中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4877.2--2017 基因条形码筛查方法 第2部分：检疫性黄单胞菌 (DNA barcoding screening method Part 2: Quarantine Xanthomonas spp) 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 前言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分为3个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；第2部分：检疫性黄单胞菌；第3部分：检疫性植原体。 本部分为SN/T4877的第2部分。 本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草SN/T4877.2—2017。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云浮出入境检验检疫局、中华人民共和国满洲里出入境检验检疫局、中国农科院生物技术研究所。 本部分主要起草人：田茜、冯建军、何旭诺、刘玮琦、赵文军、李为民。 1 范围 SN/T4877的本部分规定了检疫性黄单胞菌DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于检疫性黄单胞菌的筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1400 甘蔗流胶病菌检疫鉴定方法 SN/T2372 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌的检测方法 SN/T3278 香蕉坏死条纹病菌检疫鉴定方法 SN/T3431 芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法 SN/T4073 风信子黄腐病菌检疫鉴定方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码：生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.2 16S rRNA基因：原核生物核糖体30S小亚基的组成部分，16S rRNA基因序列具有高度的保守性和特异性，是细菌种间鉴定的重要依据。 3.3 cpn60基因：编码伴侣蛋白60（cpn60，又叫热休克蛋白60/Hsp60）的基因，为单拷贝基因，广泛存在于细菌及真核生物细胞中，是系统进化分析的有效分子标记。 4 黄单胞菌属基本信息 学名：Xanthomonas 分类地位：细菌界（Bacteria），变形菌门（Proteobacteria），$gamma$-变形菌纲（Gammaproteobacteria），黄单胞菌目（Xanthomonodales），黄单胞菌科（Xanthomonodaceae），黄单胞菌属（Xanthomonas）。 黄单胞菌属是最重要的植物病原细菌属，该属目前包括了14个进境植物检疫性有害生物： 1. 甘蔗白色条纹病菌（Xanthomonas albilineans）； 2. 香蕉坏死条纹病菌（Xanthomonas arboricola pv. celebensis）； 3. 胡椒叶斑病菌（Xanthomonas axonopodis pv. betlicola）； 4. 柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri）； 5. 木薯细菌性萎蔗病菌（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis）； 6. 甘蔗流胶病菌（Xanthomonas axonopodis pv. asculorum）； 7. 芒果黑斑病菌（Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae）； 8. 香蕉细菌性菱病菌（Xanthomonas campestris pv. musacearum）； 9. 木薯细菌性叶斑病菌（Xanthomonas cassavae）； 10. 草莓角斑病菌（Xanthomonas fragariae）； 11. 风信子黄腐病菌（Xanthomonas hyacinthi）； 12. 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）； 13. 水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）； 14. 杨树细菌性溃疡病菌（Xanthomonas populi）。 5 方法原理 根据细菌核糖体16S rRNA基因序列分析确定目标细菌是否为黄单胞菌，然后根据cpn60基因序列分析对目标细菌进行筛查。 6 仪器设备和主要试剂 6.1 仪器设备 生物安全柜、高压灭菌锅、生化培养箱、离心机、微量分光光度仪、PCR仪、电泳设备、凝胶成像系统、冰箱等。 6.2 主要试剂 细菌DNA提取试剂盒、PCRPremix、超纯水、DNAmarker。 7 筛查鉴定方法 7.1 DNA制备 对细菌进行液体培养或平板培养，利用商品化细菌DNA提取试剂盒制备细菌总DNA，测定DNA浓度及纯度后，保存于-20℃冰箱备用。 7.2 16S rRNA基因序列扩增测序 利用通用引物进行16S rRNA基因扩增测序（具体步骤见附录A），将序列在Genbank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对，若与数据库中黄单胞菌16S rRNA基因序列相似性大于97%，则进行7.3操作。 7.3 cpn60基因序列扩增 利用通用引物进行cpn60基因序列扩增测序（具体步骤见附录B）。 7.4 序列分析 将cpn60基因序列在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，采用邻接法构建基于cpn60基因序列的NJ树。 8 结果判定 16S rRNA基因序列长度大于1200bp，在Genbank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中黄单胞菌16S rRNA基因序列相似性大于97%，则判定该菌为黄单胞菌。 cpn60基因序列长度大于540bp，在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中某黄单胞菌的cpn60基因序列同源性大于98%，且在NJ树中聚在同一分支，则初步判定为该黄单胞菌。 若判定为目标检疫性黄单胞菌，有相应标准的需要根据标准方法（SN/T3431或SN/T1400或SN/T4073或SN/T3278或SN/T2372）进行最终鉴定，无相应标准的需要按照常规细菌鉴定方法进行最终鉴定。 9 样品保存 9.1 样品保存 分离并最终鉴定为检疫性目标细菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃低温冰箱中保存，定期（30天～60天）转接，必要时冻干后长期保存。 9.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。 附录A（规范性附录） A.1 引物序列 16S rRNA基因扩增程序 16sF-LYP-3: 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCGTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 16sR-LYP-3: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGACGGGCGGTGTGTRCA-3 注：下划线部分为测序引物，全部序列都要合成（R=G或A）。 A.2 PCR体系及扩增程序 推荐用50μL体系，采用商品化的PCRPremix进行PCR扩增，反应体系中引物浓度为200nmol/L，DNA模板量为10ng~100ng。 PCR反应程序：94℃5min; 94℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环; 72℃10min。该引物为通用引物，每次做PCR应做空白对照，以确认是否污染。 A.3 电泳及测序 取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物大小：约1200bp左右。测序引物为M13-47及RV-M(或M13-48)。 附录B（规范性附录） B.1 引物序列 cpn60基因扩增程序 先用H1594/H1595扩增，若效果不理想，再利用H729/H730扩增。 H1594: 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGACGTCGCCGGTGACGGCACCACCAC-3 H1595: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGACGACGGTCGCCGAAGCCCGGGGCCTT-3 H729: 5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGAII1IGCIGGIGAYGGIACIACIAC-3 H730: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAYKIYKITCICCRAAICCIGGIGC-3 注：下划线部分为测序引物，全部序列都要合成（I=次黄嘌呤，Y=C或T，R=G或A，K=G或T）。 B.2 PCR体系及扩增程序 推荐用50μL体系，采用商品化的PCRPremix进行PCR扩增，反应体系中引物浓度为200nmol/L，DNA模板量为10ng~100ng。 PCR反应程序： H1594/H1595: 94℃5min; 94℃30s, 57℃30s, 72℃45s, 35个循环; 72℃10min。 H729/H730: 94℃5min; 94℃30s, 50℃30s, 72℃45s, 35个循环; 72℃10min。 该引物为通用引物，每次做PCR应做空白对照，以确认是否污染。