SN/T 4849.6-2017.Identification of the ingredients of common small berry fruits in food and juice for export-Real-time PCR method-Part 6:Kiwi.
1范围
SN/T 4849.6规定了出口食品及饮料中猕猴桃成分的检测方法实时荧光 PCR法。
SN/T 4849.6适用于鲜果、冷冻果、蜜饯,鲜榨果汁、果肉型果汁、果干，果酱等以猕猴桃为原辅料的初加工食品及饮料中猕猴桃成分的定性检测(清汁及果酒除外)。本部分所规定方法的最低检出限(LOD)为1%(体积比)。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403- 2008 实验室质 量控制规范食品分子生物学检测
3术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1小桨果smaii berry fruits
浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成。小浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果。
3.1.2 猕猴桃kiwi
藤黄目猕猴桃科猕猴桃属植物果实,果形一般为椭圆状,内部为绿色(或红色)果肉和一排黑色或者红色的种子。拉丁文名:Actinidia Chinensis.

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4849.6—2017
出口食品及饮料中常见小浆果成分的实时荧光PCR法
检测方法
第6部分：猕猴桃
Identification of the ingredients of common small berry fruitsinfoodandjuiceforexport-Real-timePCRmethodPart 6:Kiwi
2017-07-21发布
2018-03-01实施
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
SN/T4849.6—2017
SN/T4849《出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法》系列标准共分为6部分：
第1部分：蓝莓；
第2部分：树莓；
第3部分：黑加仑：
第4部分：桑甚；
第5部分：蔓越莓和蓝莓；
第6部分：猕猴桃
本部分为SN/T4849的第6部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院本部分主要起草人：陈颖、邓婷婷、黄文胜、吴亚君、杨艳歌、刘鸣畅、韩建勋、张九凯、王斌。I
1范围
出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法
第6部分：猕猴桃
SN/T4849.6—2017
SN/T4849的本部分规定了出口食品及饮料中猕猴桃成分的检测方法实时荧光PCR法。本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜伐、鲜榨果汁、果肉型果汁、果干、果酱等以猕猴桃为原辅料的初加工食品及饮料中猕猴桃成分的定性检测（清汁及果酒除外）。本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为1%（体积比）。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
小浆果smaiiberryfruits
浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成。小浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果3.1.2
猕猴桃kiwi
藤黄自猕猴桃科猕猴桃属植物果实，果形一般为圆状，内部为绿色（或红色）果肉和一排黑色或者红色的种子。拉丁文名：ActinidiaChinensis。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）。PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）。Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）。dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）。dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）。1
SN/T4849.6—2017
dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）。dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）。UNG：尿嘧啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase）。CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）。Tris：三羟甲基氨基甲烷［Tris（Hydroxymethyl)aminomethane]。EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid)。Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus）。OD：光度密度（opticaldensity）。4方法提要
果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA，果干、果酱、蜜钱先用蒸馏水清洗再提取DNA。以猕猴桃果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。使用特异性引物探针进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在猕猴桃成分。5试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
5.1检测用引物和探针：猕猴桃成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1。猕猴桃引物扩增的靶标序列参见附录A。表1猕猴桃序列引物探针
物种名称
内参照
猕猴桃
引物/探针序列（5-+3'）
F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACARAGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA
PFAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1F.GCCCCATGGGTGACACTCT
R:AAGTTCCTTGACGCGTTTCG
P.FAM-CCGGTCAAACAACGAACCCCGG-BHQI5.2三氯甲烷（氯仿）。
5.3异丙醇。
扩增片
段长度
靶基因
NADH dehydrogenase
subunitB(ndhB)gene
Internal Transcribed
Spacer(ITS)gene
5.4CTAB提取缓冲液.20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNEDTApH8.0。
5.5CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。5.670%乙醇（体积分数）。
5.7蛋白酶K（20mg/mL）。
5.8实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U2U（Unit，酶学单位）的Tag酶、1×PCRbuffer、2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg2+、0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A,C,G)TPs.0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料。2
SN/T4849.6—2017
5.910XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4)200mmol/LKCl,15mmol/LMgClz。6仪器设备
实时荧光PCR仪。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3
恒温水浴锅。
离心机：最大离心力不小于12000g。6.5
微量移液器：0.5μL10μL，10μL~100，20μL200μl200μL~1000μL。粉碎装置。
涡旋震荡器。
pH计。
量筒：容量50mL。
烘箱。
检测步骤
样品前处理
鲜果、冷冻果样品直接粉碎，6000r/min离心，取沉淀物部分。果干、果酱、蜜钱类样品先用蒸馏水清洗3次，再粉碎。果汁样品取适量15000r/min离心30min，取沉淀部分。7.2DNA提取
取粉碎后的样品50mg~200mg，加入1mL裂解液，同时加人0.01倍体积的20mg/mL蛋白酶K，65C温育1h～2h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量CTAB提取缓冲液；取出后12000r/min离心10min，转移上清至2mL离心管中，加入0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，12000r/min转速下离心10min；转移上清至另一灭菌的离心管中，再加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min离心10min；转移上清至干净离心管中，加人等体积的CTAB沉淀液混勾，室温沉淀1h；弃上清，加人350μL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀：加人0.8倍体积的异丙醇或2倍体积一20℃冰箱中预冷的无水乙醇混匀，一20℃放置30min，12000r/min4℃离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。加人5μL~100μL双蒸水，室温10min，混匀，-20℃保存。上述模板DNA均可用等效DNA提取试剂盒提取。3DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A25和A280。DNA的浓度按照式（1)计算：
C=AXN×50/1000
式中：
C—DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）；A——260nm处的吸光值；
核酸稀释倍数。
...(1)
SN/T4849.6-2017
当A260/Az8o比值在1.7～2.0之间时，适宜于PCR扩增。7.4实时荧光PCR扩增
1每个试样PCR反应应设置3个重复。7.4.1
实时荧光PCR反应体系见表2。
表2实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应混合液
正向引物（10μmol/L）wwW.bzxz.Net
反向引物（10μmol/L）
探针（10μmol/L）
DNA模板（5ng/μL）
灭菌ddH.o
7.4.3实时荧光PCR反应程序按如下条件进行。50℃2min；95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。
7.5对照反应
7.5.1所有试样均应同时设置平行的内参照检测与桑甚特异性检测，各体系中除引物探针外，其余组分及反应条件均与7.4一致。
7.5.2在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照，各对照反应体系中，除模板外，其余组分及反应条件应与7.4一致。8质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a）空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0。b)
阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0。c)
阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值≤30.0。9结果判断与表述
9.1结果判定
在符合第8章的情况下，结果判定如下：a）Ct值≤35，则判定为阳性。
b）359.2结果表述
9.2.1内参照阴性，目标成分阴性，表述为“未提取到植物DNA组分”。2内参照阳性，目标成分阳性，表述为“检出猕猴桃成分”。9.2.2
3内参照阳性，目标成分阴性，表述为“未检出猕猴桃成分”。9.2.3
检测过程中防止交叉污染的措施SN/T4849.6—2017
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。SN/T4849.6—2017
附录A
（资料性附录）
猕猴桃ITS基因扩增靶标参考序列（Genebank：KC519784.1）猕猴桃ITS基因扩增靶标参考序列（Genebank：KC519784.1）为GCCCCATGGGTGACACTCTCATTCCCCGGTCAAACAACGAACCCCGGCGCGAAACGCGTCAAGGAACTT。
SN/T4849.6-2017
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法
第6部分：弥猴桃
SN/T4849.6—2017
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）68533533
网址spe.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张0.75
字数14于字
2018年5月第一版 2018年5月第一次印刷印数1-500
书号：155066·2-33299
定价16.00元
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