SN/T 4891-2017.Determination of Spirotetramat residue in fostuffs for export-HPLC and LC-MS/MS method.
1范围
SN/T 4891规定了出口食品中螺虫乙酯及其代谢物残留量的液相色谱质谱/质谱测定方法和出口食品中螺虫乙酯残留量的高效液相色谱测定方法。
SN/T 4891液相色谱质谱/质谱法适用于猪肉、猪肝、猪脂肪、牛奶、鸡蛋、蜂蜜、大豆、小麦、白菜、荔枝和葡萄干等出口食品中螺虫乙酯及其代谢物残留量的定量测定和确证;高效液相色谱法适用于大豆、小麦、白菜、荔枝和葡萄干等出口食品中螺虫乙酯残留量的定量测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
试样用乙腈提取,提取液经浓缩、定容后用正已烷液液萃取净化，用液相色谱-质谱/质谱测定,外标法定量和确证。
4试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯,水为符合GB/T 6682规定的一级水。
4.1乙腈: 色谱纯。
4.2 正己烷:色谱纯。
4.3 甲酸:色谱纯。
4.4乙酸铵 :色谱纯。
4.5无水硫酸镁:分析纯。
4.6无水乙 酸钠:分析纯。
4.7 50% 乙腈:乙腈-水(50+50,体积比)。
4.8 2 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸):称取0.154 g乙酸铵(4.4),用950 mL水溶解,加人1.0 mL甲酸(4.3),用水稀释至1 000 mL。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4891—2017
出口食品中螺虫乙酯残留量的测定高效液相色谱和液相色谱-质谱/质谱法Determination of Spirotetramat residue in foodstuffs for export-HPLC andLC-MS/MSmethod
2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。SN/T4891—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、中华人民共和国万州出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：唐柏彬、夏明星、李光满、都存显、曹淑瑞、郑小玲、张雷、李贤良、王国民。1范围
出口食品中螺虫乙酯残留量的测定高效液相色谱和液相色谱-质谱/质谱法SN/T4891-2017
本标准规定了出口食品中螺虫乙酯及其代谢物残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法和出口食品中螺虫乙酯残留量的高效液相色谱测定方法。本标准液相色谱-质谱/质谱法适用于猪肉、猪肝、猪脂肪、牛奶、鸡蛋、蜂蜜、大豆、小麦、白菜、荔枝和葡萄干等出口食品中螺虫乙酯及其代谢物残留量的定量测定和确证：高效液相色谱法适用于大豆小麦、白菜、荔枝和葡萄干等出口食品中螺虫乙酯残留量的定量测定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法第一法液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS法）3方法提要
试样用乙睛提取，提取液经浓缩、定容后用正已烷液液萃取净化，用液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量和确证。
4试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1乙睛：色谱纯。
4.2正已烷：色谱纯。
甲酸：色谱纯。
乙酸铵：色谱纯。
无水硫酸镁：分析纯。
无水乙酸钠：分析纯。
4.750%乙睛：乙-水（50+50，体积比）。4.82mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）：称取0.154g乙酸铵（4.4）.用950mL水溶解，加人1.0mL甲酸（4.3）用水稀释至1000mL。
4.9标准品：螺虫乙酯及其4种代谢物，纯度均大于90%，化合物详细信息参见附录A中表A.1。4.10混合标准储备液（100mg/L）：分别准确称取含螺虫乙酯及其代谢物5mg的标准品，用乙睛（4.1）溶解并定容至50mL，混匀。一18℃以下避光保存。4.11混合标准中间液（1.0pg/mL）：临用前取适量100mg/L混合标准储备液（4.10），用50%乙睛SN/T4891—2017
(4.7)稀释成1.0μg/mL标准中间液。4.12混合标准工作液：临用前取适量1.0#g/mL标准中间液（4.11），用50%乙睛稀释至0.5ng/mL、1.0ng/mL.2.0ng/mL.5.0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL和50ng/mL标准工作液。4.13微孔滤膜：尼龙66或相当者，0.22um。5仪器和设备
5.1液相色谱-质谱/质谱仪：配电喷雾离子源（ESI)。5.2分析天平：感量为0.01g和0.1mg。5.3均质器，20000r/min。
5.4旋涡混合器。
5.5离心机：10000r/min。
5.6组织捣碎机
5.7氮吹浓缩仪。
3超声波清洗器。
6试样的制备与保存
6.1荔枝、白菜、猪肉、猪肝、鸡蛋取有代表性样品约500g，荔枝去皮去核，猪肉、猪肝去脂肪，鸡蛋去壳后，用高速勾浆机绞碎，装人洁净容器，密闭并标明标记，于一18℃保存。6.2大豆、小麦
取整粒有代表性样品约500g，用高速粉碎机粉碎，装人洁净容器，密闭并标明标记，于阴凉干燥处保存。
6.3葡萄干
取有代表性样品约500g，加人等量水，密封浸泡过夜，用高速勾浆机绞碎，装人洁净容器，密闭并标明标记，于一18℃保存。
6.4牛奶、蜂蜜
取有代表性样品约500mL，混合均匀，装人洁净容器，密闭并标明标记，于4℃保存。猪脂肪
取有代表性样品约500g，加热熬制，弃去油渣，冷却后装人洁净容器，密闭并标明标记，于4℃保存。在制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化7样品处理
7.1提取
7.1.1荔枝、白菜、葡萄干
准确称取10g（精确至0.01g，葡萄干样品相当于5g样品）样品，置于50mL离心管中，加人SN/T4891—2017
20mL乙睛（4.1），20000r/min均质提取3min，加人6.0g无水硫酸镁（4.5），1.0g无水乙酸钠（4.6），混勾，静置2min，7000r/min离心3min，将上清液转移至50mL比色管中。用20mL乙睛清洗均质器刀头，将清洗液转移至残渣中，并将残渣捣碎，置于超声波中超声提取30min（每隔10min取出振摇一次），7000r/min离心3min，合并提取液至50mL比色管中并用乙睛定容至刻度，混匀后待净化。7.1.2大豆、小麦
准确称取5g（精确至0.01g）样品，置于50mL离心管中，加人8mL水，混勾，静置30min，接下来按照7.1.1中“加人20mL乙睛*”的步骤进行。7.1.3鸡蛋、牛奶
准确称取10g（精确至0.01g）样品，置于50mL离心管中，加人20mL乙睛，置于超声波中超声提取30min（每隔10min取出振播摇一次），取出，接下来按照7.1.1中“加人6.0g无水硫酸镁**.”的步骤进行。
7.1.4蜂蜜
准确称取10g（精确至0.01g）样品，置于50mL离心管中，加人10mL水，混匀，加人20mL乙睛，涡旋混合提取2min，7000r/min离心3min，将上清液转移至50mL比色管中，样品再用20mL乙睛涡旋提取一次，合并提取液至50mL比色管中并用乙睛定容至刻度，混后待净化。7.1.5猪脂肪
准确称取10g（精确至0.01g）样品，置于50mL离心管中，加人10mL正已烷（4.2），混勾，加人20mL乙腈，涡旋混合提取2min，7000r/min离心3min，将下层溶液转移至50mL比色管中，样品再用20mL乙腈涡旋提取一次，合并提取液至50mL比色管中并用乙睛定容至刻度，混勾后待净化。7.2净化
荔枝、白菜、鸡蛋、牛奶和蜂蜜样液移取5.00mL待净化液，葡萄干、大豆和小麦样液移取10.00mL待净化液于试管中，于40℃水浴氮气吹干，加入1.00mL50%乙睛（4.7）溶解残渣，加入1mL正已烷，涡旋混合30s，4000r/min离心3min，取下层溶液过微孔滤膜（4.13），用液相色谱-质谱/质谱仪测定。7.3基质标准工作溶液的制备
取空白样品，按7.1和7.2操作至“于40℃水浴氮气吹干”，加人1.00mL标准工作液（4.12）溶解残渣”，加人1mL正已烷，涡旋混合30s，4000r/min离心3min，取下层溶液过微孔滤膜，用液相色谱-质谱/质谱仪测定。
7.4测定
7.4.1液相色谱-质谱/质谱条件
液相色谱-质谱/质谱条件如下：a）
色谱柱：Cls柱，100mm（柱长）×2.1mm（内径），粒度1.7μm，或相当者：b）
流动相：乙睛（A）-2mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）（4.8），梯度洗脱程序见表1流速：0.3mL/min;
柱温：40℃；
进样量：5pL
SN/T 4891—2017
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子；
检测方式：多反应监测（MRM)：h）
质谱/质谱参考条件参见附录B。表1流动相梯度洗脱程序
梯度时间/min
注：柱前平衡2mine
7.4.2定性测定
流动相A/%
流动相B/%
按照7.4.1仪器条件测定基质标准工作溶液和样液，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液的保留时间偏差在土2.5%之内：且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
表2定性确证时相对离子丰度的最大充许偏差相对离子丰度/%
允许的相对偏差/%
7.4.3定量测定
>20~50
>10~20
在仪器最佳工作条件下，对基质标准工作溶和样液进行测定，外标法定量，样液中待分析物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，若超出线性范围应适当稀释，同时用相同稀释倍数的基质标准工作溶进行定量。在上述色谱条件下，螺虫乙酯及其代谢物的色谱峰保留时间分别为BYI08330-enol-glucoside:2.50min,BYI08330-mono-hydroxy:2.93min,BY108330-cis-enol:3.05min,BYI0-8330-cisketo-hydroxy：3.12min，螺虫乙酯：3.43min。标准溶液多反应监测（MRM）色谱图参见附录C中图c.1。
8空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。9结果计算与表述
9.1用色谱数据处理机或按照式(1)计算样品中螺虫乙酯及其代谢物的残留量。4
式中：
(c-c)×V2
试样中待测物的含量，单位为微克每于克（ug/kg）：试样浴液中待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）：空白试验溶液中待测物的浓度，单位为纳克每毫升（g/mL）：移取提取液体积，单位为毫升（mL)；测定用样液定容体积，单位为毫升（mL)；试样质量，单位为克（g）。
9.2按照式（2）计算样品中螺虫乙酯及其代谢物总量（以螺虫乙酯计）的残留量。SN/T4891—2017
X=XBYI+XgluX0.8057+XmonoX1.231+XenolX1.239+XketoX1.177（2）
式中：
X enol
X keteo
试样中螺虫乙酯及其代谢物总量（以螺虫乙酯计）的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；试样中螺虫乙酯的含量，单位为微克每于克（μg/kg）：试样中BYI08330-enol-glucoside的含量，单位为微克每千克（μg/kg）：试样中BYI08330-mono-hydroxy的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；试样中BYI08330-cis-enol的含量，单位为微克每千克（μg/kg）：试样中BYI0-8330-cis-keto-hydroxy的含量，单位为微克每千克（μg/kg）。10测定低限（LOQ）
猪肉、猪肝、猪脂肪、牛奶、鸡蛋、蜂蜜、大豆、小麦、白菜、荔枝和葡萄干样品中螺虫乙酯及其代谢物的测定低限均为1.0ug/kg。
11回收率
不同样品基质中螺虫乙酯及其代谢物的回收率试验数据参见附录D中表D.1。第二法高效液相色谱法（HPLC）12方法提要
试样用乙睛提取，提取液经浓缩，残渣再用乙酸乙酯溶解后用碱性氧化铝柱净化，净化洗脱液浓缩定容，用高效液相色谱测定，外标法定量。13
试剂和材料
除特殊注明外，所有试剂和材料同4.1，4.2，4.5~～4.7，4.13。13.1乙酸乙酯：色谱纯
13.260%乙：乙腈-水（60+40，体积比）。13.3标准品：螺虫乙酯标准品，纯度大于90%，化合物详细信息参见附录A中表A.1。5
SN/T4891—2017
13.4标准储备液（500mg/L）：准确称取含10mg螺虫乙酯的标准品，用乙溶解并定容至20mL，混匀。一18℃以下避光保存。
13.5标准工作液：临用前取适量500mg/L标准储备液（13.4），用50%乙睛（4.7）稀释至0.21μg/mL、0.5μg/mL、1.0#g/mL、2.0μg/mL.5.0μg/mL.10#g/mL.20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL标准工作液。
13.6碱性氧化铝固相萃取柱：1g，3mL，临用前用10mL乙酸乙酯活化。14仪器和设备
除特殊注明外，所有设备同5.2～5.8。14.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。14.2旋转蒸发仪。
15试样的制备与保存
荔枝、白菜、葡萄干、大豆和小麦样品的制备与保存同第6章中所述16样品处理
16.1样品提取
荔枝、白菜、葡萄干
准确称取10g（精确至0.01g，葡萄干样品相当于5g样品）样品，置于50mL离心管中，准确加人20mL乙腈，20000r/min均质提取3min，加人6.0g无水硫酸镁，1.0g无水乙酸钠，混勾，静置2min7000r/min离心3min。准确吸取10mL提取液于试管中，于40℃水浴氮气吹干，加入2mL乙酸乙酯（13.1）超声落解残渣，4000r/min离心3min，上清液待净化16.1.2大豆、小麦
准确称取5g（精确至0.01g）样品，置于50mL离心管中，加人8mL水，混匀，静置30min，接下来按照16.1.1中“准确加人20mL乙睛”的步骤进行。16.2样品净化
将样品待净化液转移碱性氧化铝柱（13.6），收集流出液于100mL旋蒸瓶中，残渣再用2mL乙酸乙酯洗涤两次，离心，上清液转移上柱，再用25mL乙酸乙酯淋洗固相萃取柱并收集洗脱液，洗脱液于40C水浴减压浓缩至约2mL，小心转移至10mL试管中，用5mL乙酸乙酯少量多次洗涤旋蒸瓶并转移洗涤液至试管中，于40℃水浴氮气吹干，用50%乙腈（荔枝、白菜样品加人1.00mL，葡萄干、大豆和小麦样品加人0.50mL）超声溶解残渣，加人0.5mL正已烷，涡旋混合30s，4000r/min离心3min，取下层溶液过微孔滤膜，用液相色谱测定。16.3测定
16.3.1液相色谱参考条件
色谱柱：C柱，250mm（柱长）×4.6mm（内径），粒度5μm，或相当者；a）
b）流动相：乙睛-水（60+40.体积比）（13.2）；流速：1.0mL/min
柱温：30℃：
进样量：20μL
f）波长：225nm。
16.3.2液相色谱测定
SN/T 4891—2017
按16.3.1液相色谱条件测定标准工作液和样液，以外标法测定样液中螺虫乙酯的含量。如果样品中螺虫乙酯的含量超出标准曲线范围，应用流动相稀释后再进行分析。在上述色谱条件下，螺虫乙酯色谱峰保留时间约为：5.79min。螺虫乙酯的标准色谱图见附录C中图C.2。空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。18结果计算
用色谱数据处理机或按照式（3）计算样品中螺虫乙酯的残留量。X
式中：
(c-ca)xV1000
试样中螺虫乙酯的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；试样溶液中螺虫乙酯的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）)；Co
空白试验溶液中螺虫乙酯的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V—样液定容体积，单位为毫升（mL）m
试样质量，单位为克（g）。
19测定低限
大豆、小麦、白菜、荔枝和葡萄干样品中螺虫乙酯的测定低限均为o.1mg/kg。20回收率
不同样品基质中螺虫乙酯的回收率试验数据见参见附录D中表D.2（3）
SN/T 4891—2017
英文名
Spirotetramat
（BYI08330)
cis-3-(2.5-Dimethylph
enyl)-4-hydroxy-8-
methoxy-1-azaspiro
[4.5]dec-3-en-2-one
(BYI08330-cis-enol)
cis-3-(2,5-Dimethylp
henyl)-8-methoxy-2-
oxo-1-azaspiro
[4.5]dec-3-en-4-y]
β-D-glucopyranoside
(BYI08330-enolglucoside)
cis-3-(2,5-Dimethylp
henyl)-3-hydroxy-8-
methoxy-1-azaspiro
[4.5]decane-2,4-dione
(BYI08330-cis-keto-
hydroxy)
cis-3-(2,5-Dimethylp
henyl)-4-hydroxy-8-
methoxy-1-azaspiro
[4.5]decan-2-one
(BYI08330-mono-
hydroxy)
附录A
（资料性附录）
螺虫乙酯及其代谢物标准品信息螺虫乙酯及其代谢物详细信息
中文名
螺虫乙酯，顺式-3-(2.5-
二甲基苯基)-8-甲氧基
2-氧代-1-氮杂螺［4.5]］
癸-3-烯-4-基碳酸乙酯
顺式-3-（2,5-二甲基
苯基)-4-羟基-8-甲氧
基-1-氨杂螺[4.5]
婴-3-烯-2-酮
顺式-3-(2.5-二甲基
苯基)-8-甲氧基-2-
氧代-1-氮杂螺[4.5]
葵-3-烯-4-基碳酸yl
3-D-葡萄糖
顺式-3-（2,5-二甲基苯
基)-3-羟基-8-甲氧基-1-
氨杂螺［4.5］葵
2,4-二酮
顺式-3-（2,5-二甲基苯
基)-4-羟基-8-甲氧
基-1-氮杂螺［4.5]
葵-2-酮
CAS号
203313-25-1
分子式
CaiHaNOs
203312-38-3
ChHzsNOa
1172614-86-6C.HNOg
1172134-11-0|ChH2aNO.
1172134-12-1Cl.H25NO
相对分
子质量
结构式
质谱参考条件：
电喷雾电压（IS）：5500V；
离子源温度（TEM）：550℃：
附录B
（资料性附录）
参考质谱条件1
气帘气压力（CUR）：0.3MPa（45psi）；雾化气压力（GS1)：0.5MPa（70psi）：d)
辅助气压力（GS2）：0.45MPa（65psi）：碰撞室人口电压（EP)：10V；
去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）和碰撞室出口电压（CXP)见表B.1；驻留时间：30ms。
SN/T4891—2017
待测物母离子、子离子、去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）和碰撞室出口电压（CXP）表B.1
化合物
螺虫乙酯
BYI08330 enol-glucoside
BYI08330-mono-hydroxy
BYI08330-cis-enol
BYI0-8330-cis-
keto-hydroxy
注：“*”为定量离子。
母离子（m/=）
子离子
去旗电压（DP）
孔电压/VbZxz.net
碰撞电压（CE)
碰撞室出口电压
(CXP)/V
1）非商业性声明：附录B所列参考质谱条件是在ABAPI4000QTRAP型液质联用仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅为提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器。9
SN/T48912017
irmemi
附录C
（资料性附录）
色谱图
Tememin
HSOSEN
Lupemi
3035045
螺虫乙酯及其代谢物标准品多反应监测（MRM）色谱图（10ng/mL）mAU
螺虫乙酯标准溶液液相色谱图（1.0μg/mL）min
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