SN/T 4748-2017
基本信息
标准号： SN/T 4748-2017
中文名称：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4748-2017.Quarantine protocol for lymphocytic choriomeningitis.
1范围
SN/T 4748规定了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒荧光RT-PCR和血清抗体酶联免疫吸附试验的技术规范。
SN/T 4748适用于大鼠、小鼠、豚鼠和地鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的诊断及流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生 物安全通用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSA:血清白蛋白(Bovine serum albumin)
ELISA:酶联免疫吸附试验( Enzyme linked immunosorbent assay)
HRP:辣根过氧化物酶( Horseradish peroxidase)
LCMV:淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus)
4初步诊断
参照附录A疫病概述中的临床症状和流行病学资料可作出初步诊断,进--步应采集样品进行实验室检测。涉及到病原的检测应在二级生物安全实验室进行,样品保存和废弃物处理应按照GB19489要求进行。
5实验室诊断
5.1荧 光定量RT-PCR试验
5.1.1 试剂
5.1.1.1 TRIZOL。
5.1.1.2三氯甲烷。
5.1.1.3 异丙醇:-20℃预冷。
5.1.1.4 0.1%DEPC水。
1范围
SN/T 4748规定了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒荧光RT-PCR和血清抗体酶联免疫吸附试验的技术规范。
SN/T 4748适用于大鼠、小鼠、豚鼠和地鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的诊断及流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生 物安全通用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSA:血清白蛋白(Bovine serum albumin)
ELISA:酶联免疫吸附试验( Enzyme linked immunosorbent assay)
HRP:辣根过氧化物酶( Horseradish peroxidase)
LCMV:淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus)
4初步诊断
参照附录A疫病概述中的临床症状和流行病学资料可作出初步诊断,进--步应采集样品进行实验室检测。涉及到病原的检测应在二级生物安全实验室进行,样品保存和废弃物处理应按照GB19489要求进行。
5实验室诊断
5.1荧 光定量RT-PCR试验
5.1.1 试剂
5.1.1.1 TRIZOL。
5.1.1.2三氯甲烷。
5.1.1.3 异丙醇:-20℃预冷。
5.1.1.4 0.1%DEPC水。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4748—2017
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎
检疫技术规范
Quarantine protocol for lymphocytic choriomeningitis2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4748—2017
本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国江西出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张强、王艳、杨春华、熊炜、林颖、李树清、王巧全、朱事康、李健。1
1范围
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎
检疫技术规范
SN/T4748—2017
本标准规定了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒荧光RT-PCR和血清抗体酶联免疫吸附试验的技术规范。
本标准适用于大鼠、小鼠、豚鼠和地鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的诊断及流行病学调查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSA：血清白蛋白（Bovineserumalbumin）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay）HRP：辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase）LCMV：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocyticchoriomeningitisvirus）初步诊断
参照附录A疫病概述中的临床症状和流行病学资料可作出初步诊断，进一步应采集样品进行实验室检测。涉及到病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照GB19489要求进行。
5实验室诊断
荧光定量RT-PCR试验
TRIZOL。
三氯甲烷。
异丙醇：一20℃预冷。
0.1%DEPC水。
75%乙醇。
RNA酶抑制剂（40U/μL）。
SN/T4748—2017
TaqDNA聚合酶（5U/μL）及相应10X缓冲液。5.1.1.7
M-MLV反转录酶（200U/μL)及相应5X反转录反应缓冲液。5.1.1.9dNTPs(2.5mmol/L)。
MgClz(25mmol/L)
二级生物安全柜。
高压灭菌锅。
微量移液器。
高速冷冻离心机。
荧光PCR仪。
5.1.3引物和探针
引物和探针针对LCMV基因组NP片段序列设计，由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC溶解至10μmol/L后.保存于一20℃备用。引物、探针的名称、序列及位置见附录B的表B.1。5.1.4质控物质
阳性对照
将LCMV基因NP片段克隆入质粒载体，提取质粒，并将其线性化，线性化时保证NP片段完整，经体外转录后制备成cRNA溶液，用做阳性对照。5.1.4.2阴性对照
LCMV阴性小鼠组织，经匀浆后，1o00离心5min，取上清用做阴性对照。5.1.5样品的采集制备
处死受检动物，采集脑、脏器组织作为检测样本。采样过程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。
用无菌剪刀和镊子剪取待检样品于研磨器中充分研磨，再加人5倍体积的PBS混勾，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中编号备用。5.1.6存放与运送
采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存不超过24h：若需长期保存，应放置一70℃冰箱.但应避免反复冻融（最多冻融3次）。5.1.7样品核酸的提取
5.1.7.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
5.1.7.2每管加入600uL裂解液，然后分别加人待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，一份样品换用一个吸头：再加入200μL三氯甲烷，混匀器上震荡混匀5s。于4℃条件下，12000g离心15min。5.1.7.3取与5.1.7.1中相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加人500μL异丙醇（一20℃预冷），对每个管进行编号。吸取5.1.7.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500L，注意不要吸出中间层，颠倒混勾。2
SN/T4748—2017
5.1.7.4于4℃条件下，12000g离心15min。轻轻倒去上清液.倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加人600μL75%乙醇，颠倒洗涤。5.1.7.5于4℃条件下，12000g离心10min。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。
5.1.7.64000g离心10s.将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶5.1.7.7加入11μLDEPC水，轻轻混勾，溶解管壁上的RNA，2000g离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于一7OC冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。也可采用其他等效的商业化试剂盒提取核酸5.1.8扩增试剂准备与配制
本步骤在反应混合物配制区进行每个测试反应体系需使用15
RT-PCR反应液，反应液配方见表B.2。根据5.1.7.1中所设定的n值，计算各试剂的使用量，加人适当体积试管中，充分混合均匀后，向每个PCR管中各分装15L，转移至样品处理区。
5.1.9加样
在样品处理区进行。在5.1.8的PCR管中分别加人制备好的RNA溶液10uL，使总体积达25μL。盖紧管盖后，500g离心30s。
5.1.10荧光RT-PCR反应
PCR管放人荧光PCR
检测仪内，记录样品摆放顺序，选定在检测区进行。将5.1.9中加样后的FAM检测通道读取检测结果，选择TAMRA作为率灭基团。设置如下反应参数：2℃/30min
第一阶段，反转录42
一第二阶段，预变性95
一第三阶段，95℃/15s58℃
/1min，4o个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。
5.1.11结果判定
质控标准
阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线阳性对照的Ct应≤30，并出现特定的扩增曲线如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。5.1.11.2结果描述及判定
阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无LCMV核酸。阳性：Ct≤35，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在LCMV核酸。可疑：355.2.1.1ELISA抗原：在生物安全实验室，用LCMV感染Vero细胞，当病变达80%时，收获培养物SN/T4748—2017
反复冻融三次或超声波处理后，2000g离心10min去除细胞碎片，上清液经超速离心浓缩后制成ELISA抗原；或用基因工程表达纯化LCMV抗原作为ELISA抗原。也可购买商品化抗原
5.2.1.2ELISA对照抗原：未染病毒Vero细胞冻融破碎后，2000g离心10min去除细胞碎片，上清液可作为对照抗原：或用基因工程抗原用空白载体表达物破碎获得。5.2.1.3LCMV阳性对照血清：用β丙内脂灭活LCMV抗原，免疫清洁级或SPF级大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠所获得的抗血清
5.2.1.4LCMV阴性对照血清：清洁级或SPF级大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠血清。5.2.1.5BSA。
5.2.1.6酶标记物：HRP标记羊或免抗小鼠、豚鼠、地鼠IgG抗体，用于检测相应动物血清抗体；HRP标记葡萄球菌蛋白A（SPA）可用于检测小鼠、豚鼠、地鼠血清抗体。5.2.1.7
0.01mol/LPBS缓冲液（见C.1)。抗原稀释液（见C.2）。
洗涤液（见C.3）。
吐温—20。
封闭液（见C.4）。
显色剂（见C.5）。
终止液（见C.6）。
酶稀释液（同洗涤液）。
微量移液器。
酶标仪。
洗板机。
高速冷冻离心机。
样品采集制备
无菌操作采集动物血，自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。样品1周内检测可存放于2℃～8℃，超过1周应置于-20℃。5.2.4操作步骤
5.2.4.1用抗原稀释液稀释抗原，将稀释好的LCMV抗原加人酶标板奇数列孔内，每孔加100μL，4℃包被过夜；偶数列用细胞对照抗原按同样方法处理。2用300μL洗涤液冲洗微量板5次。5.2.4.2
5.2.4.3每孔加封闭液200μL，37℃反应1h。5.2.4.4洗板5次。
待检血清用稀释液作1：50稀释，把稀释好的血清加人已包被阳性和阴性抗原孔各一孔，每孔100μL；同时设立阳性血清、阴性血清对照（见附录D）。置37℃孵育1h。5.2.4.6
洗板5次。
把稀释好的HRP标记抗体加人各孔，每孔加100μL，置室温反应1h。5.2.4.7
洗板5次。
每孔加入显色剂底物溶液100μL，室温避光反应30min。5.2.4.9
每孔加50μL终止液终止反应，10min内以492nm波长测OD值。也可采用其他等效的商业化试剂盒5.2.5
结果判定
SN/T4748—2017
每份检测血清的病毒抗原孔OD值与阴性抗原对照孔OD值之差即为样品OD值。阴性对照血清的OD≤0.250，阳性对照血清的OD≥0.600，本试验成立。待检血清平均OD值高于阴性血清对照平均OD值2倍以上者，判为阳性；否则判为阴性。5
SN/T4748—2017
附录A
（资料性附录）
疫病概述
A.1淋巴细胞性脉络丛脑膜炎（LCM是由淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒LCMV引起的人和多种动物共患的病毒性疾病。小鼠感染表现为大脑型、内脏型和迟发型三种病型；人类感染主要表现流感样症状和脑膜炎。
A.2小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、犬、猴、鸡、马、兔均易感。在自然状态下LCMV可感染啮齿类动物，其储存宿主是小家鼠（Musmusculus）家鼠（Musdomesticus）和仓鼠（Syrianhamster）等啮齿类动物，由于此类啮齿动物遍布全球，广泛分布在人类的活动区域：并且接触患病动物的排泄物和分泌物是主要的感染途径，人被感染LCMV的几率也较大。但只有持续感染的小鼠和急性感染的金黄地鼠才能传播病毒。在带毒小鼠的所有器官（包括肾脏和睡液腺）中，终身还有高滴度的病毒，带毒小鼠可经唾液、鼻分泌物和尿液向外排毒。含病毒的鼻分泌物可能引起呼吸道传播，随后，病毒在鼠群内散播，许多小鼠成为无症状的带毒者，并通过子宫和乳汁传给后代，其后代可成为终身带毒者。A.3LCMV在家鼠间存在的主要方式是通过子宫垂直传播。除带毒小鼠以外，能使LCMV在物种间传播或散发到其他物种的动物只有金黄地鼠。节肢动物（蚊、蜱、臭虫、虱等）可在实验条件下传播本病。A.4小鼠感染LCMV依年龄
感染途径及其他因素的不同，表现为三种病型：a）大脑型成年小鼠脑内接种LCMV可产生一种具有显著特征的疾病，病毒株，接种剂量或小鼠品系对其影响甚微。接种后5天～6天，有的小鼠突然死亡；多数小鼠表现呆滞、嗜睡、不愿走动，被毛粗乱眼晴半闭，弓背，消瘦，并常见结膜炎和面部水肿。特征性的表现是抓着尾色倒提时，小鼠头部震颤，肢体阵挛性惊厥，最终表现后肢强制性伸展。小鼠多在症状出现后1天～3天内死亡。
b）内脏型成年小鼠经神经外途径感杂所呈现的临床反应很不同，这主要受到接种途径、剂量，病毒株的毒力以及小鼠品系等因素影响。经腹腔接种E-350毒株，6天～7天感染小鼠被毛粗乱，结膜炎等症状，部分小鼠出现腹水。迟发型此型见于出生后即刻感染LCMV的带毒小鼠和先天性带毒小鼠。出生后，LCMV即在各组织器官中增殖，但无症状表现：270日龄～360日龄时，病鼠表现被毛粗乱、弓背、体重减轻、蛋白尿、腹水、行为异常、生长缓慢产仔减少、寿命缩短等症状。6
附录B
（规范性附录）
荧光RT-PCR试验
SN/T4748—2017
B.10.1%DEPC水。去离子水中加人终浓度为0.1%的DEPC37℃搅拌处理12h，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后密闭冷藏备用。引物、探针的名称、序列及基因组位置见表B.1。B.2
表B.1引物、探针的名称、序列及基因组位置引物、探针名称
上游引物LCMV-F
下游引物LCMV-R
探针LCMV-P
SGCCATDGTNARRCTKGGCAT-3
5'-TRCAVATRGTWGGRATGAG-3
5'(FAM)-TCACATOCCAVACYCT
注：D:A或G或T.K.G或T.R：A或bzxz.net
N.A或T或
LCMV荧光RT-PCR反应液配方见表B.TAMRA)3
nt.2700-2719
nt.2818-2799
nt.2755-2770
G.WA或T.Y.C或T,V.A或C或G。
表B.2LCMV荧光RT-PCR反应液配方荧光RT-PCR反应液组分
5×RT-PCRBuffer(Mg+浓度15
dNTPs(2.5mmol/
上游引物（10μmal/L）
下游引物（10μmol/L）
探针（10μmol/L）
M-MLV反转录酶（2
RNA酶抑制剂(40
TaqDNA聚合酶（5U）
DEPC水
总体积
体积（μL)/反应
SN/T4748—2017
附录C
（规范性附录）
ELISA试验溶液的配制
C.10.01mol/LpH7.4PBS（磷酸盐缓冲液）氯化钠（(NaCI）
氯化钾(KCI）
磷酸氢二钠（NazHPO4·12HzO）2.89g磷酸二氢钾（KHPO）
加蒸馅水至
1000mL
将上述成分依次溶解，分装，121℃高压灭菌15min。室温保存，有效期1个月。C.2
抗原稀释液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液.pH9.6）碳酸氢钠2.93g，碳酸钠1.59g，双蒸水加至1000mL，2℃~8℃保存备用，一周内用完。洗涤液（0.01mol/LPBS-0.05%吐温-20.pH7.4）吐温一200.50mL，加0.01mol/LPBS至1000mL，现用现配。C.4封闭液
牛血清白蛋白（BSA）
稀释液
置于4℃冰箱备用。
底物溶液
A液：称取21g柠檬酸（CHO，·HO）加蒸馏水溶解并定容至1000mL.配制成0.1mol/L柠檬酸。
B液：称取71.6g磷酸氢二钠（Na2HPO·12H2O）加蒸馏水溶解并定容至1000mL，配制成0.2mol/L磷酸氢二钠。
取A液24.3mL，B液25.7mL，混合后加人20mg邻苯二胺（OPD），充分溶解，临用前加20μL30%H202，即配成酶底物液。
终止液（2mol/LHSO）
取分析纯浓硫酸（含量95%~98%）22.2mL缓缓加人到177.8mL蒸馏水中，混勾即成2mol/LHzSO,终止液。
ELISA试验样品添加图见图D.1。1
附录D
（规范性附录）
ELISA试验样品添加图
注：P为阳性对照样品的英文缩写：N为阴性对照样品的缩写：S为待检样品的英文缩写。图D.1
ELISA试验样品添加图
SN/T4748—2017
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淋巴细胞性脉络丛脑膜炎
检疫技术规范
Quarantine protocol for lymphocytic choriomeningitis2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4748—2017
本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国江西出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张强、王艳、杨春华、熊炜、林颖、李树清、王巧全、朱事康、李健。1
1范围
淋巴细胞性脉络丛脑膜炎
检疫技术规范
SN/T4748—2017
本标准规定了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒荧光RT-PCR和血清抗体酶联免疫吸附试验的技术规范。
本标准适用于大鼠、小鼠、豚鼠和地鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎的诊断及流行病学调查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSA：血清白蛋白（Bovineserumalbumin）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay）HRP：辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase）LCMV：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocyticchoriomeningitisvirus）初步诊断
参照附录A疫病概述中的临床症状和流行病学资料可作出初步诊断，进一步应采集样品进行实验室检测。涉及到病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照GB19489要求进行。
5实验室诊断
荧光定量RT-PCR试验
TRIZOL。
三氯甲烷。
异丙醇：一20℃预冷。
0.1%DEPC水。
75%乙醇。
RNA酶抑制剂（40U/μL）。
SN/T4748—2017
TaqDNA聚合酶（5U/μL）及相应10X缓冲液。5.1.1.7
M-MLV反转录酶（200U/μL)及相应5X反转录反应缓冲液。5.1.1.9dNTPs(2.5mmol/L)。
MgClz(25mmol/L)
二级生物安全柜。
高压灭菌锅。
微量移液器。
高速冷冻离心机。
荧光PCR仪。
5.1.3引物和探针
引物和探针针对LCMV基因组NP片段序列设计，由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC溶解至10μmol/L后.保存于一20℃备用。引物、探针的名称、序列及位置见附录B的表B.1。5.1.4质控物质
阳性对照
将LCMV基因NP片段克隆入质粒载体，提取质粒，并将其线性化，线性化时保证NP片段完整，经体外转录后制备成cRNA溶液，用做阳性对照。5.1.4.2阴性对照
LCMV阴性小鼠组织，经匀浆后，1o00离心5min，取上清用做阴性对照。5.1.5样品的采集制备
处死受检动物，采集脑、脏器组织作为检测样本。采样过程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。
用无菌剪刀和镊子剪取待检样品于研磨器中充分研磨，再加人5倍体积的PBS混勾，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中编号备用。5.1.6存放与运送
采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存不超过24h：若需长期保存，应放置一70℃冰箱.但应避免反复冻融（最多冻融3次）。5.1.7样品核酸的提取
5.1.7.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
5.1.7.2每管加入600uL裂解液，然后分别加人待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，一份样品换用一个吸头：再加入200μL三氯甲烷，混匀器上震荡混匀5s。于4℃条件下，12000g离心15min。5.1.7.3取与5.1.7.1中相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加人500μL异丙醇（一20℃预冷），对每个管进行编号。吸取5.1.7.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500L，注意不要吸出中间层，颠倒混勾。2
SN/T4748—2017
5.1.7.4于4℃条件下，12000g离心15min。轻轻倒去上清液.倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加人600μL75%乙醇，颠倒洗涤。5.1.7.5于4℃条件下，12000g离心10min。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。
5.1.7.64000g离心10s.将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶5.1.7.7加入11μLDEPC水，轻轻混勾，溶解管壁上的RNA，2000g离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于一7OC冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。也可采用其他等效的商业化试剂盒提取核酸5.1.8扩增试剂准备与配制
本步骤在反应混合物配制区进行每个测试反应体系需使用15
RT-PCR反应液，反应液配方见表B.2。根据5.1.7.1中所设定的n值，计算各试剂的使用量，加人适当体积试管中，充分混合均匀后，向每个PCR管中各分装15L，转移至样品处理区。
5.1.9加样
在样品处理区进行。在5.1.8的PCR管中分别加人制备好的RNA溶液10uL，使总体积达25μL。盖紧管盖后，500g离心30s。
5.1.10荧光RT-PCR反应
PCR管放人荧光PCR
检测仪内，记录样品摆放顺序，选定在检测区进行。将5.1.9中加样后的FAM检测通道读取检测结果，选择TAMRA作为率灭基团。设置如下反应参数：2℃/30min
第一阶段，反转录42
一第二阶段，预变性95
一第三阶段，95℃/15s58℃
/1min，4o个循环，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。
5.1.11结果判定
质控标准
阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线阳性对照的Ct应≤30，并出现特定的扩增曲线如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。5.1.11.2结果描述及判定
阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无LCMV核酸。阳性：Ct≤35，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在LCMV核酸。可疑：35
反复冻融三次或超声波处理后，2000g离心10min去除细胞碎片，上清液经超速离心浓缩后制成ELISA抗原；或用基因工程表达纯化LCMV抗原作为ELISA抗原。也可购买商品化抗原
5.2.1.2ELISA对照抗原：未染病毒Vero细胞冻融破碎后，2000g离心10min去除细胞碎片，上清液可作为对照抗原：或用基因工程抗原用空白载体表达物破碎获得。5.2.1.3LCMV阳性对照血清：用β丙内脂灭活LCMV抗原，免疫清洁级或SPF级大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠所获得的抗血清
5.2.1.4LCMV阴性对照血清：清洁级或SPF级大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠血清。5.2.1.5BSA。
5.2.1.6酶标记物：HRP标记羊或免抗小鼠、豚鼠、地鼠IgG抗体，用于检测相应动物血清抗体；HRP标记葡萄球菌蛋白A（SPA）可用于检测小鼠、豚鼠、地鼠血清抗体。5.2.1.7
0.01mol/LPBS缓冲液（见C.1)。抗原稀释液（见C.2）。
洗涤液（见C.3）。
吐温—20。
封闭液（见C.4）。
显色剂（见C.5）。
终止液（见C.6）。
酶稀释液（同洗涤液）。
微量移液器。
酶标仪。
洗板机。
高速冷冻离心机。
样品采集制备
无菌操作采集动物血，自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。样品1周内检测可存放于2℃～8℃，超过1周应置于-20℃。5.2.4操作步骤
5.2.4.1用抗原稀释液稀释抗原，将稀释好的LCMV抗原加人酶标板奇数列孔内，每孔加100μL，4℃包被过夜；偶数列用细胞对照抗原按同样方法处理。2用300μL洗涤液冲洗微量板5次。5.2.4.2
5.2.4.3每孔加封闭液200μL，37℃反应1h。5.2.4.4洗板5次。
待检血清用稀释液作1：50稀释，把稀释好的血清加人已包被阳性和阴性抗原孔各一孔，每孔100μL；同时设立阳性血清、阴性血清对照（见附录D）。置37℃孵育1h。5.2.4.6
洗板5次。
把稀释好的HRP标记抗体加人各孔，每孔加100μL，置室温反应1h。5.2.4.7
洗板5次。
每孔加入显色剂底物溶液100μL，室温避光反应30min。5.2.4.9
每孔加50μL终止液终止反应，10min内以492nm波长测OD值。也可采用其他等效的商业化试剂盒5.2.5
结果判定
SN/T4748—2017
每份检测血清的病毒抗原孔OD值与阴性抗原对照孔OD值之差即为样品OD值。阴性对照血清的OD≤0.250，阳性对照血清的OD≥0.600，本试验成立。待检血清平均OD值高于阴性血清对照平均OD值2倍以上者，判为阳性；否则判为阴性。5
SN/T4748—2017
附录A
（资料性附录）
疫病概述
A.1淋巴细胞性脉络丛脑膜炎（LCM是由淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒LCMV引起的人和多种动物共患的病毒性疾病。小鼠感染表现为大脑型、内脏型和迟发型三种病型；人类感染主要表现流感样症状和脑膜炎。
A.2小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、犬、猴、鸡、马、兔均易感。在自然状态下LCMV可感染啮齿类动物，其储存宿主是小家鼠（Musmusculus）家鼠（Musdomesticus）和仓鼠（Syrianhamster）等啮齿类动物，由于此类啮齿动物遍布全球，广泛分布在人类的活动区域：并且接触患病动物的排泄物和分泌物是主要的感染途径，人被感染LCMV的几率也较大。但只有持续感染的小鼠和急性感染的金黄地鼠才能传播病毒。在带毒小鼠的所有器官（包括肾脏和睡液腺）中，终身还有高滴度的病毒，带毒小鼠可经唾液、鼻分泌物和尿液向外排毒。含病毒的鼻分泌物可能引起呼吸道传播，随后，病毒在鼠群内散播，许多小鼠成为无症状的带毒者，并通过子宫和乳汁传给后代，其后代可成为终身带毒者。A.3LCMV在家鼠间存在的主要方式是通过子宫垂直传播。除带毒小鼠以外，能使LCMV在物种间传播或散发到其他物种的动物只有金黄地鼠。节肢动物（蚊、蜱、臭虫、虱等）可在实验条件下传播本病。A.4小鼠感染LCMV依年龄
感染途径及其他因素的不同，表现为三种病型：a）大脑型成年小鼠脑内接种LCMV可产生一种具有显著特征的疾病，病毒株，接种剂量或小鼠品系对其影响甚微。接种后5天～6天，有的小鼠突然死亡；多数小鼠表现呆滞、嗜睡、不愿走动，被毛粗乱眼晴半闭，弓背，消瘦，并常见结膜炎和面部水肿。特征性的表现是抓着尾色倒提时，小鼠头部震颤，肢体阵挛性惊厥，最终表现后肢强制性伸展。小鼠多在症状出现后1天～3天内死亡。
b）内脏型成年小鼠经神经外途径感杂所呈现的临床反应很不同，这主要受到接种途径、剂量，病毒株的毒力以及小鼠品系等因素影响。经腹腔接种E-350毒株，6天～7天感染小鼠被毛粗乱，结膜炎等症状，部分小鼠出现腹水。迟发型此型见于出生后即刻感染LCMV的带毒小鼠和先天性带毒小鼠。出生后，LCMV即在各组织器官中增殖，但无症状表现：270日龄～360日龄时，病鼠表现被毛粗乱、弓背、体重减轻、蛋白尿、腹水、行为异常、生长缓慢产仔减少、寿命缩短等症状。6
附录B
（规范性附录）
荧光RT-PCR试验
SN/T4748—2017
B.10.1%DEPC水。去离子水中加人终浓度为0.1%的DEPC37℃搅拌处理12h，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后密闭冷藏备用。引物、探针的名称、序列及基因组位置见表B.1。B.2
表B.1引物、探针的名称、序列及基因组位置引物、探针名称
上游引物LCMV-F
下游引物LCMV-R
探针LCMV-P
SGCCATDGTNARRCTKGGCAT-3
5'-TRCAVATRGTWGGRATGAG-3
5'(FAM)-TCACATOCCAVACYCT
注：D:A或G或T.K.G或T.R：A或bzxz.net
N.A或T或
LCMV荧光RT-PCR反应液配方见表B.TAMRA)3
nt.2700-2719
nt.2818-2799
nt.2755-2770
G.WA或T.Y.C或T,V.A或C或G。
表B.2LCMV荧光RT-PCR反应液配方荧光RT-PCR反应液组分
5×RT-PCRBuffer(Mg+浓度15
dNTPs(2.5mmol/
上游引物（10μmal/L）
下游引物（10μmol/L）
探针（10μmol/L）
M-MLV反转录酶（2
RNA酶抑制剂(40
TaqDNA聚合酶（5U）
DEPC水
总体积
体积（μL)/反应
SN/T4748—2017
附录C
（规范性附录）
ELISA试验溶液的配制
C.10.01mol/LpH7.4PBS（磷酸盐缓冲液）氯化钠（(NaCI）
氯化钾(KCI）
磷酸氢二钠（NazHPO4·12HzO）2.89g磷酸二氢钾（KHPO）
加蒸馅水至
1000mL
将上述成分依次溶解，分装，121℃高压灭菌15min。室温保存，有效期1个月。C.2
抗原稀释液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液.pH9.6）碳酸氢钠2.93g，碳酸钠1.59g，双蒸水加至1000mL，2℃~8℃保存备用，一周内用完。洗涤液（0.01mol/LPBS-0.05%吐温-20.pH7.4）吐温一200.50mL，加0.01mol/LPBS至1000mL，现用现配。C.4封闭液
牛血清白蛋白（BSA）
稀释液
置于4℃冰箱备用。
底物溶液
A液：称取21g柠檬酸（CHO，·HO）加蒸馏水溶解并定容至1000mL.配制成0.1mol/L柠檬酸。
B液：称取71.6g磷酸氢二钠（Na2HPO·12H2O）加蒸馏水溶解并定容至1000mL，配制成0.2mol/L磷酸氢二钠。
取A液24.3mL，B液25.7mL，混合后加人20mg邻苯二胺（OPD），充分溶解，临用前加20μL30%H202，即配成酶底物液。
终止液（2mol/LHSO）
取分析纯浓硫酸（含量95%~98%）22.2mL缓缓加人到177.8mL蒸馏水中，混勾即成2mol/LHzSO,终止液。
ELISA试验样品添加图见图D.1。1
附录D
（规范性附录）
ELISA试验样品添加图
注：P为阳性对照样品的英文缩写：N为阴性对照样品的缩写：S为待检样品的英文缩写。图D.1
ELISA试验样品添加图
SN/T4748—2017
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