SN/T 4750-2017
基本信息
标准号： SN/T 4750-2017
中文名称：猪细环病毒检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：7061219
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4750-2017.Quarantine protocol for swine torque teno sus virus.
1范围
SN/T 4750规定了猪细环病毒PCR检测法和实时荧光PCR检测法的操作方法。
SN/T 4750适用于猪及其产品中猪细环病毒核酸的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 2025动物 检疫实验室生物安全操作规范
3防污染措施
本标准涉及的所有操作应符合GB 19489,及SN/T 2025的有关规定。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
4.1 DEPC: 焦碳酸二乙酯( diethypyrocarbonate)
4.2 DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
4.3 EDTA:乙二 胺四乙酸( ethylene diamine tetraacetic acid)
4.4 PCR:聚 合酶链式反应(polymerase chain reaction)
4.5 RNA: 核糖核酸( ribonucleic acid)
4.6 SDS:十二 烷基硫酸钠( sodium dodecyl sulfate)
4.7 TTSuV: 猪细环病毒(Swine Torque Teno Sus Virus)(参见附录A)
5设备、材料和试剂
5.1 设备、材料
PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪.凝胶成像系统、高压灭菌器、冰箱、微量可调移液器及吸头、冷冻离心机、1.5 mL.离心管。
1范围
SN/T 4750规定了猪细环病毒PCR检测法和实时荧光PCR检测法的操作方法。
SN/T 4750适用于猪及其产品中猪细环病毒核酸的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 2025动物 检疫实验室生物安全操作规范
3防污染措施
本标准涉及的所有操作应符合GB 19489,及SN/T 2025的有关规定。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
4.1 DEPC: 焦碳酸二乙酯( diethypyrocarbonate)
4.2 DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
4.3 EDTA:乙二 胺四乙酸( ethylene diamine tetraacetic acid)
4.4 PCR:聚 合酶链式反应(polymerase chain reaction)
4.5 RNA: 核糖核酸( ribonucleic acid)
4.6 SDS:十二 烷基硫酸钠( sodium dodecyl sulfate)
4.7 TTSuV: 猪细环病毒(Swine Torque Teno Sus Virus)(参见附录A)
5设备、材料和试剂
5.1 设备、材料
PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪.凝胶成像系统、高压灭菌器、冰箱、微量可调移液器及吸头、冷冻离心机、1.5 mL.离心管。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4750—2017
猪细环病毒检疫技术规范
Quarantine protocol for swine torque teno sus virus2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4750—2017
本标准起草单位：中华人民共和国江西出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学院、江西省检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：杨春华、孙思扬、张强、陈庆富、周延、孙洁、祝建新、罗秋红、花群义I
1范围
猪细环病毒检疫技术规范
本标准规定了猪细环病毒PCR检测法和实时荧光PCR检测法的操作方法本标准适用于猪及其产品中猪细环病毒核酸的检测规范性引用文件
SN/T4750—2017
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范3防污染措施
本标准涉及的所有操作应符合GB19489，及SN/T2025的有关规定4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）4.1
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）TTSuV：猪细环病毒（SwineTorqueTenoSusVirus）（参见附录A）4.7
5设备、材料和试剂
5.1设备、材料
PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌器、冰箱、微量可调移液器及吸头、冷冻离心机、1.5mL离心管。
2试剂
除特别说明外，本标准所用试剂均为分子生物学级试验用水应符合GB/T6682的要求：样品裂解缓冲液（见B.4）、10%SDS、20g/L蛋白酶K、RNA酶、酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1）、异丙醇、70%乙醇（用无水乙醇和DEPC水配制）、DEPC水、PCR反应预混液、PCR引物（见B.6）、电泳缓冲液、琼脂1
SN/T4750—2017
糖、DNA分子质量标准（DNAMarker）、胶红（或同等效果核酸染料）实时荧光PCR反应预混液、引物和探针（见B.7）。
6样品的采集、前处理和DNA模板制备6.1总则
采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理应遵循GB19489实验室生物安全通用要求。6.2样品采集
6.2.1血液样品
用真空采血管采集样品，每管不少于5mL，编号备用。每个样品更换一支采血针头。编号后的血样经4℃静置30min，以4000r/min，离心10min，吸取血清（上清液）至1.5mL离心管内，编号备用。6.2.2组织样品
取1g样品，经勾浆器研磨后，加人4mL的样品裂解缓冲液（见B.4）悬浮，一20℃反复冻融3次，然后以5000r/min.离心5min取上清液备用。6.3样品贴运Www.bzxZ.net
样品采集后，放入保温箱中，加冰，密封，送实验室。采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存不应超过24h，若需长期保存，应放置一20℃（或以下）冰箱，冻融不超过3次。6.4样品DNA模板制备
6.4.1酚/三氯甲烷/异戊醇抽提法取处理好的血清组织样品100
于1.5mL离心
管，加人样品裂解液缓冲液500μL，混匀，加人35μL10%SDS和20g/L蛋白酶K6uL，56℃水浴作用30min。然后力加人RNA30μg，37℃作用
r/min.离心
30min.待样品冷却至室温，混匀-14000
min；吸取上清液，加人等体积的酚/三氯甲烷/0/min.离心5min：吸取上层液体，加人等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇异戊醇（25：24：1）抽提，14000（25：24：1）再抽提1次，14000r/min，离心5min：吸取上层液体加人等体积的异丙醇，沉淀DNA，室温放置10min，14000r/min，离心5min：倒掉液体，加人mL70%乙醇洗涤1次，晾干，取30μL灭菌水溶解DNA，贮存于一20℃备用或立即用于实时荧光PCR扩增。6.4.2商品化DNA抽提试剂盒提取法按照使用的商品化DNA抽提试剂盒操作说明要求提取病毒DNA。7PCR法检测步骤
7.1PCR反应体系
设反应数为n，n包括待检样品及重复、阳性对照、阴性对照和空白对照。每个PCR检测反应体系见B.8。
7.2PCR反应参数
7.2.1TTSuV1a型PCR反应参数
SN/T4750—2017
94℃，5min预变性；94℃，30s变性，60℃30s退火，72℃，2min延伸，35个循环；72℃5min延伸。
7.2.2TTSuVk2型PCR反应参数
94℃.5min预变性94℃.30s变性，62℃，30s退火，72℃，2min延伸，35个循环72℃.5min延伸。
7.31.5%琼脂糖凝胶电泳
用电泳缓冲液和琼脂糖配成浓度为1.5%的琼脂糖凝胶。取5扩增产物进行电泳，同时设置DNAMarker，在凝胶成像系统下观察并记录电泳结果。7.4PCR对照设立
7.4.1阳性对照
以TTSuVla型病毒DNA、TTSuVk2型病毒DNA分别作为TTSuV1a检测、TTSuVk2检测的阳性对照。
7.4.2阴性对照
以不含TTSuV的猪器官组织（或猪血清）DNA作为阴性对照。7.4.3
空白对照
以水作为空白对照。
7.5PCR结果判定
7.5.1PCR阳性对照判定
TTSuV1a型阳性对照，在272bp位置出现目的条带。TTSuVk2型阳性对照，在226bp位置出现目的条带。7.5.2阴性对照判定
TTSuV1a型阴性对照，在272bp位置无目的片段条带出现。TTSuVk2型阴性对照，在226bp位置无目的片段条带出现。7.5.3空白对照判定
空白对照，无扩增条带出现。
7.5.4样品结果判定
7.5.4.1阴性
阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下：在272bp位置无目的片段条带出现，表示样品中无TTSuV1a型病毒核酸，表述为TTSuV1a型3
SN/T47502017
核酸阴性
在226bp位置无目的片段条带出现，表示样品中无TTSuVk2型病毒核酸，表述为TTSuVk2型核酸阴性。
7.5.4.2阳性
阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下：在272bp位置出现目的条带，表示样品中有TTSuV1a型病毒核酸，表述为TTSuV1a型核酸阳性。
在226bp位置出现目的条带，表示样品中有TTSuVk2型病毒核酸，表述为TTSuVk2型核酸阳性。
必要情况下，需进行测序验证，比对序列参见C.1和C.2。8实时荧光PCR法检测步骤
实时荧光PCR反应体系
设反应数为n，n包括待检样品及重复、阳性对照、阴性对照和空白对照。每个实时荧光PCR反应体系见B.9，目的片段序列参见C.3和C.4。8.2
实时荧光PCR反应参数
反应参数为：95℃，90s预变性；95℃，10s变性；55℃，30s退火延伸（收集荧光信号）；反应40个循环。
8.3实时荧光PCR对照设立
阳性对照
见7.4.1。
阴性对照
见7.4.2。
空白对照
见7.4.3。
8.4结果判定
实时荧光PCR结果分析条件设定
直接读取检测结果。阅值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阅值线刚好超过正常阴性样本扩增曲线的最高点为准。
2阳性对照判定
TTSuV1a型阳性对照，FAM检测通道呈现出典型的阳性扩增曲线。TTSuVk2型阳性对照，HEX检测通道呈现出典型的阳性扩增曲线。4
8.4.3阴性对照判定
TTSuVla型阴性对照，无典型扩增曲线。TTSuVk2型阴性对照，无典型扩增曲线。空白对照判定
空白对照，FAM通道和HEX通道Ct值均无典型扩增曲线。8.4.5
样品结果判定
8.4.5.1阴性
阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下：SN/T4750—2017
FAM通道无典型扩增曲线，表示样品中无TTSuV1a型病毒核酸，表述为TTSuV1a型核酸阴性。
HEX通道无典型扩增曲线，表示样品中无TTSuVk2型病毒核酸，表述为TTSuVk2型核酸阴性。
8.4.5.2阳性
阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下：FAM检测通道Ct<35，且有典型扩增曲线，表示样品中有TTSuV1a型病毒核酸，表述为TTSuVla型核酸阳性。
HEX检测通道Ct≤35，且有典型扩增曲线，表示样品中有TTSuVk2型病毒核酸，表述为TTSuVk2型核酸阳性。
8.4.5.3复验
无论FAM通道或HEX通道，35SN/T4750—2017
附录A
（资料性附录）
猪细环病毒概述
猪细环病毒（TorquetenoSusvirus，TTSuV）属指环病毒科（Anellovirus），分为I细环病毒属和K细环病毒属2个属。TTSuV是一个无包膜、单股、环状、负链的DNA分子，氯化浮力密度为1.31g/cm~1.35g/cm，蔗糖中浮力密度是1.26g/cm2，基因组长度约3000bp，在不同种属间基因序列和长度差异极大，核酸同源性较小，具有种专一性。细环病毒可感染人，以及猫、狗、猪、牛、鸡、羊、老鼠等动物。细环病毒在人群中通过血液和血液制品途径进行传播，在粪便、唾液、胆汁、乳汁、活组织甚至毛发中均能检测到该病毒，人群的感染率多在10%以上，呈无症状带毒：在猪群中主要传播方式包括空气传播、粪-口途径、性传播、垂直传播等，呈持续感染，不同类型的细环病毒在猪群中常呈共感染，母猪感染率高于公猪，感染率60%以上。TTSuV单独感染猪致病，至今尚未有报道。TTSuV与圆环病毒2型（PCV2)共感染，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS），与猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRSV）混合感染引起皮炎肾病综合征（PDNS）。致病机理尚不明确。S
B.11mol/LTris-CI缓冲液.pH8.0附录B
（规范性附录）
试剂配制
SN/T4750—2017
称取121.1gTris-Cl.溶于800mL水中，混匀.缓慢加人浓盐酸42mL，冷却至室温，用稀盐酸调整PH至8.0.加蒸馅水至1L.分装灭菌备用B.2
0.5mol/LEDTA.pH8.0
800mL水中加人186.1gNa2-EDTA·2H.O.用磁力搅拌器搅拌均勾，稀盐酸调整pH至8.0.加蒸馏水至1L，分装灭菌备用。
1mol/LNaCI溶液
58.5gNaCl溶于1000mL蒸馅水中，分装灭菌备用B.4
样品裂解缓冲液·PH7.5
含o.o1mol/LTris-Cl,o.oolmol/LEDTA,o.1mol/LNaCl.10%SDS
10gSDS溶解于100mL灭菌蒸馏水
PCR检测法引物序列
PCR检测法引物序列见表B.1。
表B.1PCR检测法引物序列
Vla-S3
Vla-S4
Vk2-T3
Vk2-T4
S3/T3：上游引物。
S4/T4：下游引物。
序列（5-3\）
CAATTTGGCTCGCTTCGCTCGC
TACTTATATTCGCTTTCGTGGGAAC
CCAAACCACAGGAAACTGTGC
CTTGACTCCGCTCTCAGGAG
24~295
121~346
产物大小
SN/T4750—2017
实时荧光PCR检测法引物探针序列实时荧光PCR检测法引物探针序列见表B.2。表B.2
F：上游引物。
R下游引物。
P：探针。
PCR检测反应体系
实时荧光PCR检测法引物和探针序列序列（5-3）
GGTTCAGGAGGCTCAATTTGG
TTTGAATTTAACGGTTTTCAGTCTTC
FAM-TCGCTTCGCTCGCACCACGT-BHQ1TATCGGGCAGGCGGTAATC
TACGCTACCGTCAGCCATCTTT
HEX-AACCGGGCCCCCCTCGATG-BHQIPCR检测反应体系见表B.3。
MasterMix(2x)
上游引物（10μmol/L）
下游引物（10μmol/L）
DNA模板
AddddH,Oto
实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表B.4。PCR反应体系
10 μL
20 μL
12~100
353~421
Master Mix(2x)
上游引物（10μmol/L）
下游引物（10pmol/L）
探针（10μmol/L）
DNA模板
AddddHzOto
实时荧光PCR反应体系
20 μL
SN/T4750—2017
SN/T4750—2017
C.1TTSuV1a型PCR扩增目的片段
附录C
（资料性附录）
扩增目的片段序列
1 tacacttccg ggttcaggag gctcaatttg gctcgcttcg ctcgcaccac gtttgctgcc6l aggcggacct gattgaagac tgaaaaccgt taaattcaaa tttgaaaatg gcgggcaaaa12l tggcggacag ggggcgggga ttatgcaaat taatttatgc aaagtaggag gagctcgatt18l ttaatttatg caaagtagga ggagtcattt ctgattggtc gggagctcaa gtcctcattt24l gcatagggtg taaccaatca gatttaaggc gttcccacta aagtgaatat aagtgagtgcC.2TTSuVk2型PCR扩增目的片段
12l ccaaaccaca ggaaactgtg caaaaaagag gaaataaatt tcattggctg ggcctgaagt18l cctcattaga ataataaaag aaccaatcag aagaacttcc tctttagag tatataagta24l agtgcgcaga cgaatggctg agtttatgcc gctggtggta gacacgaaca gagctgagtg301 tctaaccgcc tgggcgggtg ccggagctcc tgagagcgga gtcaaggggc ctatcgggcaC.3TTSuV1a型实时荧光PCR扩增目的片段sggttcaggaggctcaatttg
1tacacttccg
6l aggcggacct gattgaagac tgaaaaccgtC.4TTSuVk2型实时荧光PCR扩增目的片段tcgcticgctcgcaccacgtttgctgcctaaattcaaa tttgaaaatg gcgggcaaaagtcaaggggcctatcgggca
301 tctaaccgcc tgggcgggtg ccggagctcc tgagagcgga36l ggcggtaatc cagcggaaee gggcccccct cgatggaagaaagatggctgacggtagcgt
421 actgcgcaca cggattattc tgcagctgta aagacccgaa aaaacatctt gaaaaatgcc10
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猪细环病毒检疫技术规范
Quarantine protocol for swine torque teno sus virus2017-05-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4750—2017
本标准起草单位：中华人民共和国江西出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学院、江西省检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：杨春华、孙思扬、张强、陈庆富、周延、孙洁、祝建新、罗秋红、花群义I
1范围
猪细环病毒检疫技术规范
本标准规定了猪细环病毒PCR检测法和实时荧光PCR检测法的操作方法本标准适用于猪及其产品中猪细环病毒核酸的检测规范性引用文件
SN/T4750—2017
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范3防污染措施
本标准涉及的所有操作应符合GB19489，及SN/T2025的有关规定4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）4.1
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）TTSuV：猪细环病毒（SwineTorqueTenoSusVirus）（参见附录A）4.7
5设备、材料和试剂
5.1设备、材料
PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌器、冰箱、微量可调移液器及吸头、冷冻离心机、1.5mL离心管。
2试剂
除特别说明外，本标准所用试剂均为分子生物学级试验用水应符合GB/T6682的要求：样品裂解缓冲液（见B.4）、10%SDS、20g/L蛋白酶K、RNA酶、酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1）、异丙醇、70%乙醇（用无水乙醇和DEPC水配制）、DEPC水、PCR反应预混液、PCR引物（见B.6）、电泳缓冲液、琼脂1
SN/T4750—2017
糖、DNA分子质量标准（DNAMarker）、胶红（或同等效果核酸染料）实时荧光PCR反应预混液、引物和探针（见B.7）。
6样品的采集、前处理和DNA模板制备6.1总则
采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理应遵循GB19489实验室生物安全通用要求。6.2样品采集
6.2.1血液样品
用真空采血管采集样品，每管不少于5mL，编号备用。每个样品更换一支采血针头。编号后的血样经4℃静置30min，以4000r/min，离心10min，吸取血清（上清液）至1.5mL离心管内，编号备用。6.2.2组织样品
取1g样品，经勾浆器研磨后，加人4mL的样品裂解缓冲液（见B.4）悬浮，一20℃反复冻融3次，然后以5000r/min.离心5min取上清液备用。6.3样品贴运Www.bzxZ.net
样品采集后，放入保温箱中，加冰，密封，送实验室。采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存不应超过24h，若需长期保存，应放置一20℃（或以下）冰箱，冻融不超过3次。6.4样品DNA模板制备
6.4.1酚/三氯甲烷/异戊醇抽提法取处理好的血清组织样品100
于1.5mL离心
管，加人样品裂解液缓冲液500μL，混匀，加人35μL10%SDS和20g/L蛋白酶K6uL，56℃水浴作用30min。然后力加人RNA30μg，37℃作用
r/min.离心
30min.待样品冷却至室温，混匀-14000
min；吸取上清液，加人等体积的酚/三氯甲烷/0/min.离心5min：吸取上层液体，加人等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇异戊醇（25：24：1）抽提，14000（25：24：1）再抽提1次，14000r/min，离心5min：吸取上层液体加人等体积的异丙醇，沉淀DNA，室温放置10min，14000r/min，离心5min：倒掉液体，加人mL70%乙醇洗涤1次，晾干，取30μL灭菌水溶解DNA，贮存于一20℃备用或立即用于实时荧光PCR扩增。6.4.2商品化DNA抽提试剂盒提取法按照使用的商品化DNA抽提试剂盒操作说明要求提取病毒DNA。7PCR法检测步骤
7.1PCR反应体系
设反应数为n，n包括待检样品及重复、阳性对照、阴性对照和空白对照。每个PCR检测反应体系见B.8。
7.2PCR反应参数
7.2.1TTSuV1a型PCR反应参数
SN/T4750—2017
94℃，5min预变性；94℃，30s变性，60℃30s退火，72℃，2min延伸，35个循环；72℃5min延伸。
7.2.2TTSuVk2型PCR反应参数
94℃.5min预变性94℃.30s变性，62℃，30s退火，72℃，2min延伸，35个循环72℃.5min延伸。
7.31.5%琼脂糖凝胶电泳
用电泳缓冲液和琼脂糖配成浓度为1.5%的琼脂糖凝胶。取5扩增产物进行电泳，同时设置DNAMarker，在凝胶成像系统下观察并记录电泳结果。7.4PCR对照设立
7.4.1阳性对照
以TTSuVla型病毒DNA、TTSuVk2型病毒DNA分别作为TTSuV1a检测、TTSuVk2检测的阳性对照。
7.4.2阴性对照
以不含TTSuV的猪器官组织（或猪血清）DNA作为阴性对照。7.4.3
空白对照
以水作为空白对照。
7.5PCR结果判定
7.5.1PCR阳性对照判定
TTSuV1a型阳性对照，在272bp位置出现目的条带。TTSuVk2型阳性对照，在226bp位置出现目的条带。7.5.2阴性对照判定
TTSuV1a型阴性对照，在272bp位置无目的片段条带出现。TTSuVk2型阴性对照，在226bp位置无目的片段条带出现。7.5.3空白对照判定
空白对照，无扩增条带出现。
7.5.4样品结果判定
7.5.4.1阴性
阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下：在272bp位置无目的片段条带出现，表示样品中无TTSuV1a型病毒核酸，表述为TTSuV1a型3
SN/T47502017
核酸阴性
在226bp位置无目的片段条带出现，表示样品中无TTSuVk2型病毒核酸，表述为TTSuVk2型核酸阴性。
7.5.4.2阳性
阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下：在272bp位置出现目的条带，表示样品中有TTSuV1a型病毒核酸，表述为TTSuV1a型核酸阳性。
在226bp位置出现目的条带，表示样品中有TTSuVk2型病毒核酸，表述为TTSuVk2型核酸阳性。
必要情况下，需进行测序验证，比对序列参见C.1和C.2。8实时荧光PCR法检测步骤
实时荧光PCR反应体系
设反应数为n，n包括待检样品及重复、阳性对照、阴性对照和空白对照。每个实时荧光PCR反应体系见B.9，目的片段序列参见C.3和C.4。8.2
实时荧光PCR反应参数
反应参数为：95℃，90s预变性；95℃，10s变性；55℃，30s退火延伸（收集荧光信号）；反应40个循环。
8.3实时荧光PCR对照设立
阳性对照
见7.4.1。
阴性对照
见7.4.2。
空白对照
见7.4.3。
8.4结果判定
实时荧光PCR结果分析条件设定
直接读取检测结果。阅值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阅值线刚好超过正常阴性样本扩增曲线的最高点为准。
2阳性对照判定
TTSuV1a型阳性对照，FAM检测通道呈现出典型的阳性扩增曲线。TTSuVk2型阳性对照，HEX检测通道呈现出典型的阳性扩增曲线。4
8.4.3阴性对照判定
TTSuVla型阴性对照，无典型扩增曲线。TTSuVk2型阴性对照，无典型扩增曲线。空白对照判定
空白对照，FAM通道和HEX通道Ct值均无典型扩增曲线。8.4.5
样品结果判定
8.4.5.1阴性
阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下：SN/T4750—2017
FAM通道无典型扩增曲线，表示样品中无TTSuV1a型病毒核酸，表述为TTSuV1a型核酸阴性。
HEX通道无典型扩增曲线，表示样品中无TTSuVk2型病毒核酸，表述为TTSuVk2型核酸阴性。
8.4.5.2阳性
阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下：FAM检测通道Ct<35，且有典型扩增曲线，表示样品中有TTSuV1a型病毒核酸，表述为TTSuVla型核酸阳性。
HEX检测通道Ct≤35，且有典型扩增曲线，表示样品中有TTSuVk2型病毒核酸，表述为TTSuVk2型核酸阳性。
8.4.5.3复验
无论FAM通道或HEX通道，35
附录A
（资料性附录）
猪细环病毒概述
猪细环病毒（TorquetenoSusvirus，TTSuV）属指环病毒科（Anellovirus），分为I细环病毒属和K细环病毒属2个属。TTSuV是一个无包膜、单股、环状、负链的DNA分子，氯化浮力密度为1.31g/cm~1.35g/cm，蔗糖中浮力密度是1.26g/cm2，基因组长度约3000bp，在不同种属间基因序列和长度差异极大，核酸同源性较小，具有种专一性。细环病毒可感染人，以及猫、狗、猪、牛、鸡、羊、老鼠等动物。细环病毒在人群中通过血液和血液制品途径进行传播，在粪便、唾液、胆汁、乳汁、活组织甚至毛发中均能检测到该病毒，人群的感染率多在10%以上，呈无症状带毒：在猪群中主要传播方式包括空气传播、粪-口途径、性传播、垂直传播等，呈持续感染，不同类型的细环病毒在猪群中常呈共感染，母猪感染率高于公猪，感染率60%以上。TTSuV单独感染猪致病，至今尚未有报道。TTSuV与圆环病毒2型（PCV2)共感染，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS），与猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRSV）混合感染引起皮炎肾病综合征（PDNS）。致病机理尚不明确。S
B.11mol/LTris-CI缓冲液.pH8.0附录B
（规范性附录）
试剂配制
SN/T4750—2017
称取121.1gTris-Cl.溶于800mL水中，混匀.缓慢加人浓盐酸42mL，冷却至室温，用稀盐酸调整PH至8.0.加蒸馅水至1L.分装灭菌备用B.2
0.5mol/LEDTA.pH8.0
800mL水中加人186.1gNa2-EDTA·2H.O.用磁力搅拌器搅拌均勾，稀盐酸调整pH至8.0.加蒸馏水至1L，分装灭菌备用。
1mol/LNaCI溶液
58.5gNaCl溶于1000mL蒸馅水中，分装灭菌备用B.4
样品裂解缓冲液·PH7.5
含o.o1mol/LTris-Cl,o.oolmol/LEDTA,o.1mol/LNaCl.10%SDS
10gSDS溶解于100mL灭菌蒸馏水
PCR检测法引物序列
PCR检测法引物序列见表B.1。
表B.1PCR检测法引物序列
Vla-S3
Vla-S4
Vk2-T3
Vk2-T4
S3/T3：上游引物。
S4/T4：下游引物。
序列（5-3\）
CAATTTGGCTCGCTTCGCTCGC
TACTTATATTCGCTTTCGTGGGAAC
CCAAACCACAGGAAACTGTGC
CTTGACTCCGCTCTCAGGAG
24~295
121~346
产物大小
SN/T4750—2017
实时荧光PCR检测法引物探针序列实时荧光PCR检测法引物探针序列见表B.2。表B.2
F：上游引物。
R下游引物。
P：探针。
PCR检测反应体系
实时荧光PCR检测法引物和探针序列序列（5-3）
GGTTCAGGAGGCTCAATTTGG
TTTGAATTTAACGGTTTTCAGTCTTC
FAM-TCGCTTCGCTCGCACCACGT-BHQ1TATCGGGCAGGCGGTAATC
TACGCTACCGTCAGCCATCTTT
HEX-AACCGGGCCCCCCTCGATG-BHQIPCR检测反应体系见表B.3。
MasterMix(2x)
上游引物（10μmol/L）
下游引物（10μmol/L）
DNA模板
AddddH,Oto
实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表B.4。PCR反应体系
10 μL
20 μL
12~100
353~421
Master Mix(2x)
上游引物（10μmol/L）
下游引物（10pmol/L）
探针（10μmol/L）
DNA模板
AddddHzOto
实时荧光PCR反应体系
20 μL
SN/T4750—2017
SN/T4750—2017
C.1TTSuV1a型PCR扩增目的片段
附录C
（资料性附录）
扩增目的片段序列
1 tacacttccg ggttcaggag gctcaatttg gctcgcttcg ctcgcaccac gtttgctgcc6l aggcggacct gattgaagac tgaaaaccgt taaattcaaa tttgaaaatg gcgggcaaaa12l tggcggacag ggggcgggga ttatgcaaat taatttatgc aaagtaggag gagctcgatt18l ttaatttatg caaagtagga ggagtcattt ctgattggtc gggagctcaa gtcctcattt24l gcatagggtg taaccaatca gatttaaggc gttcccacta aagtgaatat aagtgagtgcC.2TTSuVk2型PCR扩增目的片段
12l ccaaaccaca ggaaactgtg caaaaaagag gaaataaatt tcattggctg ggcctgaagt18l cctcattaga ataataaaag aaccaatcag aagaacttcc tctttagag tatataagta24l agtgcgcaga cgaatggctg agtttatgcc gctggtggta gacacgaaca gagctgagtg301 tctaaccgcc tgggcgggtg ccggagctcc tgagagcgga gtcaaggggc ctatcgggcaC.3TTSuV1a型实时荧光PCR扩增目的片段sggttcaggaggctcaatttg
1tacacttccg
6l aggcggacct gattgaagac tgaaaaccgtC.4TTSuVk2型实时荧光PCR扩增目的片段tcgcticgctcgcaccacgtttgctgcctaaattcaaa tttgaaaatg gcgggcaaaagtcaaggggcctatcgggca
301 tctaaccgcc tgggcgggtg ccggagctcc tgagagcgga36l ggcggtaatc cagcggaaee gggcccccct cgatggaagaaagatggctgacggtagcgt
421 actgcgcaca cggattattc tgcagctgta aagacccgaa aaaacatctt gaaaaatgcc10
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