脉，畸形。
SN/T1150—2015
“Prince\菜豆（PhaseolusUulgariscv.Prince)：接种5d～7d后表现为局部褪绿、坏死或畸形。矮牵牛（Petumia hybrida）：接种叶出现局部枯斑或坏死环斑，接着表现系统褪绿环斑或线纹或明脉。
番杏（Tetragoniaerpensa）：接种3d～7d后接种叶出现细轮纹，后表现环斑。9结果判定
DAS-ELISA检测为阳性后，RT-PCR或免疫电镜检测结果为阳性可判定检出黄瓜花叶病毒。如果上述方法还不能判定检测结果，可进行生物学测定，并进行复验。若DAS-ELISA检测为阴性，则判定为未检出该病毒。
样品和档案保存
样品保存
经检测确定携带ArMV的样品在合适的条件下保存。种子保存在4℃，病株在一20℃或者一70℃冰箱中保存，提取的RNA样品若需长期保存应放置于一70℃冰箱。做好标记和登记工作。2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、登记时间、实验地点、检测方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。DAS-ELISA检测需有试验的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果，实时荧光RTPCR需有数据和图片，免疫电镜观察需有病毒粒体照片，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片。SN/T1150—2015
A.1粒体形态
附录A
（资料性附录）
生物学特性
ArMV为等轴多面体球状病毒，直径为30nm。A.2基因组
ArMV为单链RNA病毒，基因组由两条单链正义RNA组成，RNA1为7.3kb，RNA2为3.8kb，多个分离物的基因组已被测序，各分离物之间序列同源性很高。A.3寄主范围
ArMV可侵染174属215种植物。主要为害的作物有大麻（Cannabissatiua），啤酒花（Humuluslupulus）、黄瓜（Cucumissatius）、西葫芦（Cucurbitapepo）、莴苣（Lactucasativa），草莓（Fragaiaananassa）葡萄（Vitisvinifera），香石竹（Dianthus caryophyllus），水仙（Narcissustazetta），蔷薇（Rosamultiflora）、草木棍（Melilotussuaveolens）、郁金香（Tulipagesneriana）、芹菜（Apiumgraveolens），薄荷（Menthasppiperita），丁香（Syringaoblata），大豆（Glycinemar），甜菜（Betavulgaris），马铃薯（Solanumtuberosm），烟草（Nicotianatabacum），番茄（Lycopericonesculentum），菜豆（Phaseolusvulgaris），紅豆（Vignaunguiculata），蚕豆（Viciafaba），豌豆（Pisumscatwum）、甜瓜（Cucumismelo）、花椰菜（BrassicaoleraceaL.var.botrytis）、菠菜（Spinaciaoleracea），胡萝卜（Daucuscarota）等。
A.4病害症状
ArMV引起的最常见症状是叶片斑驳和脱落、植株矮化、严重畸型、耳突。症状随着寄主植物、病毒的分离物、裁培条件，季节和年份的不同而改变。有时候ArMV的侵染是隐症的，并不会在寄主植物上表现症状。
ArMV侵染不同寄主后表现的如下症状：葡萄上表现“软皮”和茎沟槽症状；草莓上表现花叶和黄化皱缩；黄瓜上病叶表现黄色斑点，绿色部分呈不正常的黑色；莴苣表现为矮化、褪绿、坏死和心部退化；啤酒花根部表现为不正常的黑色，且叶子变小；树番茄上早春表现为轻微褪绿环斑驳，以后随着季节的延续逐渐消失，果实症状为黄色褪绿斑驳：欧洲白蜡树的叶子上表现为褪绿斑驳，叶形呈锯齿状或栎树叶状；烟草表现环斑，叶片缺刻破损，心叶卷曲。A.5分布地区
欧洲：奥地利、白俄罗斯、比利时、保加利亚、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦、芬兰、法国、德国、匈牙利、爱尔兰、意大利、拉脱维亚、立陶宛、卢森堡公国、摩尔多瓦、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、斯洛文尼亚，瑞典、瑞士，英国，乌克兰和南斯拉夫。4
亚洲：日本、哈萨克斯坦、土耳其、伊朗。非洲：南非。
北美洲：加拿大、美国。
大洋洲：澳大利亚、新西兰。
传播方式
SN/T1150—2015
ArMV可通过汁液摩擦接种、种苗和介体线虫传播。通过种子传播的寄主：莴苣（L.sativa）、松草莓（F.ananassa）大豆（G.ma），甜菜（B.vulgarisvar.saccharifera），番茄（L.esculentum）等，通过块茎传播的寄主：马铃薯（S.tuberosm）等；通过鳞球茎传播的寄主：水仙（N.tazetta）、郁金香（Tulipagesneriana）百合（Liliumbroruniivar.colchesteri）等；通过苗木传播的寄主：葡萄（V.vinifera）、草莓（F.ananassa），啤酒花（H.lupulus）、香石竹（D.caryophyllus）、蔷薇（R.multiflora）等。传播介体主要为异尾剑线虫（Xiphinemadiversicaudatum）。5
SN/T1150—2015
B.1试剂
B.1.1包被缓冲液（pH9.6）
附录B
（规范性附录）
DAS-ELISA检测
将碳酸钠（NazCOs）1.59g、碳酸氢钠（NaHCO）2.93g、叠氮钠（NaN.)0.2g溶解于1000mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH值至9.6，并储存于4℃。B.1.2磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）将氯化钠（NaCI)8g、磷酸二氢钾（KHzPO.)0.2g、磷酸氢二钠（NazHPO4)1.15g、氯化钾（KCI）0.2g、叠氮钠（NaNs)0.2g溶解于900mL蒸馏水，用浓盐酸（HCI)调节pH值到7.4，加水定容至1L。B.1.3PBST缓冲液
将氯化钠（NaCI)8g、磷酸二氢钾（KHzPO.)0.2g、磷酸氢二钠（NazHPO4）)1.15g、氯化钾（KCl）0.2g、吐温-20（Tween-20)5mL溶解于1000mL蒸馏水中。B.1.4样品提取缓冲液（pH7.4）将亚硫酸钠（NazSO：)1.3g、聚乙烯基吡咯烷酮（MW24~4000.PVP）20g、叠氮钠（NaN:)0.2g、吐温-20（Tween-20)20mL溶解于1000mLPBST，用浓盐酸（HCI）调节pH值至7.4，并储存于4℃。B.1.5酶标结合物缓冲液
将PBST缓冲液800mL小牛血清白蛋白（BSA)2g、PVP（MW24～4000，PVP）20g、叠氮钠(NaNs)0.2g加蒸馏水定容至1000mL，并储存于4℃。B.1.6底物缓冲液
将二乙醇胺97mL、叠氮钠（NaN.)0.2g溶解于1000mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调整pH值至9.8，并储存于4℃
B.2操作步骤
B.2.1包被
按照检测试剂盒说明操作。或用包被缓冲液稀释ArMV抗体（如1：200），向微孔板中每孔加人100μL包被抗体溶液，37℃下孵育2h～4h或4℃下包被过夜。B.2.2捕获抗原
弃去孔中的抗体包被溶液，用PBST洗4次～5次。加入100μL样品提取液到酶标板的孔中，每个样品重复2个，并设置阳性和阴性对照。37℃下孵育2h或4℃下孵育过夜，6
B.2.3加入酶标抗体
SN/T1150—2015
按照检测试剂盒说明操作。用酶标抗体缓冲液按比例稀释相应的酶标抗体（如1：200）。弃去孔中的检测样品提取液，用PBST洗4次～5次孔。每孔加人100μL酶标抗体溶液。在室温下孵育2h。B.2.4加底物
加人底物缓冲液将硝基苯磷酸二钠盐（p-nitrophenylPhosphate，pNPP）配制成浓度为1mg/mL的底物溶液。弃去酶标抗体溶液，用PBST洗4次～5次。每孔加人100μL新配制的底物溶液。室温下避光放置30min～60min，待阳性对照孔明显显色。B.2.5吸光值的测定
用酶标仪在405nm处读取吸光值。B.3结果判定
通过酶标仪上405nm的OD值来判定。对照孔的OD405值（空白对照、阴性对照及阳性对照）应该在质量控制范围内，即：空白对照和阴性对照的OD405值<0.15，当阴性对照孔的ODas值<0.05时，按0.05计算。阳性对照有明显的颜色反应；孔的重复性基本一致。在满足了该要求后，结果原则上可判断如下样品ODaos值/阴性对照ODaos值明显2，判为阳性。样品OD405值/阴性对照OD405值明显<2，判为阴性。样品OD40s值/阴性对照OD405值在阅值附近，判为可疑样品，应重新做一次，或用其他方法加以验证。
SN/T1150—2015bzxZ.net
c.1试剂
C.1.1RNA提取试剂
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
TRIzol试剂、三氯甲烷、异丙醇、70%乙醇。C.1.250×TAE
冰醋酸
NazEDTA·2H0
加去离子水定容至1L。用时加水稀释至1XTAE。C.1.36×加样缓冲液
溴酚蓝
煎糖水溶液
C.2试验步骤
总RNA提取
400g/L
称取样品o.1g，液氮充分研磨。加人1mLTrizol，混勾，倒人1.5mL离心管中。加人0.2mL三氯甲烷，剧烈振荡15s，4℃条件下12000g离心10min，小心吸取上层水相至新离心管中。加人等体积异丙醇，混勺，一20℃静止10min，4℃条件下12000g离心15min，弃上层水相。加1mL75%乙醇，重悬沉淀，4℃条件下8000g离心10min，弃上层乙醇相，干燥沉淀。加人30μLDEPC-H.O，置于50℃条件下5min溶解沉淀，存于一80℃条件下备用。或按照供应商推荐的试剂盒抽提RNA。C.2.2RT-PCR反应
ArMV的特异性引物及其序列见表C.1，位于RNA2的CP基因上，预计扩增产物大小为694bp。表C.1RT-PCR的引物和序列
引物名称
ArMV-F
ArMV-R
引物序列
5'-CAAGTTTCTGACTATCCCACC-3
5'-TTCCAAATCCCACATTACCT-3
在GenBank上的基因序列登录号。8
在AB279740.2°上的位置
2534-2554
3208-3227
cDNA合成
SN/T1150--2015
按表C.2列出的组分制备RT反应混合液20μL。反应条件为：25℃温育10min，42℃反转录1h，95℃处理2min~3min。
试剂名称
模板RNA
反向引物（20μmol/L）
5XAMV缓冲液
dNTP(10mmol/L)
AMV反转录酶（5U/μL)
RNA酶抑制剂(40U/μL)
DEPC处理过的H20
反应程序
cDNA合成反应体系
加样量/μL
将表C.3列出的组分加人PCR反应管中，充分混匀后进行PCR反应：94℃变性30S，57℃复性30s.72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。表C.3
试剂名称
10×PCR反应缓冲液
氯化镁（MgCl）
ArMV-F
ArMV-R
Taq酶
补加水至总体积
琼脂糖电泳
制备凝胶
贮备液浓度
25mmol/L
10mmol/L
20μmol/L
20μmol/L
5U/μL
PCR反应体系
终浓度
2.0mmol/L
0.4mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.06U/μL
加样量/μL
加人TAE配制质量浓度为10g/L的琼脂糖，在微波炉中熔化混勾，冷却至55℃左右。C.2.3.2
加入漠化艺锭
加人浓度为0.5μg/mL的溴化乙锭，混匀，倒人已封好的凝胶平台上，插人样品梳。待凝胶凝固后，拔出梳子，加人足够量的TAE（缓冲液盖过凝胶表面约1mm）。9
SN/T1150—2015
c.2.3.3电泳
吸取10μLPCR扩增产物，加人2μL6×加样缓冲液混合均勾，将其和适合的DNA分子量标准物分别加人到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统下观察并保留结果。C.3结果判断
阳性对照在694bp处有扩增条带，阴性对照和空白对照无特异性扩增条带，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。结果达到质控要求，且待测样品在694bp处无扩增条带，判定结果为阴性。
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代替SN/T1150—2002
南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Arabis mosaic virus2015-12-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1150—2015
本标准代替SN/T1150—2002《南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法》。与SN/T1150—2002相比，主要技术变化如下：
增加了RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法的内容。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局本标准主要起草人：吴际云、陈枝楠、郑耘、张伟锋、卢小雨、冯建军、王红英、龙海、李芳荣、胡运发、邓琼、邓丛良。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1150-2002。
1范围
南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法
SN/T1150—2015
本标准规定了南芥菜花叶病毒的生物学测定、血清学检测、免疫电镜、RT-PCR检疫鉴定方法。本标准适用于进出境植物种子苗木等繁殖材料和植物产品中南芥莱花叶病毒的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T28073南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法SN/T1840
植物病毒免疫电镜检测方法
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3基本信息
学名：Arabismosaicuirus
缩写：ArMV
分类地位：豆花叶病毒科（Comouiridae），线虫传多面体病毒属（Nepouirus）。其他信息参见附录A。4原理和方法
依据ArMV鉴别寄主的症状、病毒形态、免疫学特性及分子生物学特性进行检测判定。仪器设备用具及设施
仪器设备
天平（感量1/10000g）、pH计、酶标仪、透射电子显微镜、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、离心机、超低温冰箱等5.2
微量移液器、研钵、离心管、花盆、消毒土等，5.3
植物隔离检疫温室。
6试剂
DAS-ELISA检测试剂（见附录B）、RT-PCR检测试剂（见附录C）、生物学测定试剂（见8.5）。免疫1
SN/T1150—2015
电镜检测试剂按照SN/T1840的规定执行，实时荧光RT-PCR检测试剂按照GB/T28073的规定执行。
7样品制备
7.1种子类
抽样按照SN/T2122的规定执行
将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于25℃左右生长并进行症状观察。待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组)并编号。7.2苗木类
抽样按照SN/T2122的规定执行。将苗木种植于隔离温室中，于25℃左右生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法同7.1。
检测方法
8.1DAS-ELISA检测
方法见附录B。
免疫电镜检测
按照SN/T1840的规定执行。
8.3RT-PCR检测
方法见附录C
8.4实时荧光RT-PCR检测
按照GB/T28073的规定执行。
8.5生物学测定
8.5.1接种
病叶加1：1（质量：体积）的磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH7.2)于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均勾酒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面。8.5.2鉴别寄主症状
对经DAS-ELISA检测出的阳性样品植株，采其叶片，加人适量样品提取缓冲液研磨后的汁液，在室温（20℃～25℃）条件下，用摩擦接种法接种栽种于检疫隔离温、网室中的昆诺藜或色藜、黄瓜、“Prince”菜豆、矮牵牛和番杏等鉴别寄主植物。昆诺藜（Chenopodiumquinoa）或苋色藜（C.amaranticolor）：接种后4d~6d接种叶出现局部褪绿斑，然后出现系统褪绿斑驳。
黄瓜（Cucumissatiuus）：接种子叶5d～7d后出现局部褪绿斑或小型坏死环斑或黄斑，后出现系统环线脉，畸形。
SN/T1150—2015
“Prince\菜豆（PhaseolusUulgariscv.Prince)：接种5d～7d后表现为局部褪绿、坏死或畸形。矮牵牛（Petumia hybrida）：接种叶出现局部枯斑或坏死环斑，接着表现系统褪绿环斑或线纹或明脉。
番杏（Tetragoniaerpensa）：接种3d～7d后接种叶出现细轮纹，后表现环斑。9结果判定
DAS-ELISA检测为阳性后，RT-PCR或免疫电镜检测结果为阳性可判定检出黄瓜花叶病毒。如果上述方法还不能判定检测结果，可进行生物学测定，并进行复验。若DAS-ELISA检测为阴性，则判定为未检出该病毒。
样品和档案保存
样品保存
经检测确定携带ArMV的样品在合适的条件下保存。种子保存在4℃，病株在一20℃或者一70℃冰箱中保存，提取的RNA样品若需长期保存应放置于一70℃冰箱。做好标记和登记工作。2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、登记时间、实验地点、检测方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。DAS-ELISA检测需有试验的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果，实时荧光RTPCR需有数据和图片，免疫电镜观察需有病毒粒体照片，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片。SN/T1150—2015
A.1粒体形态
附录A
（资料性附录）
生物学特性
ArMV为等轴多面体球状病毒，直径为30nm。A.2基因组
ArMV为单链RNA病毒，基因组由两条单链正义RNA组成，RNA1为7.3kb，RNA2为3.8kb，多个分离物的基因组已被测序，各分离物之间序列同源性很高。A.3寄主范围
ArMV可侵染174属215种植物。主要为害的作物有大麻（Cannabissatiua），啤酒花（Humuluslupulus）、黄瓜（Cucumissatius）、西葫芦（Cucurbitapepo）、莴苣（Lactucasativa），草莓（Fragaiaananassa）葡萄（Vitisvinifera），香石竹（Dianthus caryophyllus），水仙（Narcissustazetta），蔷薇（Rosamultiflora）、草木棍（Melilotussuaveolens）、郁金香（Tulipagesneriana）、芹菜（Apiumgraveolens），薄荷（Menthasppiperita），丁香（Syringaoblata），大豆（Glycinemar），甜菜（Betavulgaris），马铃薯（Solanumtuberosm），烟草（Nicotianatabacum），番茄（Lycopericonesculentum），菜豆（Phaseolusvulgaris），紅豆（Vignaunguiculata），蚕豆（Viciafaba），豌豆（Pisumscatwum）、甜瓜（Cucumismelo）、花椰菜（BrassicaoleraceaL.var.botrytis）、菠菜（Spinaciaoleracea），胡萝卜（Daucuscarota）等。
A.4病害症状
ArMV引起的最常见症状是叶片斑驳和脱落、植株矮化、严重畸型、耳突。症状随着寄主植物、病毒的分离物、裁培条件，季节和年份的不同而改变。有时候ArMV的侵染是隐症的，并不会在寄主植物上表现症状。
ArMV侵染不同寄主后表现的如下症状：葡萄上表现“软皮”和茎沟槽症状；草莓上表现花叶和黄化皱缩；黄瓜上病叶表现黄色斑点，绿色部分呈不正常的黑色；莴苣表现为矮化、褪绿、坏死和心部退化；啤酒花根部表现为不正常的黑色，且叶子变小；树番茄上早春表现为轻微褪绿环斑驳，以后随着季节的延续逐渐消失，果实症状为黄色褪绿斑驳：欧洲白蜡树的叶子上表现为褪绿斑驳，叶形呈锯齿状或栎树叶状；烟草表现环斑，叶片缺刻破损，心叶卷曲。A.5分布地区
欧洲：奥地利、白俄罗斯、比利时、保加利亚、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦、芬兰、法国、德国、匈牙利、爱尔兰、意大利、拉脱维亚、立陶宛、卢森堡公国、摩尔多瓦、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、斯洛文尼亚，瑞典、瑞士，英国，乌克兰和南斯拉夫。4
亚洲：日本、哈萨克斯坦、土耳其、伊朗。非洲：南非。
北美洲：加拿大、美国。
大洋洲：澳大利亚、新西兰。
传播方式
SN/T1150—2015
ArMV可通过汁液摩擦接种、种苗和介体线虫传播。通过种子传播的寄主：莴苣（L.sativa）、松草莓（F.ananassa）大豆（G.ma），甜菜（B.vulgarisvar.saccharifera），番茄（L.esculentum）等，通过块茎传播的寄主：马铃薯（S.tuberosm）等；通过鳞球茎传播的寄主：水仙（N.tazetta）、郁金香（Tulipagesneriana）百合（Liliumbroruniivar.colchesteri）等；通过苗木传播的寄主：葡萄（V.vinifera）、草莓（F.ananassa），啤酒花（H.lupulus）、香石竹（D.caryophyllus）、蔷薇（R.multiflora）等。传播介体主要为异尾剑线虫（Xiphinemadiversicaudatum）。5
SN/T1150—2015
B.1试剂
B.1.1包被缓冲液（pH9.6）
附录B
（规范性附录）
DAS-ELISA检测
将碳酸钠（NazCOs）1.59g、碳酸氢钠（NaHCO）2.93g、叠氮钠（NaN.)0.2g溶解于1000mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH值至9.6，并储存于4℃。B.1.2磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）将氯化钠（NaCI)8g、磷酸二氢钾（KHzPO.)0.2g、磷酸氢二钠（NazHPO4)1.15g、氯化钾（KCI）0.2g、叠氮钠（NaNs)0.2g溶解于900mL蒸馏水，用浓盐酸（HCI)调节pH值到7.4，加水定容至1L。B.1.3PBST缓冲液
将氯化钠（NaCI)8g、磷酸二氢钾（KHzPO.)0.2g、磷酸氢二钠（NazHPO4）)1.15g、氯化钾（KCl）0.2g、吐温-20（Tween-20)5mL溶解于1000mL蒸馏水中。B.1.4样品提取缓冲液（pH7.4）将亚硫酸钠（NazSO：)1.3g、聚乙烯基吡咯烷酮（MW24~4000.PVP）20g、叠氮钠（NaN:)0.2g、吐温-20（Tween-20)20mL溶解于1000mLPBST，用浓盐酸（HCI）调节pH值至7.4，并储存于4℃。B.1.5酶标结合物缓冲液
将PBST缓冲液800mL小牛血清白蛋白（BSA)2g、PVP（MW24～4000，PVP）20g、叠氮钠(NaNs)0.2g加蒸馏水定容至1000mL，并储存于4℃。B.1.6底物缓冲液
将二乙醇胺97mL、叠氮钠（NaN.)0.2g溶解于1000mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调整pH值至9.8，并储存于4℃
B.2操作步骤
B.2.1包被
按照检测试剂盒说明操作。或用包被缓冲液稀释ArMV抗体（如1：200），向微孔板中每孔加人100μL包被抗体溶液，37℃下孵育2h～4h或4℃下包被过夜。B.2.2捕获抗原
弃去孔中的抗体包被溶液，用PBST洗4次～5次。加入100μL样品提取液到酶标板的孔中，每个样品重复2个，并设置阳性和阴性对照。37℃下孵育2h或4℃下孵育过夜，6
B.2.3加入酶标抗体
SN/T1150—2015
按照检测试剂盒说明操作。用酶标抗体缓冲液按比例稀释相应的酶标抗体（如1：200）。弃去孔中的检测样品提取液，用PBST洗4次～5次孔。每孔加人100μL酶标抗体溶液。在室温下孵育2h。B.2.4加底物
加人底物缓冲液将硝基苯磷酸二钠盐（p-nitrophenylPhosphate，pNPP）配制成浓度为1mg/mL的底物溶液。弃去酶标抗体溶液，用PBST洗4次～5次。每孔加人100μL新配制的底物溶液。室温下避光放置30min～60min，待阳性对照孔明显显色。B.2.5吸光值的测定
用酶标仪在405nm处读取吸光值。B.3结果判定
通过酶标仪上405nm的OD值来判定。对照孔的OD405值（空白对照、阴性对照及阳性对照）应该在质量控制范围内，即：空白对照和阴性对照的OD405值<0.15，当阴性对照孔的ODas值<0.05时，按0.05计算。阳性对照有明显的颜色反应；孔的重复性基本一致。在满足了该要求后，结果原则上可判断如下样品ODaos值/阴性对照ODaos值明显2，判为阳性。样品OD405值/阴性对照OD405值明显<2，判为阴性。样品OD40s值/阴性对照OD405值在阅值附近，判为可疑样品，应重新做一次，或用其他方法加以验证。
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c.1试剂
C.1.1RNA提取试剂
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
TRIzol试剂、三氯甲烷、异丙醇、70%乙醇。C.1.250×TAE
冰醋酸
NazEDTA·2H0
加去离子水定容至1L。用时加水稀释至1XTAE。C.1.36×加样缓冲液
溴酚蓝
煎糖水溶液
C.2试验步骤
总RNA提取
400g/L
称取样品o.1g，液氮充分研磨。加人1mLTrizol，混勾，倒人1.5mL离心管中。加人0.2mL三氯甲烷，剧烈振荡15s，4℃条件下12000g离心10min，小心吸取上层水相至新离心管中。加人等体积异丙醇，混勺，一20℃静止10min，4℃条件下12000g离心15min，弃上层水相。加1mL75%乙醇，重悬沉淀，4℃条件下8000g离心10min，弃上层乙醇相，干燥沉淀。加人30μLDEPC-H.O，置于50℃条件下5min溶解沉淀，存于一80℃条件下备用。或按照供应商推荐的试剂盒抽提RNA。C.2.2RT-PCR反应
ArMV的特异性引物及其序列见表C.1，位于RNA2的CP基因上，预计扩增产物大小为694bp。表C.1RT-PCR的引物和序列
引物名称
ArMV-F
ArMV-R
引物序列
5'-CAAGTTTCTGACTATCCCACC-3
5'-TTCCAAATCCCACATTACCT-3
在GenBank上的基因序列登录号。8
在AB279740.2°上的位置
2534-2554
3208-3227
cDNA合成
SN/T1150--2015
按表C.2列出的组分制备RT反应混合液20μL。反应条件为：25℃温育10min，42℃反转录1h，95℃处理2min~3min。
试剂名称
模板RNA
反向引物（20μmol/L）
5XAMV缓冲液
dNTP(10mmol/L)
AMV反转录酶（5U/μL)
RNA酶抑制剂(40U/μL)
DEPC处理过的H20
反应程序
cDNA合成反应体系
加样量/μL
将表C.3列出的组分加人PCR反应管中，充分混匀后进行PCR反应：94℃变性30S，57℃复性30s.72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。表C.3
试剂名称
10×PCR反应缓冲液
氯化镁（MgCl）
ArMV-F
ArMV-R
Taq酶
补加水至总体积
琼脂糖电泳
制备凝胶
贮备液浓度
25mmol/L
10mmol/L
20μmol/L
20μmol/L
5U/μL
PCR反应体系
终浓度
2.0mmol/L
0.4mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.06U/μL
加样量/μL
加人TAE配制质量浓度为10g/L的琼脂糖，在微波炉中熔化混勾，冷却至55℃左右。C.2.3.2
加入漠化艺锭
加人浓度为0.5μg/mL的溴化乙锭，混匀，倒人已封好的凝胶平台上，插人样品梳。待凝胶凝固后，拔出梳子，加人足够量的TAE（缓冲液盖过凝胶表面约1mm）。9
SN/T1150—2015
c.2.3.3电泳
吸取10μLPCR扩增产物，加人2μL6×加样缓冲液混合均勾，将其和适合的DNA分子量标准物分别加人到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统下观察并保留结果。C.3结果判断
阳性对照在694bp处有扩增条带，阴性对照和空白对照无特异性扩增条带，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。结果达到质控要求，且待测样品在694bp处无扩增条带，判定结果为阴性。
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