SN/T 3567.7-2017.Detection method of crossing priming isothermal amplification-Part 7: Enterovirus 71(EV71).
1范围
SN/T 3567.7规定了在国境口岸肠道病毒71型交叉引物恒温扩增法检测的对象、检测程序及检测结果报告。
SN/T 3567.7适用于在国境口岸对肠道病毒71型的快速筛查检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安全通 用要求
人间传染的病原微生物名录( 卫生部2006)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1交叉引物恒温扩增技术cross priming isothermal amplification;CPA
一种核酸恒温扩增技术,CPA恒温扩增体系中除包含具有链置换功能的RNA聚合酶(RNAPoly-merase)外,还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该RNA聚合酶的高活性的链置换特性,使RNA的循环扩增能不断地实现。
3.2交叉引物cross primer
用于交叉扩增的主要引物,其中正向引物的5'末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物的5'末端序列与正向引物的杂交序列相同,因此在扩增过程中这两条引物互相引人对方的杂交序列，
增加引物的杂交位点,促进扩增反应。
3.3剥离引物bumper primer
位于交叉扩增引物后方的短链引物,其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下,将扩增引物的延伸链从模板上剥离。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3567.7—2017
交叉引物恒温扩增检测方法
第7部分：肠道病毒71型
Detection method of crossing priming isothermal amplification-Part7:Enterovirus71(EV71)
2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T3567交叉引物恒温扩增检测方法分为11个部分：第1部分：通用技术规程；
第2部分：霍乱弧菌；
第3部分：大肠杆菌O157：H7；
第4部分：黄热病毒；
第5部分：沙门菌属；
第6部分：结核分枝杆菌；
第7部分：肠道病毒71型；
第8部分：症原虫：
第9部分：鼠疫耶尔森菌；
第10部分：炭疽芽孢杆菌；
第11部分：志贺菌。
本部分为SN/T3567的第7部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T3567.7—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、杭州优思达生物技术有限公司。本部分主要起草人：李智慧，柴宏森，田卉，祁军，胡林，尤其敏。1范围
交叉引物恒温扩增检测方法
第7部分：肠道病毒71型
SN/T3567.7-2017
SN/T3567的本部分规定了在国境口岸肠道病毒71型交叉引物恒温扩增法检测的对象、检测程序及检测结果报告。
本部分适用于在国境口岸对肠道病毒71型的快速筛查检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（卫生部2006）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
交叉引物恒温扩增技术
cross priming isothermal amplification;CPA种核酸恒温扩增技术，CPA恒温扩增体系中除包含具有链置换功能的RNA聚合酶（RNAPolymerase)外，还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该RNA聚合酶的高活性的链置换特性，使RNA的循环扩增能不断地实现。3.2
交叉引物
crossprimer
用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5”末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物的5末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引人对方的杂交序列，增加引物的杂交位点，促进扩增反应。3.3
剥离引物
bumperprimer
位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下，将扩增引物的延伸链从模板上剥离。
检测引物
detection primer
一对位于交叉引物内侧的短链引物，需要用半抗原或荧光素标记，其作用是使扩增产物带有该标记，以用于检测。
SN/T3567.7—2017
BstDNA聚合酶BstDNApolymerase嗜热脂肪芽孢杆菌（BacillusStearothermophilus）DNA聚合酶的部分片段，保留了其5'-+3'DNA聚合酶活性，但是去除了5'-→3'核酸外切酶活性。BstDNA聚合酶最主要的特性是具有超强的链置换功能（StrandDisplacement)。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件
dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate)dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deox）ycytidinetriphosphate)
dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）5生物安全措施
实验操作及处理按照GB19489和原卫生部颁布的（人间传染的病原微生物名录》（2006）的规定所有废弃物处理也应按照GB19489中的有关规定执行。
由具备相关资质的工作人员进行。6检测对象
肠道病毒71型感染病例或疑似
7试剂和材料
毒71型感染者的咽拭子
粪便。
析纯或生化试剂，水为按照GBT6682规定的一级水。7.1除另有规定外，所使用的试剂为分7.2RNA提取试剂:RNA提取
7.310×ThermoPol缓冲液：20
mmol/LTris-HC
KCl.20mmol/LMgSO41%TritonX-100.7.410mmol/LdNTPs溶液：dATPdTTP7.525XRNASecure。
7.6BstRNA聚合酶：8U/μL。
AMV逆转录酶：10U/μL
甜菜碱溶液：5mol/L。
MgSO4溶液：100mmol/L。
dCIP.dGTP
nmol/L(NH,),SO4，100mmol/L
5mmol/L。
TE缓冲液（pH7.4)：0.1mol/LTris-HCl(pH7.2)20mL加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）4.0mL，用超纯水定容至200mL。高压灭菌后4℃保存。7.112%琼脂糖凝胶。
7.12Goldview:0.5μg/μLc
RNA分子标记物。
引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物，参见附录A。7.14
7.15封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）：装置使用方法参见附录B。2
8仪器设备
任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪SN/T3567.7—2017
8.2微量移液器：量程范围为0.1μL~2μL；0.5μL10μL；10μL~100μL：100μL~1000μL。8.3计时器。
8.4超净工作台。
生物安全柜。
消毒灭菌锅。
高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。台式离心机（最高离心力2000g以上）。涡旋振荡器。
8.10低温冰箱、冷冻冷藏冰箱。8.11
紫外凝胶电泳图像分析系统
肠道病毒71型交叉引物恒温扩增法检测程序9
9.1样本采集
咽拭子
用专用采样棉签采集手足口病惠儿咽拭子标本，将咽拭子在标本保存液中充分搅动，以洗下病毒，并于4℃下送检，24h内未能检测的一80℃保存。9.1.2粪便样本
取手足口病患儿粪便标本，4冰箱保存，24h内未能检测的一80C保存。9.2
模板RNA提取
9.2.1咽拭子样本模板
利用RNA提取试剂盒，按照说明书要求提取RNA。9.2.2粪便样本模板
取少量大便加1mL无菌生理盐水重悬。取100μL标本放置于1.5mL灭菌离心管，加人200μLTrizol试剂及100μL氯仿，用振荡器强力振荡20s后静置3min，然后7000g离心2min，小心取出无色上清，转移至新灭菌的0.5mL离心管，然后利用RNA提取试剂盒，按照说明书要求提取RNA。9.3交叉引物恒温扩增
9.3.1交叉引物恒温扩增引物
用于检测肠道病毒71型的交叉引物恒温扩增引物序列参见附录A。9.3.2阳性对照和空白对照设置
实验过程中需要分别设阳性对照和空白对照，以基因工程构建的肠道病毒71型质粒作为阳性对照；空白对照以无RNA酶污染的水作为交叉引物恒温扩增模板。3
SN/T3567.7—2017
9.3.3交叉引物恒温扩增反应体系使用封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）检测CPA扩增产物时，交叉引物恒温扩增参考反应体系见表1。
试剂名称
10xThermoPol缓冲液
10mmol/LdNTPs
剥离引物F和R
交叉扩增引物R和F
检测引物F和B
甜菜碱
RNAsecure
BstRNA聚合酶
AMV逆转录酶
肠道病毒71型交叉引物恒温扩增反应体系储备液浓度
10mmol/L
20μmol/L
20μmol/L
20μmol/L
100mmol/L
5mol/L下载标准就来标准下载网
8U/μL
10U/μL
50ng/μL
交叉引物恒温扩增反应程序
将配制好的扩增反应液PCR管置于恒温仪器上，63℃温浴60min。9.3.5
交叉引物恒温扩增产物检测
20μL体系加样量
各0.2μL
各0.4μL
补足反应体系至20μL
9.3.5.1扩增产物经过2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶电泳图像分析系统下观察分析扩增产物。9.3.5.2可使用但不限于通过封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）检测交叉引物恒温扩增产物，该方法灵敏度较高，且可降低交叉污染的风险。具体操作步骤参见B.1。9.3.6检测结果判定
电泳产生梯形条带判定为交叉引物恒温扩增检测阳性。9.3.6.1
可使用封闭式一次性核酸检测装置方法的结果描述及判定参见B.3。9.3.6.2
剥离引物
Ev71F3
Ev71R3
附录A
（资料性附录）
肠道病毒71型CPA检测的引物序列5-TCTATGCCACGGAAGCTAAG
5-GTATCCGTCAAAGTGGTCT
交叉引物
1-Ev71CPR
1-Ev71CPF
检测引物
1-Ev71Fitc
1-Ev7iBiotin
SN/T3567.7—2017
5-TGTACGCCCTAGAAAAGAGAATGCATACAGGTTCAATACGGTGT5-CGCCCTAGAAAAGAGAATGAATCTCTGATGATTAGGCATACAG5-FITC-TGTACGCCCTAGAAAAGAGAATG5-AATTACATGCAGTTCAAGAGC
SN/T3567.7—2017
附录B
（资料性附录）
封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）B.1操作步骤及操作示意图
B.1.1将扩增后的反应管（不可开盖，以避免污染）放入封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）的固定盒（内芯）中，合上固定盒后将其装入装置外盒。B.1.2按手柄至检测装置于关闭
用状态（听见清脆的“味嗪”声）。上.请通过阅读窗判读结果。15min～30min为最佳判读时间，但不B.1.3将检测装置放置在操作台
应超过2h。
B.1.4记录检测结果，丢弃检测装置在安全处。操作示意图见图B.1。
将扩增后未打开的PCR管
B.2质控方法
阴性对照仅出现一条红线（在质控区C)。合上固定盒
将固定盒插入外盒
最手柄盖并扣死
阳性对照出现两条红线：一条位于检测区（T)，另一条位于质控区（C)。B.2.3
每个测试样本至少出现一条质控线，有或无检测线。结果描述及判定
判读结果
仅在质控区C出现一条红线，表示样品中无待测病原体；或其拷贝数低于该检测试剂的最低检B.3.1
测限。
SN/T3567.7—2017
B.3.2出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在待测病原体或基因。将检测线强度与色卡进行对照：≥L4，为阳性；B.4检测结果判读示意图
检测结果判读示意图见图B.2。
质控线(C)
检测线(T)
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