SN/T 4853.1-2017
基本信息
标准号： SN/T 4853.1-2017
中文名称：转基因大米定量检测数字PCR法第1部分:TT51-1品系
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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下载大小：4000624
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4853.1-2017.Quantitative detection of genetically modified rice-Digital PCR-Part 1:Event TT51-1.
1范围
SN/T 4853.1规定了稻谷和大米中TT51-1品系的数字PCR定量检测方法。
SN/T 4853.1适用于稻谷和大米中TT51-1品系特异性的数字PCR定量检测。
本方法的定量检测低限(LOQ)为0.1%(质量分数)。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.1转基因产 品检测通用要求 和定义
GB/T 19495.2转基因产 品检测实验室技术要求
GB/T 19495.3转基因产品检测核 酸提取纯化方法
GB/T 19495.5转基因产品检测核酸定量 PCR检测方法
GB/T 19495.7转基因产 品检测抽样和制样方法
SN/T 1194植物及其产 品转基因成分检测抽样和制样方法
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1SPS基因the gene of sucrose phosphate synthase
蔗糖磷酸合成酶基因,大米单拷贝内参照基因。
3.1.2 TT51-1转化体特异性序列event-specific sequence of TT51-1
外源DNA插入受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。
3.1.3Taq酶Taq DNA polymerase
源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。
3.1.4模板template
数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。
1范围
SN/T 4853.1规定了稻谷和大米中TT51-1品系的数字PCR定量检测方法。
SN/T 4853.1适用于稻谷和大米中TT51-1品系特异性的数字PCR定量检测。
本方法的定量检测低限(LOQ)为0.1%(质量分数)。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.1转基因产 品检测通用要求 和定义
GB/T 19495.2转基因产 品检测实验室技术要求
GB/T 19495.3转基因产品检测核 酸提取纯化方法
GB/T 19495.5转基因产品检测核酸定量 PCR检测方法
GB/T 19495.7转基因产 品检测抽样和制样方法
SN/T 1194植物及其产 品转基因成分检测抽样和制样方法
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1SPS基因the gene of sucrose phosphate synthase
蔗糖磷酸合成酶基因,大米单拷贝内参照基因。
3.1.2 TT51-1转化体特异性序列event-specific sequence of TT51-1
外源DNA插入受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。
3.1.3Taq酶Taq DNA polymerase
源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。
3.1.4模板template
数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4853.1—2017
转基因大米定量检测
数字PCR法
第1部分：TT51-1品系
Quantitative detection of genetically modified rice-Digital PCR-Part1:EventTT51-1
2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T4853《转基因大米定量检测第1部分：TT51-1品系；
第2部分：克稻品系；
第3部分：科丰6号品系；
第4部分：M12品系；
一第5部分：LL62品系；
一第6部分：T2A-1品系；
一第7部分：TTC-19品系。
本部分为SN/T4853的第1部分。
数字PCR法》系列标准共分为7部分：本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4853.1—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。
本部分主要起草人：陈颖、黄文胜、邓婷婷、聂丹丹、朱水芳、吴亚君、付伟、李想、韩建勋。1
1范围
转基因大米定量检测
数字PCR法
第1部分：TT51-1品系
SN/T4853.1—2017
SN/T4853的本部分规定了稻谷和大米中TT51-1品系的数字PCR定量检测方法。本部分适用于稻谷和大米中TT51-1品系特异性的数字PCR定量检测。本方法的定量检测低限（LOQ）为0.1%（质量分数）。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测
GB/T19495.2
GB/T19495.3
GB/T19495.5
转基因产品检测
转基因产品检测
转基因产品检测
GB/T19495.7
转基因产品检测
SN/T1194
通用要求和定义
实验室技术要求
核酸提取纯化方法
核酸定量PCR检测方法
抽样和制样方法
植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
thegeneof sucrosephosphatesynthaseSPS基因
燕糖磷酸合成酶基因，大米单拷贝内参照基因。3.1.2
TT51-1转化体特异性序列event-specificsequenceofTT51-1外源DNA插入受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。3.1.3
Tag酶Taq DNApolymerase
源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。3.1.4
模板template
数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。3.1.5
定量检测低限limitofquantification;LoQ在相对标准差不超过25%的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量1
SN/T4853.1—2017
品qualitycontrolsample
质控样品
具有确定的SPS基因和转化体特异性序列拷贝数的TT51-1转化体基因组DNA。3.1.7
微反应体系tinyreactionsystem将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液充分混匀之后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水液滴或其他微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系。3.1.8
conversionfactor
转换系数
将转化体特异性序列和内参照基因拷贝数之比转换为转基因成分含量（W/W）时所用系数。3.1.9
ffluorescentlytagged probe
荧光标记探针
在5末端和3末端分别连接荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针水解，使报告基团和淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
数字PCR：数字聚合酶链式反应（digitalpolymerasechainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）bp：碱基对（basepair）
NC：阴性对照（negaitivecontrol）NTC：空白对照（notemplatecontrol）PC：阳性对照（positivecontrol）4防污染措施
数字PCR定量检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。5原理
数字PCR（digitalPCR）是在荧光PCR基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板的绝对拷贝数的测定，通过将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液的荧光PCR反应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的大数量（天于10000个）微反应体系，使每个模板独立随机地分配至微反应体系中；所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应之后，根据设定的荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果；依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字PCR反应体系中的模板浓度。
依据样品DNA溶液中的转化体特异性序列（eventspecific sequence）和内参照基因（speciesspecificgene）的模板浓度之比，得到样品中相应的转基因品系含量。6仪器和设备
6.1超纯水发生器（分子生物学级别）。2
6.2分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.3
生物安全柜。
PCR扩增仪。
SN/T4853.1—2017
数字PCR系统：微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其他具有同样功能的仪器。
6.6恒温孵育箱：控温精度士1.0℃。6.7
样品粉碎机：可将大米或稻谷样品磨成60自左右的粉末。核酸定量仪：Nanodrop3ooo或Modulus检测仪或其他核酸定量检测仪。6.9
涡旋振荡仪。
离心机：最大离心加速度大于15000g，并适用0.2mL和1.5mL离心管。移液枪：量程0.5μL~10μL，量程10μ~100μL，量程100μL~1000μL7试剂和材料
除另有规定外，试剂和材料质量应符合GB/T19495.1的要求。7.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。7.2数字PCR顶混液：含有镁离子、dNTPs和具有5-3外切活性的热启动TaqDNA聚合酶的数字PCR专用预混试剂。
7.3引物和探针：SPS基因和TT51-1转化体特异性序列的数字PCR检测引物和探针信息详见表1。7.4
数字PCR微反应体系生成联排管或芯片。96孔荧光定量PCR反应板和封膜。0.2mL和1.5mL离心管。
移液枪头，量程0.5μL～10μL；量程10μL~100μL；量程100μL~1000μL。表1SPS基因和TT51-1转化体特异性序列的引物和探针扩增基因
SPS基因
TT51-1转化
体特异性序列
上游引物
下游引物
上游引物
下游引物
序列（5°-3\）
GAGGTCACCAAGGCTGCCAGTG
GCACTCCTGATTCTTCCAGGCTTC
VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA-BHQ1CTAGAGGATCCCGGACGAGTG
ATGAGTGGTAGCGTCCAGAAGGAAA
FAM-CTGGGGCAGATAAGCAGTAGTGGTGGG-BHQ注1：表中PCR体系中引物/探针的终浓度可根据每合成批次的验证结果进行适当调整。PCR扩增
片段长度
注2：荧光探针的发光基因应与数字PCR仪的荧光通道匹配，通常用5-FAM/3*-BHQ1或5°-VIC/3-BHQ1方式标记。
注3：新合成的引物/探针干粉进行配制时，先将引物/探针贮存管短暂离心，然后开盖加纯水溶解，并稀释至10umol/L后分装，-20℃避光保存。3
SN/T4853.1—2017
实验步骤
8.1抽样
按照GB/T19495.7的规定执行。
8.2样品制备
除另有规定外，样品制备按照GB/T19495.7或SN/T1194的规定执行。将样品适度破碎、均一化，取出至少200g，全部放人样品研磨机中，研磨至60目左右粒度。破碎和研磨过程中应调整设备的操作参数，避免过热并防止样品粘连。8.3核酸提取纯化
8.3.1核酸提取及PCR抑制物的判断除另有规定外，DNA提取纯化及PCR抑制物的判断按照GB/T19495.3中的规定执行称取2份（每份2g）研磨后样品作为测试样，分别提取基因组DNA。8.3.2模板浓度控制
采用PicoGreendsDNA荧光定量试剂盒或其他具有等效结果的仪器/方法测定DNA溶液的浓度，具体操作步骤参照相关仪器/试剂盒说明书。数字PCR体系中的模板数应不高于微反应体系数的5倍。为保证定量结果的准确性，体系中总模板数应不低于400个拷贝。将样品DNA溶液作适度稀释，选择模板浓度在100拷贝/μL～20000拷贝/μL范围内的稀释液分别用于SPS基因拷贝数和转化体特异性序列拷贝数的数字PCR定量检测。8.4数字PCR扩增
数字PCR体系配制
按表2将各组分加入洁净离心管中，充分混匀。表2数字PCR反应体系
2X数字PCR预混液
SPS基因正向引物（10μmol/L)
SPS基因反向引物（10μmol/L）SPS基因荧光标记探针（10μmol/L）DNA模板
dHO（无菌水）
2×数字PCR预混液
TF51-1正向引物（10μmol/L）
内源基因反应体系
外源基因反应体系
终浓度
0.32μmol/L
0.32μmol/L
0.12μmol/L
0.32μmol/L
TT51-1反向引物（10μmol/L）
TT51-1荧光标记探针溶液（10μmol/L）DNA模板
dH,O（无菌水）
表2（续）
外源基因反应体系
SN/T4853.1—2017
终浓度
0.32μmol/L
0.2μmol/L
注：数字PCR反应体系的总体积可根据不同厂家型号的数字PCR仪作相应调整。PCR体系配制及转移时尽量避免产生气泡。
8.4.2微反应体系生成、数字PCR扩增及结果读取根据仪器要求，将配制好的数字PCR反应混合液，加人微反应体系生成装置的加样孔中，按仪器操作说明生成微反应体系。将微反应体系放置于PCR扩增仪中，按以下参数进行PCR扩增：95℃，5min（1℃/s），1个循环，94℃155.60℃，1min1℃/s），50个循环，98℃10min（1℃/s），1个循环；12℃保存反应产物。对微反应体系进行荧光检测.记录阳性和阴性微反应体系数量及其比值。根据比值分别计算数字PCR反应体系中的SPS基因拷贝数（copies/ul）和TT51-1转化体特异性序列拷贝数(copies/μL)。
注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当地调整。9检测质量控制
9.1对照设置
阴性对照（NC）、空白对照（NTC）和阳性对照（PC)的设置如下：a)
NC：采用非转基因大米的基因组DNA作为数字PCR反应模板；NTC：采用水作为数字PCR反应模板；b）
PC：采用质控样品的基因组DNA作为数字PCR反应模板。每个测试样和PC的SPS基因或TT51-1转化体特异性序列的数字PCR应设置至少3个平行，且3个平行实验结果的相对标准偏差应不高于20%。9.2检测结果有效性判定
以下结果中若有一项不符合，则样品检测结果无效，应查找原因并重做试验：NC和NTC的TT51-1转化体特异性检测无阳性扩增：a)
PC的SPS基因或TT51-1转化体特异性序列检测有阳性扩增；b）
PC的定量结果与已知值相符。
10结果计算
数字PCR仪运行后经软件计算得出每个测试样的SPS基因拷贝数和TT51-1转化体特异性序列拷贝数，取3个平行试验的均值，按照式（1)计算测试样的转基因成分含量：5
SN/T4853.1—2017
式中：
CXD×100%
A转基因大米品系TT51-1的含量，%；B
TT51-1转化体特异性序列拷贝数；C大米内参照基因SPS拷贝数：bzxz.net
D转换系数。
注：不同的大米或水稻样品有不同的转换系数，具体为：市售杂交稻种样品（F1代）的转换系数为0.33，市售杂交霜谷和大米样品（F2代）的转换系数为0.50。10.2如两个测试样的TT51-1品系含量的相对相差大于或等于35%，则测试结果应放弃，并应重做样品制备及后续试验。相对相差的计算参照GB/T19495.5中的规定执行。10.3如两个测试样的TT51-1品系含量的相对相差小于35%，则样品的定量检测结果等于两个测试样转基因大米品系TT51-1成分含量的平均值。11
结果表述
定量检测结果有四种情况，每种检测结果的表述如表3所示。表3结果表述
检测结果
未检出SPS基因
检出SPS基因，但未检出TT51-1转化体特异性序列
检出SPS基因和TT51-1转化体特异性序列，但其含量小于定量方法检测低限
检出SPS基因和TT51-1转化体特异性序列，其含量大于定量方法检测低限
未检出大米成分
结果表述
未检出转基因大米TT51-1品系成分检出转基因大米TT51-1品系成分，但含量低于本定量方法的LOQ(0.1%)
检出转基因大米TT51-1品系成分，含量为X%附录A
（资料性附录）
转基因大米TT51-1转化体特异性序列SN/T4853.1-2017
转基因大米TT51-1转化体特异性序列为CTAGAGGATCCCGGACGAGTGCTGGGGCAGATAAGCAGTAGTGGTGGGGCTACGAACATATTCCTTTTCCTTCTGGACGCTACCACTCAT。注：阴影部分为转基因大米品系TT51-1外源基因序列，带下划线部分为水稻基因组序列。SN/T4853.1-2017
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
转基因大米定量检测数字PCR法
第1部分：TT51-1品系
SN/T4853.1-2017
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
印张0.75
5字数16千字
2018年5月第一版2018年5月第一次印刷印数1-500
书号：155066·2-33311定价16.00元8
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转基因大米定量检测
数字PCR法
第1部分：TT51-1品系
Quantitative detection of genetically modified rice-Digital PCR-Part1:EventTT51-1
2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T4853《转基因大米定量检测第1部分：TT51-1品系；
第2部分：克稻品系；
第3部分：科丰6号品系；
第4部分：M12品系；
一第5部分：LL62品系；
一第6部分：T2A-1品系；
一第7部分：TTC-19品系。
本部分为SN/T4853的第1部分。
数字PCR法》系列标准共分为7部分：本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4853.1—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。
本部分主要起草人：陈颖、黄文胜、邓婷婷、聂丹丹、朱水芳、吴亚君、付伟、李想、韩建勋。1
1范围
转基因大米定量检测
数字PCR法
第1部分：TT51-1品系
SN/T4853.1—2017
SN/T4853的本部分规定了稻谷和大米中TT51-1品系的数字PCR定量检测方法。本部分适用于稻谷和大米中TT51-1品系特异性的数字PCR定量检测。本方法的定量检测低限（LOQ）为0.1%（质量分数）。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测
GB/T19495.2
GB/T19495.3
GB/T19495.5
转基因产品检测
转基因产品检测
转基因产品检测
GB/T19495.7
转基因产品检测
SN/T1194
通用要求和定义
实验室技术要求
核酸提取纯化方法
核酸定量PCR检测方法
抽样和制样方法
植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
thegeneof sucrosephosphatesynthaseSPS基因
燕糖磷酸合成酶基因，大米单拷贝内参照基因。3.1.2
TT51-1转化体特异性序列event-specificsequenceofTT51-1外源DNA插入受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。3.1.3
Tag酶Taq DNApolymerase
源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。3.1.4
模板template
数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。3.1.5
定量检测低限limitofquantification;LoQ在相对标准差不超过25%的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量1
SN/T4853.1—2017
品qualitycontrolsample
质控样品
具有确定的SPS基因和转化体特异性序列拷贝数的TT51-1转化体基因组DNA。3.1.7
微反应体系tinyreactionsystem将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液充分混匀之后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水液滴或其他微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系。3.1.8
conversionfactor
转换系数
将转化体特异性序列和内参照基因拷贝数之比转换为转基因成分含量（W/W）时所用系数。3.1.9
ffluorescentlytagged probe
荧光标记探针
在5末端和3末端分别连接荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针水解，使报告基团和淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
数字PCR：数字聚合酶链式反应（digitalpolymerasechainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）bp：碱基对（basepair）
NC：阴性对照（negaitivecontrol）NTC：空白对照（notemplatecontrol）PC：阳性对照（positivecontrol）4防污染措施
数字PCR定量检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。5原理
数字PCR（digitalPCR）是在荧光PCR基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板的绝对拷贝数的测定，通过将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液的荧光PCR反应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的大数量（天于10000个）微反应体系，使每个模板独立随机地分配至微反应体系中；所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应之后，根据设定的荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果；依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字PCR反应体系中的模板浓度。
依据样品DNA溶液中的转化体特异性序列（eventspecific sequence）和内参照基因（speciesspecificgene）的模板浓度之比，得到样品中相应的转基因品系含量。6仪器和设备
6.1超纯水发生器（分子生物学级别）。2
6.2分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.3
生物安全柜。
PCR扩增仪。
SN/T4853.1—2017
数字PCR系统：微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其他具有同样功能的仪器。
6.6恒温孵育箱：控温精度士1.0℃。6.7
样品粉碎机：可将大米或稻谷样品磨成60自左右的粉末。核酸定量仪：Nanodrop3ooo或Modulus检测仪或其他核酸定量检测仪。6.9
涡旋振荡仪。
离心机：最大离心加速度大于15000g，并适用0.2mL和1.5mL离心管。移液枪：量程0.5μL~10μL，量程10μ~100μL，量程100μL~1000μL7试剂和材料
除另有规定外，试剂和材料质量应符合GB/T19495.1的要求。7.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。7.2数字PCR顶混液：含有镁离子、dNTPs和具有5-3外切活性的热启动TaqDNA聚合酶的数字PCR专用预混试剂。
7.3引物和探针：SPS基因和TT51-1转化体特异性序列的数字PCR检测引物和探针信息详见表1。7.4
数字PCR微反应体系生成联排管或芯片。96孔荧光定量PCR反应板和封膜。0.2mL和1.5mL离心管。
移液枪头，量程0.5μL～10μL；量程10μL~100μL；量程100μL~1000μL。表1SPS基因和TT51-1转化体特异性序列的引物和探针扩增基因
SPS基因
TT51-1转化
体特异性序列
上游引物
下游引物
上游引物
下游引物
序列（5°-3\）
GAGGTCACCAAGGCTGCCAGTG
GCACTCCTGATTCTTCCAGGCTTC
VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA-BHQ1CTAGAGGATCCCGGACGAGTG
ATGAGTGGTAGCGTCCAGAAGGAAA
FAM-CTGGGGCAGATAAGCAGTAGTGGTGGG-BHQ注1：表中PCR体系中引物/探针的终浓度可根据每合成批次的验证结果进行适当调整。PCR扩增
片段长度
注2：荧光探针的发光基因应与数字PCR仪的荧光通道匹配，通常用5-FAM/3*-BHQ1或5°-VIC/3-BHQ1方式标记。
注3：新合成的引物/探针干粉进行配制时，先将引物/探针贮存管短暂离心，然后开盖加纯水溶解，并稀释至10umol/L后分装，-20℃避光保存。3
SN/T4853.1—2017
实验步骤
8.1抽样
按照GB/T19495.7的规定执行。
8.2样品制备
除另有规定外，样品制备按照GB/T19495.7或SN/T1194的规定执行。将样品适度破碎、均一化，取出至少200g，全部放人样品研磨机中，研磨至60目左右粒度。破碎和研磨过程中应调整设备的操作参数，避免过热并防止样品粘连。8.3核酸提取纯化
8.3.1核酸提取及PCR抑制物的判断除另有规定外，DNA提取纯化及PCR抑制物的判断按照GB/T19495.3中的规定执行称取2份（每份2g）研磨后样品作为测试样，分别提取基因组DNA。8.3.2模板浓度控制
采用PicoGreendsDNA荧光定量试剂盒或其他具有等效结果的仪器/方法测定DNA溶液的浓度，具体操作步骤参照相关仪器/试剂盒说明书。数字PCR体系中的模板数应不高于微反应体系数的5倍。为保证定量结果的准确性，体系中总模板数应不低于400个拷贝。将样品DNA溶液作适度稀释，选择模板浓度在100拷贝/μL～20000拷贝/μL范围内的稀释液分别用于SPS基因拷贝数和转化体特异性序列拷贝数的数字PCR定量检测。8.4数字PCR扩增
数字PCR体系配制
按表2将各组分加入洁净离心管中，充分混匀。表2数字PCR反应体系
2X数字PCR预混液
SPS基因正向引物（10μmol/L)
SPS基因反向引物（10μmol/L）SPS基因荧光标记探针（10μmol/L）DNA模板
dHO（无菌水）
2×数字PCR预混液
TF51-1正向引物（10μmol/L）
内源基因反应体系
外源基因反应体系
终浓度
0.32μmol/L
0.32μmol/L
0.12μmol/L
0.32μmol/L
TT51-1反向引物（10μmol/L）
TT51-1荧光标记探针溶液（10μmol/L）DNA模板
dH,O（无菌水）
表2（续）
外源基因反应体系
SN/T4853.1—2017
终浓度
0.32μmol/L
0.2μmol/L
注：数字PCR反应体系的总体积可根据不同厂家型号的数字PCR仪作相应调整。PCR体系配制及转移时尽量避免产生气泡。
8.4.2微反应体系生成、数字PCR扩增及结果读取根据仪器要求，将配制好的数字PCR反应混合液，加人微反应体系生成装置的加样孔中，按仪器操作说明生成微反应体系。将微反应体系放置于PCR扩增仪中，按以下参数进行PCR扩增：95℃，5min（1℃/s），1个循环，94℃155.60℃，1min1℃/s），50个循环，98℃10min（1℃/s），1个循环；12℃保存反应产物。对微反应体系进行荧光检测.记录阳性和阴性微反应体系数量及其比值。根据比值分别计算数字PCR反应体系中的SPS基因拷贝数（copies/ul）和TT51-1转化体特异性序列拷贝数(copies/μL)。
注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当地调整。9检测质量控制
9.1对照设置
阴性对照（NC）、空白对照（NTC）和阳性对照（PC)的设置如下：a)
NC：采用非转基因大米的基因组DNA作为数字PCR反应模板；NTC：采用水作为数字PCR反应模板；b）
PC：采用质控样品的基因组DNA作为数字PCR反应模板。每个测试样和PC的SPS基因或TT51-1转化体特异性序列的数字PCR应设置至少3个平行，且3个平行实验结果的相对标准偏差应不高于20%。9.2检测结果有效性判定
以下结果中若有一项不符合，则样品检测结果无效，应查找原因并重做试验：NC和NTC的TT51-1转化体特异性检测无阳性扩增：a)
PC的SPS基因或TT51-1转化体特异性序列检测有阳性扩增；b）
PC的定量结果与已知值相符。
10结果计算
数字PCR仪运行后经软件计算得出每个测试样的SPS基因拷贝数和TT51-1转化体特异性序列拷贝数，取3个平行试验的均值，按照式（1)计算测试样的转基因成分含量：5
SN/T4853.1—2017
式中：
CXD×100%
A转基因大米品系TT51-1的含量，%；B
TT51-1转化体特异性序列拷贝数；C大米内参照基因SPS拷贝数：bzxz.net
D转换系数。
注：不同的大米或水稻样品有不同的转换系数，具体为：市售杂交稻种样品（F1代）的转换系数为0.33，市售杂交霜谷和大米样品（F2代）的转换系数为0.50。10.2如两个测试样的TT51-1品系含量的相对相差大于或等于35%，则测试结果应放弃，并应重做样品制备及后续试验。相对相差的计算参照GB/T19495.5中的规定执行。10.3如两个测试样的TT51-1品系含量的相对相差小于35%，则样品的定量检测结果等于两个测试样转基因大米品系TT51-1成分含量的平均值。11
结果表述
定量检测结果有四种情况，每种检测结果的表述如表3所示。表3结果表述
检测结果
未检出SPS基因
检出SPS基因，但未检出TT51-1转化体特异性序列
检出SPS基因和TT51-1转化体特异性序列，但其含量小于定量方法检测低限
检出SPS基因和TT51-1转化体特异性序列，其含量大于定量方法检测低限
未检出大米成分
结果表述
未检出转基因大米TT51-1品系成分检出转基因大米TT51-1品系成分，但含量低于本定量方法的LOQ(0.1%)
检出转基因大米TT51-1品系成分，含量为X%附录A
（资料性附录）
转基因大米TT51-1转化体特异性序列SN/T4853.1-2017
转基因大米TT51-1转化体特异性序列为CTAGAGGATCCCGGACGAGTGCTGGGGCAGATAAGCAGTAGTGGTGGGGCTACGAACATATTCCTTTTCCTTCTGGACGCTACCACTCAT。注：阴影部分为转基因大米品系TT51-1外源基因序列，带下划线部分为水稻基因组序列。SN/T4853.1-2017
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
转基因大米定量检测数字PCR法
第1部分：TT51-1品系
SN/T4853.1-2017
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
印张0.75
5字数16千字
2018年5月第一版2018年5月第一次印刷印数1-500
书号：155066·2-33311定价16.00元8
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